CC BY
43
КОЛОНЕОБРАЗОВАНИЕ У ПРОКАРИОТ КАК ПРОБЛЕМА ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ
A.B. СЫРОЕШКИН
Государственный океанографический институт, лаборатория прикладной гидрохимии Москва, 119999, Кропоткинский пер. 6 Т.В. ГРЕБЕННИКОВА Институт вирусологии РАМН, НПО «Нарвак» Москва, 123098, ул. Гамалеи 16
Т.Л. БЕРЕЗИНСКАЯ Государственный океанографический институт, лаборатория прикладной гидрохимии Москва, 119999, Кропоткинский пер, 6 Т.В. ПЛЕТЕНЕВА, H.H. ГЛУЩЕНКО Кафедра фармацевтической и токсикологической химии, РУДН.
Москва, 117198, ул. Миклухо-Маклая д. 8, Медицинский факультет A.B. АВЕТИСЯН Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Москва, 119899, Воробьевы горы С.Ф. БИКЕТОВ Институт прикладной микробиологии РАМН
По данным размерных спекзров, полученных с помощью дифракции лазерного света, обнаружено, что в суспензиях клеточных культур Bacillus subtillus, Escherichia coli и Mycobacteria tuberculosis значительную долю суммарного объема дисперсной фазы занимают ассоциаты и колониальные формы. Предложена классификация форм «ложной многоклеточное™» у прокариот: 1) Обратимое адгезивное слипание одиночных клеток, соответственно, зависящее от концентрации клеток. Этот механизм обнаружен в культуре В. subtillis. 2) Лиганд-зависимое образование временной колонии вследствие незавершенного деления клеток. Этот механизм обнаружен в культурах В. subtillis и E. coli. Доля объема цитоплазмы колониальных форм от суммарного объема составляла 50% для В. subtillus и 20-90 % для E. coli (в зависимости от штамма). 3) . Генетически детерминированное (зависящее от вида) образование колонии уже не как субпопуляции. Этот механизм используется и у Е. col,i, и у микобактерий. Обсуждается роль колониальных форм в неэффективности клеточного иммунитета и при формировании лекарственной устойчивости.
Ключевые слова: колонии бактерий, размерные спектры, микобактерии.
Бактериальная клетка a priori отличается меньшей лабильностью формы, чем эукариотическая. Было предположено, что ответ прокариотической клетки на химические факторы окружающей среды будет состоять в изменении формы не одиночной клетки, как-то характерно для эукариот [1], а в объединении в ассоциаты и колонии подобно реакции на токсиканты низших грибов [2]. Кроме того, существует методологическая задача при исследовании метаболических характеристик клеточной культуры - необходимость решить вопрос о ее гомогенности, субпопуляционном составе. Для решения этих вопросов было проведено исследование культур различных бактерий с помощью лазерной дифракции на предмет распределения по размерам и форме [3-5].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ /. Измерение численного и объемного распределения клеток [3]. Распределение клеток по размерам и форме регистрировали с помощью дифракции лазерного света на лазерном дифракционном определителе размером частиц («particle sizer») «Malvern 3600 Ес». Принцип работы заключается в следующем. Маломощный гелий-неоновый лазер излучает монохроматический пучок света (>^=633 нм), который проходит через экспериментальную ячейку. С помощью линз Фурье дифракционная картина фокусируется на мультиэлементном фотоэлектрическом детекторе. Детектор непосредственно связан с компьютером, осуществляющим весь комплекс обработки данных, начиная от интегрирования набора дифракционных картин, отражающих мгновенное распределение частиц по размерам. В экспериментальном образце все частицы проходят освещенную зону за счет непрерывного перемешивания. Для анализа распределений клЙОК поразмерам и форме были использованы два вида зависимостей: n¡=f(r¡) и v¡=f(r¡), ¥t¡ и v, - соответ-
ственно численные и объемные доли размерной группы г,. Чувствительность метода зависит от типа клеток (площади сечения) и колеблется в интервале от 300 клеток в пробе (инфузория Spirostomum ambiguae - длина ~ 0,5 мм, средняя ширина - -70 мкм) до ~104 клеток в пробе (BaciUus subtillïs - средний линейный размер < 1 мкм).
