CC BY
59
ЯВЛЕНИЕ ОБРАТИМОСТИ МЕЖПОПУЛЯЦИОННЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПЕРЕХОДОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS КАК ОСНОВА СОЗДАНИЯ НОВЫХ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Т.Л. Березинская !, М.О. Шлеева2, А.С. Капрельянц2, А.В. Иткес4, И.С. Матвеева \ И.М. Лебедев 1, В.А. Ильин5, А.В. Сыроешкин 1,3
'Государственный океанографический институт, лаборатория прикладной гидрохимии, Кропоткинский пер, 6, 119992, Москва, Россия
2Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Ленинский проспект, д. 33 стр.2, 117071, Москва, Россия 3Кафедра фармацевтической и токсикологической химии, медицинский факультет, РУДН, ул. Миклухо-Маклая 8, 117198, Москва, Россия 4Кафедра общей биологии и генетики, медицинский факультет, РУДН, ул. Миклухо-Маклая 8, 117198, Москва, Россия 5Поликлиника №1 Управления делами Президента РФ, Кутузовский проспект, 20, 121151, Москва, Россия
Результаты исследований культуры М. tuberculosis методом лазерной дифракции позволяют рассматривать бактериальную культуру как систему, существующую в форме динамического равновесия «одиночные клетки/ассоциаты и (или) колониальные формы». Доказана возможность направленного регулирования межпопуляционных клеточных переходов, в частности, путем внесения в культуральную среду нетоксичных солей металлов. Так как рост и развитие бактериальной культуры неразрывно связаны с субпопу-ляционными перестройками, использование металлосодержащих препаратов в сочетании с известными медикаментозными способами активации макрофагов может стать новым способом лечения некоторых форм туберкулеза.
Из литературных данных хорошо известно такое явление, как изменения формы и размеров эукариотических клеток под действием химических и физических факторов [1]. Так, при неблагоприятных условиях в культуре Saccharomyces cerevisiae образуются гигантские клетки, что способствует снижению соотношения поверхность/объем [2]. Эффекты изменения клеточной морфологии в зависимости от состава среды описаны для Phaeococcomyces exophialae [4]. Для бактериальных клеток, вследствие особенностей строения (таких, как наличие клеточной стенки), подобные переходы затруднены, и при реализации аналогичных механизмов формообразования у прокариот следовало бы ожидать не изменений морфологии отдельной клетки, а объединения клеток в ассоциаты и колонии.
Действительно, явление полиморфизма бактериальных культур хорошо известно [2] и используется в качестве их метаболических характеристик. С помощью метода лазерной дифракции нами были предприняты исследования распределения по размерам и форме клеток различных бактериальных культур, а также зависимости этого распределения как от особенностей самой культуры, так и от условий окружающей среды.
Результаты предыдущих исследований наглядно демонстрируют факт присутствия в бактериальных культурах клеточных ассоциатов и колоний, различных по своему происхождению и адаптационному значению. Во-первых, это ассоциаты, возникающие вследствие адгезивного слипания одиночных клеток при повышении концентрации клеток в культуре. Такое явление характерно, в частности, для В. subtillus. Во-вторых, это временные колонии, образующиеся при незавершенном делении клеток как ответ на изменение состава среды. Данный механизм реализуется в культурах В. subtillus и Е. coli. В-третьих, это генетически детерминированное образование колонии, известное для Е. coli и микобактерий. Следует подчеркнуть, что колониальным формам во всех случаях принадлежит более 50% суммарного объема цитоплазмы.
