Ядерно-цитоплазматическое созревание ооцитов Sus Scrofa Domesticus в условиях сверхнизких температур

Татьяна Ивановна Кузьмина

УДК 636.2.57.089.38 Код ВАК 4.2.1 DOI: 10.32417/1997-4868-2023-23-12-83-93

Ядерно-цитоплазматическое созревание ооцитов Sus Scrofa Domesticus в условиях сверхнизких температур

Т. И. Кузьмина^

Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения животных -филиал Федерального исследовательского центра животноводства -ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста, Санкт-Петербург, Россия

нE-mail: prof.kouzmina@mail.ru

Аннотация. Витрификация женских гамет - важнейший инструмент для решения стратегических задач клеточных репродуктивных технологий в животноводстве, ветеринарии, биомедицине: тиражирование элитных особей (клонирование, трансгенез), сохранение биоразнообразия, ксенотрансплантация органов и др. Цель настоящего исследования - оценить показатели ядерно-цитоплазматического созревания (статус хроматина и митохондриальную активность) и компетенции к развитию донорских ооцитов свиней, подвергшихся интра- (ИОВ) или экстраовариальной (ЭОВ) витрификации. Методы. Донорские ооциты свиней (в возрасте 6-8 месяцев) витрифицировали экстра- или интраовариально с использованием криопротекторных агентов (диметилсульфоксид, этиленгликоль, трегалоза, сахароза). Состав криопротекторных агентов дополняли 0,001 % наночастицами ВДК (нВДК), Оттаивали ооциты в растворах трегалозы в ТС-199 с 10 % фетальной бычьей сыворотки ФБС. Ооциты культивировали 44 часа в средах, дополненных клетками гранулезы (106 клеток на 1 мл среды) и/или 0,001 % нВДК при 38.5 °C, в атмосфере 5 % СО2. Оплодотворение in vitro проводили в соответствии с рекомендациями, представленными нами ранее [17, с. 17]. Функциональную активность митохондрий и статус хроматина в ооцитах оценивали методом двойного окрашивания (красители MitoTracker Orange CMTMRos и Hoechst 33258). Результаты. Процент созревших ооцитов при совместном использовании в составе среды для культивирования нВДК и клеток гранулезы составил 61 % при ЭОВ и 29 % при ИОВ, а уровень дробящихся эмбрионов при ЭОВ был на 11 % (31 % против 20 %, Р < 0,05) выше, чем при ИОВ. Максимальные показатели функциональной активности митохондрий среди девитрифицированных ооцитов были отмечены в группе ЭОВ ооцитов, прокультивированных в средах, дополненных нВДК и клетками гранулезы (152 ± 14,9 мкА). Научная новизна. Модернизированы протоколы интра- и экстровариальной витрификации ооцитов свиней, позволяющие значительно увеличить показатели фертильности девитрифицированных гамет путем введения в состав криопротекторных агентов нВДК и кокультивирования девитрифицированных ооцитов в средах с нВДК и клетками гранулезы.

Ключевые слова: ооцит, эмбрион, мейоз, митохондрии, интра- и экстраовариальная витрификация, свинья.

Для цитирования: Кузьмина Т. И. Ядерно-цитоплазматическое созревание ооцитов Sus Scrofa Domesticus в условиях сверхнизких температур // Аграрный вестник Урала. 2023. Т. 23, № 12. С. 83-93. DOI: 10.32417/1997-4868-2023-23-12-83-93.

Дата поступления статьи: 28.05.2023, дата рецензирования: 17.06.2023, дата принятия: 23.10.2023.

CTQ

a ¡=

b

h-i«

О

г+

п>

0 b ¡3

1

CTQ h-

п>

сл

Nuclear cytoplasmic maturation of Sus Scrofa Domesticus oocytes at ultralow temperatures k

z

T. I. Kuzmina^ g

All-Russian Research Institute of Genetics and Breeding of Farm Animals - a branch of the Federal a Research Center for Animal Husbandry - VIZH named after Academician L. K. Ernst, Saint .

