CC BY
28
УДК 612.014
Пептид пролил-глицил-пролин (PGP) препятствует повышению проницаемости кровеносных сосудов при воспалении
Н. С. Бондаренко1*, А. Н. Шнейдерман2, А. А. Гусева3, Б. А. Умарова3 'Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26 2НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина, 115478, Москва, Каширское ш., 24
3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
*E-mail: n.s.bondarenko@gmail.com
Поступила в редакцию 25.01.2016
Принята к печати 28.11.2016
РЕФЕРАТ Изучено влияние трипептида пролил-глицил-пролина (PGP) на проницаемость кровеносных сосудов крыс в условиях воспаления. Установлено, что пептид уменьшает отек лапы крыс, вызванный подкожным введением гистамина, в той же степени, что и классический противовоспалительный препарат ди-клофенак. Однако определение относительного уровня экспрессии гена cox-2 в очаге воспаления с помощью ПЦР в реальном времени показало, что, в отличие от диклофенака, PGP не влиял на экспрессию гена cox-2. Это свидетельствует о различии механизмов их действия. На экспериментальной модели острого перитонита, вызванного внутрибрюшинной инъекцией тиогликолата, показано, что воспалительная реакция сопровождается повышением проницаемости сосудов в тканях желудка и тонкого кишечника. Предварительное (за 30 мин до индукции воспаления) введение PGP предотвращало это повышение, вследствие чего проницаемость сосудов, объем экссудата в перитонеальной полости и количество красителя Evans Blue в нем оставались на уровне контрольных значений. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что в основе противовоспалительного действия PGP лежит его способность предотвращать повышение проницаемости кровеносных сосудов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА пролил-глицил-пролин (PGP), воспаление, проницаемость сосудов, противовоспалительное действие.
ВВЕДЕНИЕ
Большинство патологических процессов, происходящих в организме, сопровождается развитием воспалительной реакции. Для восстановления нарушенных функций организма важно понять роль эндогенных регуляторных систем в этом процессе. Большой интерес вызывают регуляторные пептиды, которые образуются в очаге воспаления в результате деградации белков межклеточного матрикса. К таким пептидам относится трипептид пролил-глицил-пролин (PGP) - типичный представитель семейства глипролинов [1]. К настоящему времени выявлен широкий спектр свойств этого пептида, свидетельствующих о его защитном действии при сопряженных с воспалением нарушениях различных систем организма. В частности, PGP и его метаболиты оказывали протективное и терапевтическое действие на слизистую оболочку желудка
при ульцерогенезе различной этиологии [2], уменьшали количество нейтрофилов в очаге воспаления при перитоните, вызванного внутрибрюшинным введением крысам 1% раствора уксусной кислоты [3]. На модели острого экспериментального перитонита (внутрибрюшинное введение 40% раствора тиогликолата) нами было показано, что пептид обладает выраженным противовоспалительным действием, опосредованным в определенной степени стабилизацией тучных клеток [4, 5]. Тучные клетки - источник многих вазоактивных медиаторов, вызывающих повышение проницаемости эндотелия кровеносных сосудов [6], одного из первых признаков воспалительного ответа [7]. На основании этого мы предположили, что PGP может влиять на проницаемость кровеносных сосудов и, как следствие, на формирование отека при воспалительном ответе. Выяснению этого и посвящена наша работа.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Пептид PGP был синтезирован в Институте молекулярной генетики РАН, Москва.
В работе использовали самцов белых беспородных крыс весом 180-220 г. Эксперименты выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным.
Отек лапы у крыс вызвали подкожным введением 0.2 мг гистамина (Sigma, США) в 0.1 мл физиологического раствора. Толщину и окружность лапы измеряли каждый час в течение 4 ч.
Через 2 ч после индукции воспаления гистами-ном у животных под эфирным наркозом непосредственно из зоны воспаления вырезали образец ткани, который сразу же помещали в раствор RNAlater (Ambion).
РНК из образцов тканей выделяли с использованием TriReagent (Sigma, США) согласно протоколу производителя.
Для получения одноцепочечных кДНК к 2 мкг суммарной РНК, предварительно обработанной ДНКазой I (Fermentas, США) (1 ед. фермента на 1 мкг РНК), добавляли 80 пмоль произвольно выбранных 9-член-ных праймеров и инкубировали в течение 5 мин при 70°С. Затем в смесь на льду вносили 25 мкл RT-MIX (RT-Buf 10 х (Fermentas, США)), 40 мМ dNTP, 10 ед. RNAsin (Promega, США) и инкубировали в течение 5 мин при 37°С. После этого вносили 200 ед. обратной транскриптазы M-MuLV (Fermentas, США) и проводили реакцию при 42°С в течение 1 ч. Реакцию останавливали прогреванием смеси при 70°С в течение 10 мин. Объем пробы доводили до 200 мкл деио-низованной водой. Пробы хранили при -20°С.
