CC BY
48
experimental gastroenterolog
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕГРАДАЦИИ ГЛИПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ (PGP И GPGPGP) ПОД ДЕЙСТВИЕМ АГРЕССИВНЫХ ФАКТОРОВ IN VITRO
Труфанова А. В.1, Самонина Г. Е.1, Золотарев Ю. А.2, Шевченко К. В.2
1 Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова
2 Институт молекулярной генетики РАН
Золотарев Ю. А. E-mail: img@img.ras.ru
РЕЗЮМЕ
Нами было показано, что PGP, так же как и GPGPGP, остаются стабильными даже после 24-часовой инкубации пептида в протеолитической среде (как в желудочном соке лошади или крысы, так и в растворе соляной кислоты и в растворе пепсина в соляной кислоте) in vitro. Появление метаболитов PGP — PG и GP, обнаруживаемых в тканях желудка, возможно, связано с действием пептидаз ткани и крови. Таким образом, эффекты пептидов PGP и GPGPGP обусловлены влиянием как самих пептидов, так и их метаболитов, что согласуется с результатами, полученными ранее. Ключевые слова: глипролины; пептиды; деградация; желудочный сок.
SUMMARY
PGP, as well as GPGPGP remain stable after 24-hour incubation in a proteolytic environment (in vitro), like equine and rat gastric juice, hydrochloric acid and pepsin in the solution of hydrochloric acid. Perhaps the appearance of PGP's metabolites — PG and GP, that found in the stomachic tissues, is associated with the action of tissue and blood peptidases. Thus, the effects of PGP and GPGPGP cause by the influences both of the peptides and their metabolites, that agree with previously results. Keywords: glyproline; peptide; degradation; gastric juice.
ВВЕДЕНИЕ
Глипролины, объединенные в новое семейство ре-гуляторных пептидов, являются интересным объектом изучения многих исследовательских групп в связи с их широким спектром биологической активности [1]. Так, глипролины проявляют протекторное и лечебное противоязвенное действие по отношению к слизистой оболочки желудка (СОЖ). Антиульцерогенные эффекты глипролинов могут быть связаны с подавлением базальной и стимулированной секреции соляной кислоты и увеличением бикарбонатной секреции в желудке [2], стабилизацией секреции тучных клеток и нормализацией кровотока [3; 4]. Рго-Gly-Pro и его метаболит Gly-Pro эффективно защищают слизистую оболочку желудка крыс от эрозивно-язвенных поражений, вызванных методом иммобилизационного водо-иммерсионного стресса, восстанавливая при этом оксидантно-антиоксидантный баланс общей фракции клеток СОЖ крыс [5]. Кроме того, глипролины
снижают воспаление [4; 6] в зоне повреждения СОЖ [7]; свой вклад в противоязвенные свойства пептидов вносят также их анальгезирующее действие [8; 9] и способность нормализовать поведение, измененное стрессорным воздействием [10].
Наиболее изученными в свете гастропротек-торных эффектов являются ProGlyPro (PGP) и его пептидные метаболиты ProGly (PG) и GlyPro (GP), а также гексапептид GlyProGlyProGlyPro (GPGPGP), причем PGP и GPGPGP обладают наибольшим противоязвенным эффектом [1; 11] как при местном, так и при системном действии. Интересно, что PG оказывает противоязвенное действие на тех моделях язвообразования, патогенез которых обусловлен периферическими механизмами; GP действует через центральные механизмы, a PGP и GPGPGP — как через центральные, так и через периферические [12; 13].
Способность PGP оказывать противоязвенное действие на всех моделях язвообразования (этано-ловой, стрессорной, ацетатной, индометациновой, вызванного перевязкой пилоруса или введением
m
1-Л
вещества 48/80), возможно, обусловлена как самим
^ пептидом, так и его метаболитами, обнаруживае-
S мыми в тканях желудка, среди которых основным
^ является GP, a PG образуется примерно в 4 раза
1 меньше, чем PG [14]. Обнаруживаемые метаболиты
=■= детектируются в тканях желудка уже через 3 минуты
¡! после введения PGP как перорально, так и при других
i способах введения — внутрибрюшинном, внутри-
^ =j венном, интраназальном. Именно поэтому представ-
i § лялось интересным выяснить возможные влияния
s i пептидаз желудочного сока на данные пептиды.