Таким образом, данные позволяют высказать предположение о существовании любой бактериальной культуры в форме динамического равновесия «одиночные клетки/ассоциаты и (или) колониальные формы». Возникновение ассоциатов и колониальных форм у прокариот может рассматриваться как стандартный адаптивный ответ на изменение состава внешней среды. При этом обеспечивается механизм защиты от воздействия токсических соединений либо по пути уменьшения соотношения поверхность/объем (например, образование спор), либо за счет псевдомно-гоклеточности - создания защитного слоя клеток или внеклеточных выделений, при этом внутренние клетки остаются интактными. Сдвиг равновесия у прокариот одиночная клетка<->колония в сторону колонеобразо-вания может играть очень интригующую роль в вопросах патогенеза возбудителей инфекционных заболеваний, таких как возникновения лекарственной устойчивости или неэффективности клеточного и гуморального иммунитета. Кроме того, ложная многоклеточность у прокариот может (конвергентно к эукариотам) использоваться для обеспечения устойчивости бактериальных популяций в природных биогеоценозах. Чтобы доказать это положение, мы исследовали объемное и численное распределение полиморфной культуры Mycobacterium tuberculosis в зависимости как от состояния самой культуры, так и от влияния внешних факторов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Измерение численного и объемного распределения клеток. Распределение клеток по размерам и форме регистрировали с помощью дифракции лазерного света на лазерном дифракционном определителе размеров частиц (¿article sizer) «Malvem 3600 Ес». Принцип работы заключается в следующем. Маломощный гелий-неоновый лазер излучает монохроматический пучок света (Хтах=633 нм), который проходит через экспериментальную ячейку. С помощью линз Фурье дифракционная картина фокусируется на мультиэлементном фотоэлектрическом детекторе. Детектор непосредственно связан с компьютером, осуществляющим весь комплекс обработки данных, начиная от интегрирования набора дифракционных картин, отражающих мгновенное распределение частиц по размерам. В
экспериментальном образце все частицы проходят освещенную зону за счет непрерывного перемешивания. Для анализа распределений клеток по размерам и форме были использованы два вида зависимостей: nj=f(rj) и Vj=f(rj), где nj и Vi - соответственно численные и объемные доли размерной группы Г;. Чувствительность метода зависит от типа клеток (площади сечения) и колеблется в интервале от 300 клеток в пробе (инфузория Spirostomum ambiguae - длина ~ 0,5 мм, средняя ширина —70 мкм) до ~104 клеток в пробе (Bacillus subtillis - средний линейный размер < 1 мкм).
2.Получение клеток Mycobacterium tuberculosis (род и вид культуры подтверждены ПЦР-исследованием с использованием видоспецифичных праймеров). После предварительной гомогенизации культура была выращена в колбе без доступа кислорода. В колбу объемом 750 мл добавлялось 200 мл питательной среды (состав среды (на 1 л): 0,5 г КН2РО4, 0,5 г MgS04, 4,0 г -аспарагина, 60 мл глицерола, 0,05 г ферри аммониум цитрата, 2,0 г Na лимоннокислого, 0,1 мл 1%-го ZnS04, pH доводится до 7 с помощью КОН), 20 мл supplement, содержащего (на 1 л бидистиллята) 50 г бычьего сывороточного альбумина, 20 г глюкозы, 8,5 г NaCl и 2 мл ино-кулята клеточной культуры. Культура выращивалась в течение 4 месяцев на качалке при 200 об/мин. и t=37°C без дополнительного доступа кислорода до достижения дормантного состояния, после чего была пересеяна для «оживления».
«Оживление». В разные колбы объемом по 100 мл было добавлено по 50 мл стандартной питательной среды, содержащей supplement в соотношении 1:10, и по 5 мл инокулята. В первой из них культура, взятая без изменений, выращивалась на обычной среде, во второй - культура была предварительно профильтрована дважды через 2-микронный фильтр. В обеих колбах культура выращивалась на качалке (200 оборотов/мин) при t=37°C в течение двух недель. Из полученной растущей культуры в стерильных условиях отбирались образцы для исследований.
Параллельно культура высевалась на чашки и проводился подсчет CFU.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследований была выбрана культура Mycobacterium tuberculosis (штамм Academia), отличающаяся, как известно, выраженным полиморфизмом. Так как основным фактором противоинфекционной защиты при патогенезе микобактерий туберкулеза является макрофагальный ответ, отсутствие биологического излечения от туберкулеза легких (т.е. неполнота протекания процессов фагоцитоза) объясняется именно этим фактором, т.е. множественностью форм микобактерий туберкулеза, отличных от классической палочки Коха (L-формы, ультрамелкие), а также способностью данных патогенов к длительному внутриклеточному персистиро-ванию в дормантном состоянии [2]. Охарактеризовав культуру М. tuberculosis штамм Academia с помощью указанного метода, мы обнаружили как одиночные клетки, присутствующие в двух различных формах (ультрамелкие - гтах численного распределения < 1 мкм и палочки Коха -
We численного распределения ~ 2-3 мкм), так и колонии (гтах объемного распределения - 70 мкм). Микроскопически колонии выявляются как крайне редкие в виде характерных веточек при увеличении х40. Оказалось, что численное соотношение (колониальные формы М. tuberculosis)/(одиночные клетки) стремится к нулю, тогда как объемная доля колониальных форм составляет почти 90% (от общего объема всех клеточных форм).