Petersburg, Russia

3E-mail: prof.kouzmina@mail.ru

Abstract. Vitrification of female gametes is the most important tool for solving the strategic tasks of cellular reproductive technologies in animal husbandry, veterinary medicine and biomedicine: replication of elite individuals (cloning, transgenesis), biodiversity conservation, organ xenotransplantation. The aim of this study was to evaluate the parameters of nuclear cytoplasmic maturation (chromatin status and mitochondrial activity) and developmental competence of donor porcine oocytes subjected to intra- (IOV) or extra-ovarian (EOV) vitrification and cultured in various maturation systems. Methods. Donor pig oocytes (6-8 months old) were vitrified extra-or intraovarially using cryoprotective agents (DMSO, ethylene glycol, trehalose, sucrose). The composition of cryoprotective agents was supplemented with 0.001 % highly dispersed silica nanoparticles (HDSns). Oocytes were thawed in trehalose solutions in TS-199 with 10 % of fetal bovine serum (FBS). Oocytes were cultured for 44 hours in media supplemented with granulosa cells (106 cells per ml of medium) and/or 0.001% of HDSns at 38.5 °C, in an atmosphere of 5 % CO2. Fertilization in vitro was carried out in accordance with the recommendations presented by us earlier [17. p. 17]. The functional activity of mitochondria and the status of chromatin in oocytes were assessed by double staining using MitoTracker Orange CMTMRos and Hoechst 33258 dyes. Results. The level of matured oocytes was 61 % at EOV and 29 % at IOV, and the level of cleavage embryos in EOV was in 11 % (31 % vs. 20 %, P < 0.05) higher than at IOV when HDSns with granulosa cells were added in culture media. The maximum indicators of the functional activity of mitochondria among devitrified oocytes were in the group of EOV oocytes have cultured in media supplemented with HDSns and granulosa cells (152 ± 14.9 ^A). Scientific novelty. The protocols for intra- and extra-ovarian vitrification of porcine oocytes have been modernized. Addition to cryoprotective agents and culture media of HDSns and co-culture of devitrified oocytes with granulosa cells significantly increased the fertility rates of devitrified gametes.

Keywords: oocyte, embryo, meiosis, mitochondria, intra- and extra-ovarian vitrification, pig.

For citation: Kuzmina T. I. Yaderno-tsitoplazmaticheskoe sozrevanie ootsitov Sus Scrofa Domesticus v usloviyakh sverkhnizkikh temperatur [Nuclear cytoplasmic maturation of Sus Scrofa Domesticus oocytes at ultralow temperatures] // Agrarian Bulletin of the Urals. 2023. Vol. 23, No. 12. Pp. 83-93. DOI: 10.32417/1997-4868-202323-12-83-93. (In Russian.)

Date ofpaper submission: 28.05.2023, date of review: 17.06.2023, date of acceptance: 23.10.2023.

Постановка проблемы (Introduction)

Интенсификация внедрения инновационных клеточных репродуктивных технологий в практику животноводства, ветеринарию, биомедицину, сохранение исчезающих видов и пород обуславливает необходимость создания криобанков женских репродуктивных клеток и тканей животных [1, с. 132]. Производство эмбрионов свиней in vitro имеет большое значение не только для понимания биологических процессов функционирования организма, получения высокопродуктивных животных, но и для производства трансгенных свиней с целью создания моделей для изучения различных заболеваний и для ксенотрансплантации органов [2, с. 113; 3, с. 2]. Sus Scrofa Domesticus - важная экспериментальная модель, поскольку этот вид имеет анатомическое, биохимическое и эндокринное сходство с Homo sapiens [3, с. 2]. Витрификация ооцитов - перспективный метод для вспомогательных репродуктивных технологий у человека, имеющий большой потенциал о для бессрочного хранения женских гамет у сельско-2 хозяйственных и домашних животных, исчезающих S видов [4, с. 2; 5, с. 1]. Успешная криоконсервация ^ ооцитов млекопитающих оказалась очень сложной я задачей из-за морфологических и физиологических S характеристик этих самых больших клеток в орга-^ низме животного [6, с. 205]. Ооциты чувствитель-

^ ны, в первую очередь, к охлаждению из-за высокого

Q

содержания воды, большого размера и уникальной клеточной структуры. Витрификация в основном используется для криоконсервации женских гамет [7, с. 88]. Эта техника позволяет поддерживать жизнеспособность, функционирование клеточных ком-партментов и потенциал развития ооцита при низких температурах в жидком азоте (при температуре 196 °С). Воздействие криопротекторов и очень быстрое охлаждение вызывают деструктивные морфологические и молекулярные изменения в ооците и его органеллах, что в итоге приводит к снижению показателей фертильности девитрифицированных женских гамет [8, с. 16]. Несмотря на несомненный прогресс, показатели успеха, измеряемые количеством жизнеспособных бластоцист, полученных из девитрифицированных женских гамет животных, незначительны [9, с. 168]. Ключевыми факторами, определяющими прогресс в совершенствовании технологии витрификации женских гамет, являются разработка модели витрификации (интра- или экстраовариальная), состав криопротекторных агентов, стадия мейоза ооцита. Использующиеся в настоящее время криопротекторы, которые призваны обеспечить защиту клеток при охлаждении и нагревании, зачастую неэффективны, поскольку токсичны и снижают жизнеспособность ооцитов в результате нарушения структуры клеточного цито-скелета, целостности хроматина [10, с. 7]. Модерни-