ÜÜ I МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
* Анализ проб желудочного сока, содержащего ProGlyPro и GPGPGP, проводили на хроматографе «Милихром А-02», на колонке ProntoSIL-120-5-C18 - В AQ DB-2003 (2 х 75 мм, 5 мкм), градиент элюента В (ме-~ танол) в А (0,2 М LiClCA + 0,005 М НС1О4). Градиент
m 4
° проводили, увеличивая концентрацию метанола
с 5 до 100% в элюенте А в течение 12 мин. Скорость подачи элюента 200 мкл/мин. Чувствительность УФ-детектора данного прибора составляет 0,0001 о. е. Времена удерживания ProGly — 1,71 мин, GlyPro — 1,98 мин., PGP — 4,00 мин, GPG — 6,90 мин, PGPG — 3,72 мин, GPGP — 4,32 мин, PGPGP — 4,67 мин, GPGPGP — 4,87 мин, GPGPGP — 5,03 мин.
Анализ проб, полученных с использованием меченного тритием PGP (с молярной радиоактивностью 6 Ки/ммоль), синтезированного в ИМГ РАН, проводили на хроматографе, состоящем из приборов фирм Gilson и Shimadzu, на колонке Supercosil ABZ + Plus (4,6 х 250 мм, 5 мкм), в градиенте элюента В (метанол) в А ((ЫНлНгРОч+НзРСч (50 гаМ, рН 2,8)). Градиент проводили, увеличивая концентрацию метанола с 0 до 27% в элюенте А в течение 12 мин. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Для анализа использовались проточный радиодетектор и жидкий сцинтиллятор Ecolite (MP Bio, США). Типовое значение фона составляло 0,01 мкКи. Достоверные данные из кривых по радиоактивности ProGlyPro получали при радиоактивности анализируемой пробы 0,2-0,3 мкКи. Времена удерживания ProGly — 3,09 мин, GlyPro — 3,34 мин, ProGlyPro — 5,03 мин.
Для приема и обработки хроматографических данных использовалась система «МультиХром» (ООО «Амперсенд», Россия) на базе IBM PC/AT. Радиоактивность измеряли на проточном сцин-тилляционном счетчике, входящем в состав хро-матографического комплекса.
Масс-спектрометрический анализ смесей осуществлялся на масс-спектрометре TCQ Advantage МАХ («Термоэлектрон», США). Чувствительность для PGP составляет 10 нг.
Для проведения эксперимента использовались водный раствор PGP (1 мг/мл), водный раствор GPGPGP (1 мг/мл), водный раствор [3H] PGP (2,8 I мКи/мл). К 9 мл желудочного сока лошади (НПО «Микроген») добавляли рассчитанное количество _LI водного раствора PGP (0,01, 0,02. 0,037 и 0,37 мкмоль
на 1 мл желудочного сока лошади/раствора соляной кислоты/раствора пепсина в соляной кислоте), GPGPGP (0,01, 0,02, 0,037 и 0,37 мкмоль на 1 мл желудочного сока лошади/раствора соляной кислоты/ раствора пепсина в соляной кислоте) при температуре 37°. Через определенные промежутки времени (0,5, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20 и 40 мин) отбирали аликвоту (1 мл) и обрабатывали ее 1-М раствором КОН до рН 7. Полученные пробы упаривали, растворяли в 200 мкл смеси метанол — вода (1:1), наносили на патрон, содержащий 50 мг обращенной фазы LiChrosorb С18, которая предварительно была промыта 1 мл метанола и уравновешена 1 мл смеси метанол — вода (1:1). Пептиды элюировали с патрона 2 мл смеси метанол — вода (1:1). Затем экстракты упаривали, растворяли в 200 мкл смеси метанол — вода (10:90) и анализировали методом ВЭЖХ. Перед анализом методом ВЭЖХ пробы растворяли в 200 мкл метанола.