Такое распределение характерно для культуры в логарифмической и стационарной фазах. Однако для М. tuberculosis широко известно явление персистирования, и культура in vitro может длительное время сохраняться в пост-стационарной фазе. При этом клетки теряют способность расти на твердых средах. Исследование такой культуры с помощью метода лазерной дифракции демонстрирует изменение ее субпопуляционного состава: 95% количественно принадлежит одиночным клеткам размером менее 1 мкм. Как показала микроскопия, такие клетки представлены овоидными и коккоидными формами небольшого размера (0.6-0.8 мкм). Так как такие клетки полностью теряют способность формирования колоний на твердых средах, очевидно, что это - дормантные, «некультивируемые» формы [б].
Из описанного дормантного состояния культура может быть переведена в состояние активного роста. Исследования полиморфной клеточной культуры М. tuberculosis с помощью лазерной дифракции позволяют проследить за изменениями и превращениями клеток в процессе роста и созревания культуры (рис. 1).
В исходной дормантной культуре 95% количественно принадлежит одиночным клеткам размером менее 1 мкм. Изменения субпопуляцион-ной структуры наблюдаются уже на на 4-й день после посева: процент мелких одиночных форм резко снижается, появляются пики, соответствующие размерам 2-3 мкм, 5-7 мкм и 15-17 мкм, что говорит об образовании ассоциатов и колоний. Высота пиков, (характеризующая объемную долю структур данного размера) составляет, соответственно, 1,5%, 7% и 22%. По причине заметного полиморфизма исходной культуры момент начала колонеобразования не так ярко выражен, но, тем не менее, хорошо заметен.
Для того, чтобы ответить на вопрос, какие именно клетки способны к колонеобразованию (палочки Коха или дормантные формы), и оценить способность перехода «некультивируемых» форм в активное состояние, культура М. tuberculosis была профильтрована дважды через фильтр 2 мкм. В этом случае дормантная культура, посеянная после фильтрации, достаточно гомогенна и представлена одиночными «некультивируемы-ми» клетками.
Рис. 1. Переход дормантной культуры к активному размножению. Культура М. tuberculosis, не подвергавшаяся фильтрации
Численное распределение клеток и ассоциатов культуры М. tuberculosis показано на основных графиках, объемное распределение - на вставках сверху: А - в момент посева, Б - через 3 суток, В - через 6 суток, Г - через 9 суток, Д - через 12 суток, Е - через 14 суток
«Оживление» культуры (ее переход в логарифмическую фазу) сопровождается принципиальными изменениями структуры клеточной популяции: культура приобретает гетерогенность, клетки образуют ассоциаты характерной формы, хорошо различимые при больших увеличениях светового микроскопа (рис. 2а).
Поскольку исходная культура практически гомогенна, процесс клеточной агрегации хорошо заметен: на 4-й день после посева процент ультра-мелких форм снижается до 75%, появляются пики, указывающие на образование ассоциатов размером около 6 и 13 мкм. Высота пиков (соответствующая объемной доле структур данного размера) составляет, соответственно, 2,2% и 7,5%. На 6-й день возникает яркая картина гетерогенности -присутствуют характерные пики, соответствующие размерам примерно 2 мкм, 4-5 мкм, 10 мкм, 23 мкм и 42 мкм. Высота пиков составляет 1,2%, 16%, 2,5%, 18,5% и 2%, соответственно. С помощью светового микроско-
па в этот момент можно пронаблюдать небольшие ассоциаты коккоидных форм, классические палочковидные формы и их колонии.
Рис. 2а. Переход дормантной культуры к активному размножению. Профильтрованная культура М. tuberculosis
Численное распределение клеток и ассоциатов культуры М. tuberculosis показано на основных графиках, объемное распределение - на вставках сверху: А - в момент посева, Б - через 3 суток, В - через 6 суток.
Далее по мере роста культуры происходит перераспределение клеточных субпопуляций в сторону дальнейшего колонеобразования (рис.2б). Девятидневная культура характеризуется присутствием пиков, соответствующих размерам 2,2 мкм, 5-6 мкм и 17,5 мкм, и достигающих высот 0,6%, 7% и 24%, соответственно (см. рис. 26). Но на этой стадии вновь появляются мелкие коккоидные формы, и их количество возрастает. Заметим, что двухнедельная культура уже демонстрирует полную гетерогенность - присутствуют как колонии разного размера (от 2 до 50 мкм), так и палочки, и ультрамелкие одиночные клетки.
МКМ МКМ МКМ
Рис. 26. Переход дормантной культуры к активному размножению. Профильтрованная культура М. tuberculosis
Численное распределение клеток и ассоциатов культуры М. tuberculosis показано на основных графиках, объемное распределение - на вставках сверху: Г - через 9 суток, Д - через 12 суток, Е - через 14 суток.