2. Получение суспензии BaciUus subtillus. Одну колонию клеток В. subtillus (штамм 168А, Тгу-) пересевали в 100 мл среды роста, содержащей 100 мМ КН2Р04 (рН=7,0), 1 мМ MgS04, 0,5% глицерин, 0,5% дрожжевого экстракта. Из среды роста отбиралась аликвота для определения элементного состава. Клетки растили около 15 часов при t=37 °С при хорошей аэрации на круговой качалке в стеклянной колбе с выщелоченным стеклом до концентрации -7-107 клеток/мл. Далее отбирали вторую аликвоту на элементный анализ. Для получения спор эту же колбу оставляли при t=37 °С на качалке на 14 суток до практически полного перехода клеток в состояние спор.
3. Получение суспензий клеток Escherichia coli. Одну колонию клеток Е. coli пересевали в 10 мл среды «LB» (pH 7,5) содержащей 10% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl. Одну колонию клеток Е. coli (DH5a) , трансформированной плазмидой pGEMIT, содержащей ген устойчивости к ампициллину, пересевали в 10 мл среды « LB» (pH 7,5) с концентрацией ампициллина 100 мг/мл. Пересев клеток осуществляли с помощью пастеризованной в пламени платиновой петли. Затем каждую пробирку разливали на две равные части (по 5 мл). 5 мл среды с клетками до начала роста замораживали при -20°С. 5 мл среды с клетками растили в течение ночи при 37°С с аэрацией. Для роста использовали одноразовые стерильные полипропиленовые пробирки на 50 мл (типа «Falcon»). Клетки растили 12-14 часов до достижения оптической плотности 0,4 (Х=600 нм).
4. Получение суспензии клеток Mycobacteria tuberculosis (штамм Academia). После гомогенизации культуру выращивали в питательной среде следующего состава: 0,053 г/л КН2Р04, рН=7; 0,053 г/л MgS04; 0,42 г/л аспарагина; 0,63 % глицерола; 5,3 мг/л ферри-аммониум цитрата; 0,21 г/л цитрата натрия; 10'5 % ZnS04; 200 мкл раствора, содержащего 0,58 г/л бычьего сывороточного альбумина, 0,23 г/л глюкозы, 0,1 г/л NaCl. Культуру выращивали 3-12 недель 37 °С.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Была исследована тестовая культура В. subtillus при различных концентрациях клетки: на рис. 1 представлены размерные спектры - численные (черные кружки) и объемные (белые кружки) распределения. Изучение культуры бактерий с помощью лазерной дифракции проводилось в параллель с микроскопическим исследованием. Размеры одиночных клеток В. subtillus не превышают 1 мкм. Для клеток такого размера регистрируется их интегральная объемная и численная доля. Так, доля частиц (к общему числу частиц), размеры которых меньше 1 мкм, составляет около 90 % при любой концентрации. Объемная доля таких частиц - одиночных клеток варьирует, от 12 % до 22%. Распределение частиц клеточной популяции по объемной доле выявляет наличие более крупных частиц, которые, очевидно, являются клеточными ассоциатами. Так, при любых концентрациях присутствует пик, соответствующий размеру ~2 мкм, причем высота его (соответствующая объемной доле частиц данного размера) также меняется очень мало (от 7 до 8 %). Такой же постоянный характер носит присутствие максимума объемного распределения, соответствующего размеру 6,18 мкм. Кроме того, выявляется третий пик, координаты которого при различных концентрациях клеток варьируют (2,20 - 2,95 -
3,42 - 3,97 мкм), но высота (т.е. объемная доля таких клеток) остается примерно постоянной (7 -8 %). Кроме того, при малых концентрациях клеток наблюдаются пики, соответствующие еще более крупным частицам (11 мкм, 17,4 мкм и 20,1 мкм), объемная доля которых очень мала (не превышает 2,24 %). Эти данные и результаты световой
10
100
10
100
Размер, ц
Рис. 1. Численное и объемное распределение клеток и ассоциатов культуры В. зиЫИИз при различных концентрациях клеток. Измерения проведены в среде роста.