При изучении деградации PGP в желудочном соке крыс, полученном нами путем перевязки пило-руса у беспородных самцов крыс, на 1 мл желудочного сока добавляли 214,4 мкг PGP (500 мкКи). Через определенные промежутки времени отбирали 20 мкл пробы, в которую добавляли 200 мкл 90%-ного ацетонитрила, содержащего 1% трифторуксусной кислоты. Смесь, центрифугировали при 30 мин при 8000 об /мин. Отбирали супернатант и высушивали его в роторном испарителе при пониженном давлении, затем добавляли заранее рассчитанную смесь стандартов, содержащих PGP, GP и PG. Концентрацию исследуемого пептида и продуктов его биодеградации рассчитывали с использованием жидкостного сцинтилляционного счета.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ
Пептиды PGP и GPGPGP были исследованы в концентрации, обладающей наибольшим терапевтическим эффектом, то есть 3,7 мкмоль/кг. Нами было показано, что in vitro количество пептидов остается неизменным через 0,5; 2,5; 5; 10; 15; 20 и даже через 40 минут после начала инкубации при 37 °С как в желудочном соке лошади, так и в растворе соляной кислоты и в растворе пепсина в соляной кислоте. При исследовании влияния желудочного сока на стабильность PGP было установлено, что через 40 минут в пробе обнаруживается PGP в среднем 85,64 ± 2,8% первоначального количества. Количество PGP, оставшееся в пробе при действии раствора пепсина в соляной кислоте, через 40 минут в среднем составило 98,09 ± 0,7% исходной концентрации. С использованием меченого PGP был составлен баланс по радиоактивности, где учитывались возможные потери при проведении реакции, выделении пептида и его анализе. Из полученных данных можно было сделать вывод, о том, что некоторое уменьшение содержания пептида от первоначального через сорок минут, скорее всего,
связано с потерями вещества в ходе эксперимента. Содержание в пробах PGP совсем не уменьшалось под действием 0,25% соляной кислоты, концентрация которой соответствовала содержанию соляной кислоты в желудочном соке. Под действием желудочного сока лошади через 40 минут не изменялось также и содержание в пробе гексапептида GPGPGP.
Масс-спектрометрический анализ содержания PGP или GPGPGP в желудочном соке до и после выдерживания их при 37 °С в течение 40 минут показал, что молекулярных пиков, свидетельствующих о появлении метаболитов исходных пептидов, также не обнаруживается.
Таким образом, можно с уверенностью утверждать, что пептиды PGP и GPGPGP не расщепляются под действием желудочного сока, а появление метаболитов PGP — GP и PG в тканях желудка in vivo, показанное Ашмариным и др. [14], связано с активностью тканевых протеаз и протеаз крови. Не исключено, что данные пептиды из содержимого желудка в неизменном виде проникают в слизистую оболочку, что обеспечивает их высокое противоязвенное действие в довольно низкой концентрации (от 0,37 мкмоль/кг [1; 10]). Последующая деградация пептидов до PG и GP, обладающих собственной антиульцерогенной активностью, опосредуемой через периферические и центральные механизмы соответственно, обеспечивает аддитивные эффекты, то есть собственная активность первоначальных пептидов (PGP и GPGPGP), возможно, суммируется с активностью их метаболитов.
Таким образом, возможно, что высокая стабильность три- и гексапептида играет не последнюю роль в том, что данные глипролины обладают наибольшим противоязвенным эффектом по сравнению с другими пептидами этого ряда, так как их действие обусловлено не только активностью метаболитов, но и свойствами самих пептидов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные нами результаты показали, что пептиды PGP и GPGPGP обладают высокой стабильностью по отношению к агрессивным факторам желудочного сока, что, возможно, обеспечивает их высокую противоязвенную активность.
В первую очередь стабильность пептидов в желудочном соке опосредует низкие действующие концентрации, так как, скорее всего, глипролины проникают в слизистую оболочку желудка в неизменном виде.
Вторым аспектом является то, что последующая деградация исследованных пептидов, вероятно, происходит под действием протеаз крови и клеток слизистой оболочки желудка. Кроме того, вероятно, величина развивающегося эффекта является суммацией ответов непосредственно самих пептидов PGP и GPGPGP и их метаболитов GP и PG, что в итоге приводит к проявлению наиболее высокого ан-тиульцерогенного действия для изученных глипролинов — три- и гексапептида.
Таким образом, проведенная работа по исследованию действия глипролинсодержащих пептидов позволяет говорить, что высокая эффективность PGP и GPGPGP может быть обусловлена их устойчивостью к действию протеаз желудочного сока, что было достоверно показано в условиях in vitro.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 09-04-00669а, программы фундаментальных исследований президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология». Российского фонда фундаментальных исследований, гранта «Научные школы НШ-3626.2005.4» и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МК-2375.2009.4.