Параллельный подсчет CFU позволил достоверно подтвердить тот факт, что рост культуры на чашках начинается во время значительного перераспределения клеточных субпопуляций и образования ассоциа-тов/колоний.
В результате мы непосредственно пронаблюдали межпопуляционные клеточные переходы как в сторону колонеобразования (от ультрамелких форм к палочкам Коха через агрегацию, и зарождение настоящих колоний), так и в обратном направлении (появление в гетерогенной бактериальной культуре ультрамелких одиночных форм).
Таким образом, достоверно выяснено, что:
1 - в дормантной культуре М. tuberculosis преобладают одиночные клетки
размером менее 1 мкм;
2 - при переходе культуры от дормантной к активно делящейся форме ее
субпопуляционная структура претерпевает коренные изменения: уже на 3-4-й день начинаются процессы клеточной агрегации и/или колонеобразования;
3 - культура переходит к фазе логарифмического деления только после
того, как образуется достаточное количество клеточных ассоциатов (на 7-9-й день), причем во время деления процессы колонеобразования продолжаются, что придает культуре характерную гетерогенность.
4 - культура М. tuberculosis может быть охарактеризована как динамиче-
ская система, в которой присутствуют взаимно обратимые межпопуляционные клеточные переходы «некультивируемые» формы - палочки Коха - колонии.
Известно, что добавление в среду роста М. tuberculosis супернатанта логарифмической культуры, или характерного белка Rpf, ускоряет переход культуры к активному размножению, тогда как выращивание культуры на среде с Tween (т.е. с детергентом) замедляет ее размножение [6]. Так как переход в логарифмическую фазу неразрывно связан с субпопу-ляционными перестройками, можно сделать предположение о влиянии данных веществ на межпопуляционные клеточные переходы. С целью выяснения возможности направленного регулирования таких переходов было проанализировано содержание в культуре М. tuberculosis суммарного содержания металлов [7].
Исходя из предположения, что характерные аккумулирующие свойства клетки проявятся при изучении широкого диапазона элементного состава, можно ожидать изменения суммарного содержания металлов при резких изменениях формы. Это является следствием нового состояния межфаз-ных границ, резко различающихся в субпопуляциях микобактерий туберкулеза. Действительно, оказалось, что при росте культуры, сопровождающемся образованием гигантских колоний и ультрамелких форм, значительно менялось содержание металлов в культуре (табл. 1).
Таблица 1
Коэффициенты накопления (убыли) общего содержания металлов ________________ при росте М. tuberculosis ____________ ____________
Металл Показатель — А1 Сг Мп Ni Cu Zn Cd Pb
Коффициент накопления/убыли 1,65 0,33 1,60 2,40 >20 5,0 1,5 >4
Примечание: средняя относительная ошибка не превышала 20% при доверительной вероятности 90%
Поэтому внесение соли соответствующего металла в культуральную среду приведет к смещению динамического равновесия в сторону «палочек Коха». Этот результат был получен при внесении в среду роста сульфата цинка [8]. Примечательно, что изониазид, не влияющий на равновесие, а блокирующий его, менее эффективен в ликвидации 80 мкм колоний.
С нашей точки зрения, использование нетоксичных солей металлов, смещающих равновесие в сторону палочек Коха, в сочетании с известными медикаментозными способами активации макрофагов может стать новым способом лечения некоторых форм туберкулеза. Лекарственный эффект металлсодержащего препарата продемонстрирован экспериментально [9]. Поданы патенты России и Украины на фармкомпозицию, действующую по принципу индукции межпопуляционных клеточных переходов [10].
ЛИТЕРАТУРА
1. Сыроешкин A.B., Гребенникова Т.В., Байкова В.H., Ковалева A.A., Лебедев И.М., Би-кетов С.Ф., Плетенева Т.В., Фролов В.А.. Новый подход к исследованию патофизиологии клетки: изучение распределения клеток по размерам и форме как метод диагностики и мониторинга заболеваний.// Клиническая лабораторная диагностика. -2002,- №5.-С. 35-40.
2. Сыроешкин A.B., Березинская Т.Л., Долгополова В.А., Ковалева A.A., Бикетов С.Ф., Плетенева Т.В. Дормантные формы клеток и споры: кинетическая теория клеточных превращений// Электронный журнал «Исследовано в России». - 2001. - 112. -С.1204-1214. http://zhurnal.ape.relarn.rU/articles/2001/l 12.pdf
3. Богомолова Е. В., Власов Д.Ю., Панина Л.К. Морфометрическое сравнение серии штаммов диморфных черных дрожжей Phaeococcomyces exophialae //Микология и фитопатология. - 2000. - 34(2). - С. 40-47.