-О
Вестник РУДН, серия Медицина, 2001, № 3
Размер,ц
Рис. 2. Объемное (1) и численное (2) распределение колоний/клеток М. tuberculosis, штамм Academia (ГНЦ «Институт прикладной микробиологии»). Интегральная кривая объемного распределения обозначена цифрой 3. Она отсекает на оси ординат отрезок, показывающий объемную долю одиночных форм.
размер, [х
Рис. 3. Размерные спектры (численное и объемное распределение) клеток/колоний культуры E.coli (штамм проф. Р. Петтерсона). Концентрация ампициллина составляла 0,2 мкг/л, что вызывало 15% ингибирование скорости роста культуры.
Рис. 4. Размерные спектры штамма E. coli DH5a, исходного и трансформированного (Rec) с плазмидой, содержащей ген устойчивости к ампициллину. Цифрами указаны объемные доли колониальных форм.
Рис. 5. Способы изменения формообразования у эукариот и прокариот в ответ на факторы внешней среды или нарушения генной регуляции. О - мертвая клетка. 1 путь - увеличение размеров, 2 путь - сжатие клетки, 3 путь - колонеобразование.
микроскопии позволяют охарактеризовать ассоциаты с линейными размерами > 4 мкм, как временные, происшедшие вследствие адгезивного слипания. Постоянные ассоциаты, состоящие из не разошедшихся клеток, соответствуют субпопуляциям при максимумах
3,42 мкм и 11, 17,4, 20, 1 мкм (минорным субпопуляции). Следует подчеркнуть, что ос-
новной субпопуляции постоянных ассоциаты принадлежит большая часть объема цитоплазмы.
Хорошо известно, что при патогенезе микобактерий туберкулеза основным фактором противоинфекционной защиты является макрофагапьный ответ при незначительной роли гуморальных факторов [6]. По современным представлениям отсутствие биологического излечения от туберкулеза легких, то есть неполноту протекания процессов фагоцитоза, объясняется множественностью форм микобактерий туберкулеза [7, 8], отличных от классической палочки Коха (L-формы, ультрамелкие), а также способностью данных патогенов к длительному внутриклеточному персистированию в дормантном состоянии [9, 10]. В культуре М. tuberculosis штамм Academia с помощью указанного метода мы обнаружили как одиночные клетки (rmax численного распределения < 1 мкм), так и колонии (rmax объемного распределения ~ 70 мкм). Микроскопически колонии выявляются как крайне редкие в виде характерных веточек при увеличении х40. Оказалось, что численное соотношение (колониальные формы М. tuberculosis)/(оцупючныъ клетки) стремится к нулю, тогда как объемная доля колониальных форм составляет почти 90% (от общего объема всех клеточных форм) (рис. 2).
При кратковременной обработке ультразвуком (21 кГц) объемные доли одиночных клеток и колониальных форм изменялись аддитивно. Следовательно, объем цитоплазмы колониальных форм в исходной (необработанной ультразвуком) культуре составляет 90 % от общего объема всех форм микобактерий туберкулеза. Данные наблюдения позволяют предположить, что неэффективность фагоцитарной активности макрофагов может быть связана с наличием в изоляте значительной доли колониальных форм микобактерий туберкулеза, так как колонии почти на порядок крупнее клеток альвеолярных макрофагов. Таким образом, своевременное обнаружение колониальных форм становится важной диагностической задачей, так как позволяет а priori определить неэффективность клеточного иммунитета. Следует учесть, что при условии одинаковой патогенности одиночных и колониальных форм согласно настоящему исследованию значительная доля корд-фактора будет выделяться именно колониальной формой. В свою очередь изучение механизма перехода одиночная клетка - колония позволит разрабатывать более эффективные методы терапии.