Б >
¡2 о
So 1_ ° ОД
oü
Щ о Нв
О ¡D
I- ®
и
га
L Б
га
X
j
га
I-
х ш 2 s а ш с и
V
m
ЛИТЕРАТУРА
1. Самонина Е. Е., Копылова Г. Н., Умарова Б. А. Трипептид Pro-Gly-Pro и гомеостаз слизистой оболочки желудка // Нейрохимия. — 2008. — Т. 25, № 1. — С. 128-131.
2. Жуйкова С. Е., Хронычева Р. П., Золотарев В. А. и др. Новые пептидные регуляторы желудочной секреции крыс (амилин, PGP, семакс) // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. — 2003. — № 2. — С. 86-90.
3. Самонина Г. Е., Копылова Г. Н., Сергеев В. И. и др. Коррекция кровотока желудка как один из возможных механизмов противоязвенных эффектов коротких пролинсодержащих пептидов // Рос. фарм. журн. им. И. М. Сеченова. — 2001. — Т. 87, № 11. — С. 1488-1492.
4. Умарова Б. А., Копылова Г. Н., Лелекова Е. В. и др. Механизм протекторного действия глипролинов при стрессе и воспалении // Нейрохимия. — 2008. — Т. 25, № 1. — С. 119-123.
5. Фалалеева Е. М., Самонина Е. Е., Береговая Т. В. и др. Влияние глипролинов PGP, GP, PG на гомеостаз слизистой оболочки желудка при стрессорной модели язвообразования // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 2010. — Т. 149, № 1. — С. 30-33.
6. Умарова Б. А., Лелекова Т. В., Копылова Е. Н. и др. Стабилизация тучных клеток уменьшает нарушения функций лимфатических сосудов при воспалении // Цитокины и воспаление. — 2009. — Т.
8, № 3. — С 37-40.
7. Труфанова А. В., Багликова К. Е., Бакаева З. В. и др. Гистомор-фологические особенности ускорения заживления ацетатных язв глипролинами // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 2007. — Т. 144, № 8. — С. 226-228.
8. АбрамоваМ. А., СамонинаЕ. Е., Мамедов Г. В., КопыловаЕ. Н. Некоторые механизмы противоязвенного действия одного из про-
стейших пролинсодержащих фрагментов регуляторных пептидов Pro-Gly-Pro // Вестн. Московского ун-та. Сер. 16. Биология. — 1997. — № 2. — С. 7-10.
9. Ашмарин И. П., Каразеева Е. П., Ляпина Л. А., Самонина Е. Е. Ре-гуляторная активность простейших пролинсодержащих пептидов PG, GP, PGP и GPGG и возможные источники их биосинтеза // Биохимия. — 1998. — Т. 63, Вып. 2. — С. 149-155.
10. Копылова Е. Н., Бадмаева С. Е., Левицкая Н. Е. Влияние пептида Pro-Gly-Pro на изменения поведения крыс, вызванные воздействием стрессогенного фактора // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 2004. — Т. 137, № 7. — С. 9.
11. Багликова К. Е., Труфанова А. В., Бакаева З. В. и др. Влияние ги-дроксипролин- и пролинсодержащих глипролинов на этаноловое язвообразование у крыс // Вестн. Московского ун-та. Сер. Биология. — 2009. — № 1. — С. 3.
12. Жуйкова С. Е., Бадмаева К. Е., Бакаева З. В., Самонина Г. Е. Противоязвенные эффекты трипептида PGP и его возможных метаболитов (PG, GP, глицина и пролина) на разных моделях вызова язв у крыс // Изв. АН. Серия биологическая. — 2004. — № 5. — С. 585-588.
13. Жуйкова С. Е.. Бадмаева К. Е., Бакаева З. В., Самонина Г. Е. Противоязвенные эффекты трипептида PGP и его возможных метаболитов — PG и GP, глицина и пролина — на разных моделях вызова язв у крыс //Изв. РАН. Серия биологическая. — 2004. — № 5. — С. 585.
14. Золотарев Ю.А., Жуйкова С.Е., Ашмарин И. П. и др. Метаболизм пептида PGP при разных способах введения // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 2003. — Т. 135, № 4. — С. 423-426.
LO
Wl