зация состава криопротекторных сред - актуальная задача эмбрио- и криотехнологов. Использование в технологии витрификации и экстракорпорального созревания женских гамет сельскохозяйственных животных наночастиц высокодисперсного кремнезема базируется на антиоксидантных свойствах последних, что позволяет снизить негативные последствия деструктивных эффектов сверхнизких температур [11, с. 24; 12, с. 5; 13, с. 778] на функционирование интрацеллюлярных компартментов ооцита. In vivo яйцеклетка формируется в микроокружении фолликулярных клеток (гранулеза, кумулюс), функциональная активность которых детерминирует завершение процессов ядерно-цитоплазматического созревания гаметы. Целостность клеток кумулюса, их коммуникации с ооцитом обеспечивает физиологические процессы, определяющие реиинициа-цию и прохождение мейоза [14, с. 2]. Ранее в наших исследованиях показан позитивный эффект системы экстракорпорального созревания нативных женских гамет Sus Scrofa Domesticus, составляющими которой являлись наночастицы высокодисперсного кремнезема и клетки гранулезы, на показатели фер-тильности ооцитов in vitro [15, с. 238]. В настоящем исследовании проанализированы эффекты сверхнизких температур на показатели жизнеспособности ооцитов свиней в условиях воздействия ультранизких температур.

Цель исследования - оценить показатели ядер-но-цитоплазматического созревания (статус хроматина и митохондриальную активность) и компетенции к развитию донорских ооцитов свиней, подвергшихся интра- или экстраовариальной ви-трификации и прокультивированных в различных системах созревания.

Методология и методы исследования (Methods)

В исследовании использовали постмортальные яичники свиней (Sus Scrofa Domesticus) породы ландрас в возрасте 6-8 месяцев. После овариоэкто-

Рис. 1. Ооцит-кумулюсные комплексы Sus Scrofa Domesticus (увеличение х40) Fig. 1. Oocyte-cumulus complexes of Sus Scrofa Domesticus (magnification x40)

мии яичники, помещенные в термос (температура 30-38 °С) в 0,9-процентный раствор NaCl с антибиотиками (100 МЕ/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 0,25 нг/мл амфотерицина B) доставляли с бойни Мясоперерабатывающего комбината «Тос-ненский» в лабораторию (время транспортировки -40 минут) и ранжировали в соответствии со стадией овариального цикла. Для экстраовариальной витрификации использовали ооцит-кумулюсные комплексы, извлеченные из фолликулов яичников на стадии фолликулярного роста, с высоким турго-ром, обширной сетью капилляров, размером 3-6 мм (рис. 1).

До помещения ооцит-кумулюсных комплексов в криопротекторные среды гаметы подвергали морфологической оценке с учетом следующих показателей: морфология клеток кумулюса (количество слоев и степень экспансии); целостность оо-цит-кумулюсных коммуникаций и оболочки ооци-та, ширина зоны пеллюцида; структура ооплазмы (гомогенная, гетерогенная, наличие инклюзивных свободноплавающих телец). Только ооциты с равномерной по ширине зоной пеллюцида, гомогенной ооплазмой, окруженные плотным кумулюсом (не менее чем 5-6 слоев), подвергали процедуре витрификации. Отобранные для экстраовариальной витрификации ооцит-кумулюсные комплексы поэтапно обрабатывали растворами криопротектор-ных агентов (КПА), которые готовили на ТС-199 с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС, HyClone, Великобритания). Состав КПА: КПА-1 - 0,7 M диметилсульфоксид (DMSO) и 0,9 M этиленгликоль (EG); КПА-2 - 1,4 M DMSO и 1,8 M EG; КПА-3 - 2,8 M DMSO, 3,6 M EG и 0,65 M трега-лоза (Trehalose). Растворы КПА для витрификации ооцитов дополняли 0,001 % наночастицами ВДК (нВДК, размер 4-17 нм), синтезированных в ИХП им. А. А. Чуйко НАН Украины путем высокотемпературного гидролиза. НВДК использовали в виде стабильной суспензии, состоящей преимущественно из субмикронных агрегатов. При выборе концентрации руководствовались указаниями разработчиков и результатами проведенной нами ранее серии экспериментов по влиянию наночастиц ВДК на функционирование репродуктивных клеток сельскохозяйственных животных [15, с. 238; 16, с. 165]. Длительность пребывания ооцит-кумулюсных комплексов в КПА составляла 30 с в КПА-1, затем 30 с в КПА-2 и 20 с в КПА-3. После обработки кри-опротекторами пайеты с ОКК помещали в сосуды Дьюара с жидким азотом, где они находились не менее 3 часов. Оттаивание ОКК проводили, последовательно помещая их в 0,25 М раствор трегало-зы в ТС-199 с 10 % ФБС (3 мин., 37 °С), затем в 0,19 М раствор трегалозы (3 мин., 37 °С) и 0,125 М раствор трегалозы (3 мин., 37 °С). Отмыв клеток проводили трижды в ТС-199 с 10 % ФБС. При ин-