Для выяснения видоспецифичности явления колонеобразования у прокариот мы предприняли изучение стандартной культуры E. coli с помощью того же метода изучения распределения клеток по размерам и форме. Было обнаружено, что при максимуме численного распределения клеток < 1 мкм, объемное распределение имеет максимум около 2 мкм, то есть в культуре имеются клеточные ассоциаты (рис. 3, А). Клеточным ассоциа-там с линейными размерами г > 2 мкм принадлежит около 90 % объема цитоплазмы, что предполагает колонеобразование из десятков клеток. Инкубация культуры E. coli с ампициллином привела к исчезновению одиночных форм и образованию популяции с узким (полуширина ~ 0,3 мкм) пиком при rmax~2 мкм (рис. 3, В). Такие изменения можно объяснить формированием колонии, в которой наружные клетки играют роль защитного пояса от токсического соединения, оставляя внутренние клетки в интактном микробиоценозе. Колонии у рода микобактерий, по-видимому, являются видовым признаком, так как хорошо известно их распространенность у вида М. avium [11]. Следовательно, колонеобразование контролируется генетически. Для проверки этого положения мы исследовали размерные спектры штамма DH5a E. coli. Доля колоний у данного штамма меньше, чем у штамма проф. Петтерсона (рис. 4). Оказалось, что при трансформации штамма с плазмидой, содержащей ген устойчивости к ампициллину, доля объема цитоплазмы, принадлежащая колониям, сокращается с 20% (исходный штамм DH5a) до 2%.
Итак, для всех видов исследуемых культур (E. coli, В. subtillus, М. tuberculosis) обнаружены, помимо классических одиночных форм, ассоциаты и колонии. Характерной особенностью является тот факт, что ассоциатам и колониям всегда принадлежит свыше
50 % суммарного объема цитоплазмы. Пути образования ассоциатов одиночных клеток можно схематизировать следующим образом:
1. Обратимое адгезивное слипание одиночных клеток, соответственно, зависящее от концентрации клеток. Этот механизм обнаружен в культуре В. subtillus (рис. 1).
2. Лиганд-зависимое образование временной колонии вследствие незавершенного деления клеток. Этот механизм обнаружен в культурах В. subtillus и Е. coli. Доля объема цитоплазмы колониальных форм от суммарного объема составляла 50% для В. subtillus, и 20-90 % для Е. coli (в зависимости от штамма) (рис. 1, 3).
3. Генетически детерминированное (зависящее от вида) образование колонии уже не как субпопуляции. Этот механизм используется и у Е. coli и у микобактерий (рис. 2, 4).
4. Образование колониальных форм у эукариот и адаптивно-приспособительная роль данного процесса хорошо известна [12]. С помощью указанного метода исследования клеточных культур нами описано явление формирования гифоподобных колониальных форм у S. cerevisiaea, как защитная реакция на токсическое действие ионов ¿/-элементов за счет уменьшения соотношения поверхность/объем [13]. Возникновение ассоциатов и колониальных форм у прокариот может быть ответом на изменение состава внешней среды. При этом обеспечивается механизм защиты от воздействия токсических соединений либо по пути уменьшения соотношения поверхность/объем (рис. 5, 2 - например, образование спор) либо за счет псевдомногоклеточности - создания защитного слоя клеток или внеклеточных выделений (рис. 5, 3). Сдвиг равновесия у прокариот одиночная клетка«-»колония в сторону колонеобразования может играть очень интригующую роль в вопросах патогенеза возбудителей инфекционных заболеваний, таких как возникновения лекарственной устойчивости или неэффективности клеточного и гуморального иммунитета. Кроме того, ложная многоклеточность у прокариот может (конвергентно к эукариотам) использоваться для обеспечения устойчивости бактериальных популяций в природных биогеоценозах. Следует отметить, что путь 1 на рис. 5 с увеличением линейных размеров до 1 порядка(например, образование гигантских дрожжевых клеток) вероятно присущ только эукариотической клетке [2].
Литература
1. Сыроешкин Л.В., Гребенникова Т.В., Байкова В.Н., Ковалева А.А., Лебедев И.М., Бикетов С.Ф., Плете-нева ТВ. Новый подход в исследовании патофизиологии клетки: изучение распределения клеток по размерам форме как метод диагностики и мониторинга заболеваний. Клиническая лабораторная диагностика. 2001. (принята в печать).
2. Сыроешкин А.В., Синюк Т.Ф., Лебедев И.М., Плетенева Т.В.. Кирьянов С.В. Изучение антагонизма в токсическом действии ионов меди и цинка в водных растворах. Метеорология и гидрология. 2000;10:55-61. http://mie. тесот. ru/mie/AnnotlOO-1 lann7r.html
3. Плетенев С.С., Сыроешкин А.В., Гребенникова ТВ., Плетенева ТВ. Способ диагностики заболеваний по размерам и форме клеток. Патентная заявка РФ № 99125492 от 08.12.1999, решение ФИПС Роспатента о выдаче патента на изобретение от 17.08.2001
4. Сыроешкин А.В., Гребенникова Т.В., Глущенко Н.Н. Колониальные формы прокариот как проблема инфекционной патологии. Патофизиология и современная медицина / Материалы научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора С.М. Павленко. М.: Изд-во РУДН, 2000,: 193-195.