ПЦР в реальном времени проводили с использованием амплификатора iCycler iQ5 (BioRad Laboratories GmbH, Германия). Матрицей для ПЦР служила кДНК. Реакционная смесь включала: 10 пмоль 5'- и З'-праймеров, 1.6 мМ MgCl2, 0.25 мкМ dNTP, амплификационный буфер 10х с интеркали-рующим флуоресцентным красителем Eva Green («Синтол», Россия), 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы («Синтол», Россия). Реакционную смесь предварительно прогревали в течение 10 мин при 95°С и проводили 40 циклов денатурации (95°С), отжига (60°С) и полимеризации (72°С) с определением количества накопленного продукта по спектру флуоресценции в конце стадии элонгации. Каждую реакцию проводили в трех повторах. В работе использовали следующие праймеры:
cox-2 F-5'-CCATGTCAAAACCGTGGTGAATG-3', cox-2 R-5'-ATGGGAGTTGGGCAGTCATCAG-3', gapdh RN F-5'-CTGACATGCCGCCTGGAGAAA-3',
gapdh RN R-5'-TGGAAGAATGGGAGTTGCTGT-TGA-3'.
Ген домашнего хозяйства gapdh использовали в качестве референсного для выравнивания внесенного в реакцию количества транскриптов. Праймеры подбирали с помощью программы VectorNTI. Температуру отжига праймеров и количество циклов для амплификации каждого из фрагментов подбирали экспериментально. Обработку результатов эксперимента и расчет относительного уровня экспрессии проводили с помощью программ Bio-Rad iQ5 2.0 Standard Edition Optical System Software и REST 2005. Коэффициент эффективности реакции рассчитывали с использованием программы LinRegPCR.
Острый экспериментальный перитонит у крыс вызывали внутрибрюшинным введением 40% раствора тиогликолата (Fluka, Швейцария) в дозе 4 г/кг, и определяли проницаемость кровеносных сосудов желудка и тонкого кишечника. Для этого краситель Evans blue (Sigma, США) вводили шприцем (50 мг/кг) в яремную вену. Через 15 мин животных наркотизировали, вскрывали и отбирали образцы экссудата. Затем животных транскардиально перфузирова-ли в течение 2-3 мин физиологическим раствором, содержащим 20 ед./мл гепарина. Выделяли желудок и тонкий кишечник, измельчали и взвешивали. Для экстракции красителя ткани заливали форма-мидом (Scharlau Chemie S.A.) и инкубировали в течение 48 ч при 37°С. Затем пробы центрифугировали в течение 15 мин при 2000 об/мин. Количество красителя определяли на спектрофотометре Multiscan EX (Thermo Scientific) при к = 620 нм и выражали в мкг/г ткани и в мкг/мл экссудата.
Результаты обрабатывали статистически с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни в компьютерной программе STATISTICA 6. Критической величиной значимости считали 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В первой серии экспериментов для формирования отека животным подкожно вводили в лапу 0.2 мг гистамина в объеме 100 мкл. За 30 мин до индукции воспаления в ту же лапу внутримышечно вводили PGP в дозе 3.7 мкмоль/кг. Другой группе опытных животных вводили диклофенак 1 мг/кг (Hemopharm, Сербия). Контрольным животным вместо пептида вводили физиологический раствор. Измеряли толщину и окружность лапы и выражали в процентах от исходных значений (до введения препарата). Результаты представлены на рис. 1.
Толщина и окружность лапы через 30 мин после введения гистамина увеличивались в среднем на 20.5%. После предварительного введения пептида отек лапы был значительно меньше, уже через 1 ч
окружность лапы уменьшилась на 29.5% по сравнению с контролем, а через 2 и 3 ч - на 38 и 47% соответственно. Через 2 ч после индукции воспаления толщина лапы была на 38% меньше, чем в контроле, а через 3 ч на 35%.