4. Панина Л.К., Богомолова Е.В., Павленко В.К. Пространственная организация колоний диморфных микромицетов // Биофизика. - 2000. - 45(5). - С. 905-907.
5. Сыроешкин A.B., Гребенникова Т.В., Березинская Т.Л., Плетенева Т.В., Глупценко H.H., Аветисян А., Бикетов С.Ф. Колонеобразование у прокариот как проблема инфекционной патологии// Вестник РУДН. - 2001. - № 3. - С. 17-24 http://med.pfti.edu.ru/_new/russian/win/library/vestnik/vO 13/03 2001 .html
6. Шлеева М.О., Мукамолова Г.В., Телков М.В., Березинская Т.Л., Сыроешкин A.B., Бикетов С.Ф., Каприльянц A.C. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление// Микробиология. - 2003. - 72. - № 1. -С. 1-8. http://mars.udsu.ru/cgi-bin/cls/joumal_content77202
7. Матвеева И.С., Плетенева Т.В., Березинская Т.Л., Аветисян А., Шлеева М.О, Каприльянц A.C., Лебедев И.М, Колесников М.H., Бикетов С.Ф., Сыроешкин A.B. Эле-
ментные профили металлов как векторная характеристика вида и физиологического состояния// Микроэлементы в медицине. - 2003. - 4. - С. 15-21.
http://www.microelements.ru/t04rus3.shtml
8. Балышев А.В., Каприльянц А.С., Березинская Т.Л., Шлеева М.О., Матвеева И.С., Лебедев И. М., Гаврилова М.М., Плетеннева ТВ., Сыроешкин А.В. Новое лекарственное средство для предотвращения развития нефагоцитируемых колониальных форм Mycobacteria tuberculosis // XI Российский национальный конгресс «Человек и ле-картсво». 19-23 апреля 2004 г. Тезисы докладов. - Москва, Общерос. обществен. Фонд «Здоровье человека. - С. 421.
9. Балышев А.В., Плетенева Т.В., Гребенникова Т.В., Каприльянц А.С., Сыроешкин А.В. К вопросу о разработке нового противотуберкулезного гп2+-содержащего препарата вод// Вестник ОГУ. («Приложение «Биоэлементология»). - 2004. - №4 (29). - С. 13-14.
10. Сыроешкин А.В., Фролов В.А. От теории топологии и кинетики клеточного формоб-разования к направленному управлению нормальными и патологическими реакциями клеточных популяций// Патофизиология и современная медицина. Вторая международная конференция. 22-24 апреля 2004 г. - Москва, Издательство РУДН, 2004. - С.377-379.
THE PHENOMENON OF THE REVERSIBLE CHANGES BETWEEN CELL POPULATIONS OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS AS A BASIS FOR PRODUCING NEW MEDICINES EFFECTIVE AGAINST TUBERCULOSIS
T.L. Berezinskaya *, M.O. Shleeva2, A.S. Kaprelyants 2, A.V. Itkes4,
I.S. Matveeva , I.M. Lebedev 1, V.A. Ilyin , A.V. Syroyeshkin 1,3
1State Oceanographical institute, laboratory of applied Hydrochemistry Kropotkinskiy side street, 6, 119992, Moscow, Russia
2 Institute of Biochemistry named after A.N. Bakh of RAS Leninskiy avenue, 33 building 2, 117071, Moscow, Russia
3 Department ofpharmaceutical and toxicological chemistry, medical faculty, RPFU, Miklukho-Maklaya, 8, 117198, Moscow, Russia
4 Department of biology and genetics, medical faculty, RPFU,
Miklukho-Maklaya st., 8, 117198, Moscow, Russia
5 Clinic Nsl of Administrative department of President of RF
Kutuzovskiy avenue, 20, 121151, Moscow, Russia
The using of the laser diffraction method in the investigation of M. tuberculosis allows to consider a bacterial culture as a dynamic system. The growing and development of the bacterial culture depends on balance between “single cells/associations and (or) colonial forms”. It has been proved the controlled changes between cell populations are possible, and specifically the advances have come about through the insertion of the non-toxic metal salts into the bacterial culture.
So we consider that the using of metal-containing compounds in conjunction with well-known medical methods of macrophage activation is able to be a new way of treatment of some tuberculosis forms.