5. Сыроешкин А.В., Плетенева Г.В., Гребенникова Т.В., Березинская Т.Л., Глущенко Н.Н. Образование ассоциатов и колоний у прокариот как ответ на изменение состава окружающей среды. Материалы X международного симпозиума "Эколого-физиологические проблемы адаптации”. М.: Изд-во РУДН, 2001,: 513-514.
6. Туберкулез, под ред. А.Г. Хоменко. - М. Медицина. 1992. 312 с.
7. Connell N.D. Mycobacterium: isolation, maintenance, transformation, and mutant selection. Methods Cell Biol. 1994;45:107-125.
8. Grange J.M. The biology of the genus Mycobacterium. Soc. Appl. Bacteriol. Symp. Ser.1996; 25:1S-9S.
9. Hasan Z., Schlax C., Kuhn L., Lejkovits /., Young D., Thole J., Pieters J. Isolation and characterization of the micobacterial phagosome: ségrégation from endosomal/lysosomal path way. Mol. Microb.1997; 24(3):545-553.
10. McKinney J.D., Honer zu Bentrup K., Munoz-Elias EJ., Miczak A., Chen B., Chan W.T., Swenson D., Sac-chettiniJ.C., Jacobs W.R. Jr., Russell D. Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase. Nature.2000; 406:735-738.
11. Moulding TS. Need to define colonial morphology of M. aw«m-intracellularc when reporting susceptibility test results. Tubercle. 1983; 64(2):142-143.
12. Иванов П.Л. Происхождение многоклеточных животных. М.: Наука, 1962.,407 с.
13. A.V. Syroeshkin, T.V. Pleteneva, S. V. Kirianov. The combined action of zinc (II) and copper (II) ions: effect of antagonism on yesat culture S. cerevisiae// PBA 2000. 1 l'b International Symposium om Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Mayl 14-18. Basel, Switzerland. P098. P.120.
PROCARIOT COLONIES FORMATION AS QUESTIONS PROBLEM OF AN INFECTIOUS PATHOLOGY
A.V. SYROESHKIN
State Oceanographic Institute, Laboratory of Applied Hydrochemistry T.V. GREBENNIKOVA Institute of Virology, R&D "Narvak". Moscow, 123098. Gamalei str.16 T.L. BEREZYNSKAYA State Oceanographic Institute, Laboratory of Applied Hydrochemistry.
Moscow, 119999. Kropotkinsky I. 6 T.V. PLETENEVA, N.N. GLUSCHENKO
Department of pharmaceutical and toxicological chemistry RPFU. Moscow. 117198.
M-Maklaya st 8. Medical faculty A.V. AVETISYAN
Belozersky Institute of Physicochemical Biology. Moscow 119899. Vorobjoxy gory.
S.F. BIKETOV Institute of Applied Microbiology.
It has been observed that the most of share of total volume from suspensions of cell cultures of Bacillus subtillus, Escherichia coli and Mycobacteria tuberculosis is associates and colonies. This has been showed by data of volume and number distributions using laser diffraction. The classification for psudomulticellular prokaryotes has been suggested: 1) Reversible adhesive blending of cells, depend on cell’s concentration. This mechanism have been found out in culture B. subtillis. 2) Ligand-dependent formation of temporary colony in consequence of noncompleted division of cells. This mechanism have been found out in cultures B. subtillus and E. coli. The share of cytoplasm volume of the colonial forms from total volume was 50 % for B. subtillus and 20-90 % for E. coli (depending on strain). 3). Genetic-depending (dependent on species) colonies formation differ from subpopulations. This mechanism has been found in E. coli and mycobacterial cultures. The role of the colonial forms in noncffectivity of cell’s immunity and in formation of drug resistance have been discussed.
Key words: prokaryote colonies, size and volume distributions, mycobacteria.