Таким образом, предварительное введение PGP приводило к уменьшению отека. Это подтверждает выявленное ранее противовоспалительное действие пептида. Сравнение эффектов PGP и нестероидного противовоспалительного препарата диклофенак (рис. 1) показало, что пептид и диклофенак действовали однонаправлено - уменьшали отек, вызванный гистамином. Это наводит на мысль о возможном сходстве механизмов их действия. Известно, что диклофенак подавляет циклооксигеназу-2 (COX-2) - один из основных ферментов в цепи синтеза простаглан-динов из арахидоновой кислоты. Поэтому в следующей серии экспериментов мы исследовали влияние PGP на экспрессию гена cox-2 при воспалении, вызванном подкожным введением гистамина в лапу. Полученные результаты представлены на рис. 2.
Подкожное введение гистамина практически в 5 раз увеличивало экспрессию гена cox-2 через 2 ч после начала воспаления. Предварительное введение диклофенака приводило к снижению уровня экспрессии исследуемого гена на 31%. Однако при введении пептида уровень экспрессии гена не изменялся и оставался таким же, как при воспалении. Это свидетельствует о различиях в механизмах противо-отечного действия PGP и диклофенака.
Поскольку формирование отека обусловлено повышением проницаемости эндотелия сосудов, мы оценили влияние PGP на изменение проницаемости кровеносных сосудов в желудке и тонком кишечнике при остром перитоните у крыс.
Животным опытной группы за 15 мин до внутри-брюшинного введения тиогликолата внутримышечно вводили PGP в дозе 3.7 мкмоль/кг. Животные другой группы вместо PGP получали физиологический раствор. Третьей группе животных вводили физиологический раствор без последующей индукции воспаления. Об уровне проницаемости судили по количеству красителя Evans blue в экссудате и образцах тканей желудка и кишечника.
Полученные результаты представлены на рис. 3. Видно, что проницаемость в контроле (5.9 мкг краски на 1 г ткани в желудке и 3.7 мкг/г в тканях тонкого кишечника (рис. 3А)) существенно отличается от проницаемости при воспалении. Проницаемость кровеносных сосудов в желудке увеличивалась в среднем на 66%, а в кишечнике - в 2.4 раза. Предварительное введение пептида не приводило к повышению проницаемости в желудке и кишечнике. Повышенный уровень проницаемости после
А
.0 □
га с га х
X
с
о
.0 □
га с
л н
и
0
1
X о.
О
25 20 15 10 5 0
25 20 15 10 5
-Физраствор--Диклофенак----PGP
0.5
1 2 ч
Физраствор Диклофенак PGP
* 5 ■
>т_ ____т_
I"
* "Г
* *
2 3
0.5
Рис. 1. Влияние PGP и диклофенака на изменение толщины (А) и окружности (Б) лапы при воспалении, вызванном гистамином. * - р < 0.05, ** - р < 0.01, @ - р < 0.1
введения тиогликолата, как и эффект от введения пептида, сохранялся в течение 2 ч.
Кроме того, о снижении проницаемости сосудов свидетельствует уменьшение количества экссудата в перитонеальной полости на 14% и количества красителя в экссудате (мкг/мл) практически в 2 раза (рис. 3Б,В).
Таким образом, предварительное введение PGP предотвращает повышение проницаемости сосудов в желудке и тонком кишечнике. Объем экссудата и количество красителя в нем также остаются на уровне контрольных значений.
Способность PGP препятствовать увеличению проницаемости сосудистого эндотелия может быть связана как с прямым действием пептида на сосуды [8], так и с его стабилизирующим действием на тучные клетки [9], медиаторы которых, как известно, вносят большой вклад в инициацию и регуляцию
0
3
4
Б
0
0
4
ч
.с
I
ф
m ^ 0 I
У У
и и Ф О. с и X
т
л .о
с
ф
н У
и
0
1
6
4
2
Л
NaCl + Диклофенак +
гистамин
гистамин
PGP + гистамин
и
2 12
к м
ф -Q с
a
>
Желудок Тонкий кишечник
NaCl (7) NaCl + ТИО (8) PGP + ТИО (6)
В
Рис. 2. Уровень экспрессии мРНК циклооксигеназы-2. Пунктирной линией обозначен уровень экспрессии в норме
проницаемости сосудов. В ходе наших экспериментов установлено, что пептид нельзя рассматривать как классический противовоспалительный препарат, такой, как диклофенак, поскольку, несмотря на внешнее сходство наблюдаемых эффектов, механизмы их действия различаются.
Сведения об участии PGP в регуляции воспалительного процесса противоречивы. С одной стороны, достоверно установлено защитное действие глипро-линов при различных нарушениях, сопряженных с воспалением. Так, они не только оказывают протекторное действие на слизистую оболочку желудка при образовании язвы, но и защищают клетки от окислительного стресса и участвуют в регуляции иммунного статуса организма [10].
С другой стороны, PGP и его ацетилированная по N-концу форма (N-АсPGP) являются хемоат-трактантами для нейтрофилов [11]. Реализация этой активности опосредована взаимодействием с рецепторами CXCR2 нейтрофилов. Эти пептиды привлекают нейтрофилы в очаг воспаления и тем самым пролонгируют процесс. Вместе с тем, рецепторы CXCR2 обладают селективностью по отношению к лигандам, что может приводить к запуску сигнальных каскадов, направленных как на усиление, так и на ограничение воспаления [12]. Кроме того, в последнее время появились данные о том, что связывание N-АсPGP с рецепторами CXCR2 нейтрофилов, моноцитов и макрофагов способствует проявлению терапевтического эффекта данного пептида при сепсисе. Установлено, что введение мышам N-AcPGP приводило к увеличению продукции интерферона-^ и интерлейкина (IL)-12, а также к ингибированию
а д
у
с с к
т
м е
А
ю
О
16 12
16 12
NaCl + ТИО (8)
PGP + ТИО (6)
ф
-Q С
a
>
; 8
NaCl + ТИО (8)
PGP + ТИО (6)
Рис. 3. Изменение проницаемости сосудов желудка и тонкого кишечника (А), объема перитонеального экссудата (Б) и количества красителя в экссудате (б) при экспериментальном остром перитоните у крыс через 30 мин после введения тиогликолата.
* - р < 0.05. ТИО - тиогликолат. Цифрами в скобках указано количество животных в каждой группе
продукции провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-1 в и IL-6) в перитонеальной жидкости. In vitro N-AcPGP непосредственно увеличивал продукцию интерферона-y и снижал стимулированную липо-полисахаридами продукцию TNF-a макрофагами селезенки мыши и лейкоцитами человека [12]. Эти данные свидетельствуют о том, что наличие у пептидов хемоаттрактантной активности не отрицает их способности в определенных условиях проявлять противовоспалительные свойства.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Совокупность полученных нами данных позволяет считать, что в основе противовоспалительного действия пептида наряду со стабилизацией тучных клеток лежит его способность предотвращать повышение проницаемости кровеносных сосудов.
8
4
0
0
Б
8
4
4
0
0
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ляпина Л.А., Самонина Г.Е. // Биохимия. 1998. Т. 63. № 2. С. 149-155.
2. Ашмарин И.П., Самонина Г.Е., Бадмаева К.Е., Бакаева З.В., Васьковский Б.В., Золотарев Ю.А. // Успехи физиол. наук. 2006. Т. 37. № 2. С. 11-18.
3. Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Гончарова Е.Л., Багликова К.Е. // Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7. № 2. С. 28-32.
4. Умарова Б.А., Лелекова Т.В., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Бакаева З.В., Гончарова Е.Л., Бондаренко Н.С. // Цитокины и воспаление. 2009. Т. 8. № 3. С. 44-47.
5. Умарова Б.А., Бондаренко Н.С., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е. // Биол. мембраны. 2011. Т. 28. № 4. С. 262-266.
6. Kumar P., Shen Q., Pivetti C.D., Lee E.S., Wu M.H., Yuan S.Y. // Expert Rev. Mol. Med. 2009. V. 11. P. e19.
7. Kunder C.A., St John A.L., Abraham S.N. // Blood. 2011. V. 118. № 20. P. 5383-5393.
8. Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Сергеев И.Ю., Самонина Г.Е. // Бюл. эксп. биол. мед. 2003. Т. 135. № 4. С. 390-393.
9. Bondarenko N.S., Yusipovich A.I., Kovalenko S.S., Kopylova G.N., Umarova B.A., Graevskaya E.E., Maksimov G.V. // Bio-logicheskie Membrany. 2013. V. 30. № 3. P. 199-205.
10. Andreeva L.A., Mezentseva M.V., Nagaev I.Y., Shapoval I.M., Shcherbenko V.E., Potapova L.A., Russu L.I., Narovlyansky A.N., Ershov F.I., Myasoedov N.F. // Dokl. Bio. Sci. 2010. V. 434. P. 300-303.
11. Haddox J.L. Pfister R.R., Sommers C.I., Blalock J.E., Villain M. // Investigative Ophthalmol. Visual Sci. 1999. V. 40. № 10. P. 2427-2429.
12. Kim S.D., Lee H.Y., Shim J.W., Kim H.J., Yoo Y.H., Park J.S., Bae Y.-S. // Am. J. Respiratory Crit. Care Med. 2011. V. 184. № 2. P. 243-251.