Crq

a t¡ Сь

b hO

Г+

n>

0 b t¡

1

CTQ h-

n>

СЛ

s s

(-4

о к о к

и

<и н о S

VO

s «

s

(-4

о R О

s IQ

траовариальной витрификации препарированные яичники делили на 6-8 секций (15 х 20 мм), помещали в стерильные марлевые мешочки и опускали поэтапно в растворы КПА, приготовленные на основе фосфатного буферного раствора Дюльбекко (ФБР) с добавлением 20 % ФБС: КПА-1 - 7,5 % ЭГ + 7,5 % ДМСО (15 мин.), затем в КПА-2 - 15 % ЭГ, 15 % ДМСО и 0,5 М сахарозы (2 мин.). Стерильные марлевые мешочки с фрагментами яичников погружали в сосуды Дьюара с жидким азотом (-196 °С) не менее чем на 3 ч. Аспирированные из оттаявших в ФБР фрагментов (экспозиция 3 мин. при температуре 37 °С) ооциты последовательно обрабатывали 0,5 М (1 мин.) и 0,25 М (5 мин.) растворами трега-лозы, приготовленными на основе ФБР с 20 % ФБС. Клетки отмывали от трегалозы трижды в ТС-199 с 10 % ФБС.

Перспективные к созреванию in vitro после морфологической оценки девитрифицированные ОКК (40-50 шт.) помещали в капли (объемом 500 мкл) сред для созревания следующего состава:

1. Контроль - среда North Carolina State University-23 (NCSU-23) + 10 % фолликулярной жидкости (из фолликулов диаметром 3-6 мм), 10 МЕ хорионического гонадотропина человека, 10 МЕ хорионического гонадотропина лошади + 50 мкг/мл гентамицина.

2. Контроль + 0,001 % нВДК.

3. Контроль + клетки гранулезы (106 клеток на 1 мл среды).

4. Контроль + 0,001 % нВДК + клетки гранулезы (106 клеток на 1 мл среды).

Через 22 ч проводили смену сред с исключением во всех исследуемых группах гормональных добавок и последующим культивированием еще в течение 22 ч при температуре 38,5 °C, в атмосфере 5 % СО2.

Оплодотворение in vitro проводили в модифицированной среде mTBM, содержащей 113,1 мМ NaCl, 3,0 мМ KCl, 7,5 мМ CaCl2 • 2H2O, 20,0 мМ Трис, 11,0 мМ глюкозы, 5,0 мМ натрия пирувата, 1 мМ кофеина и 0,1 % BSA. После 44 ч культивирования ооциты очищали от клеток кумулюса. Затем в количестве 10 шт. помещали в капли среды mTBM (объемом 90 мкл под парафиновым маслом) в 35 мм чашки для культивирования на 30 мин. в СО2-инкубатор для эквилибрации. Оплодотворяли ооциты нативной спермой (исходная концентрация в разбавителе 3 х 109 сперматозоидов на 1 мл). После трехкратного центрифугирования 10 мл суспензии сперматозоидов (80 г в течение 3 мин. при комнатной температуре) осадок ресуспендировали в 10 мл DPBS с 0,1 % BSA и доводили концентрацию сперматозоидов до 2 106 кл/мл. 16 мкл суспензии сперматозоидов добавляли в капли с ооцитами объемом 90 мкл и культивировали в СО2-инкубаторе при 38,5 °С в атмосфере 5 % CO2 и 90 % влажности.

Через 6 ч после инкубирования со сперматозоидами ооциты были перенесены в 500 мкл среды NCSU-23 с 0,4 % BSA для культивирования в С02-инкубаторе в течение 7 дней при температуре 38.5 °C в атмосфере 5 % O2, 5 % CO2 и 90 % N2 со сменой среды через каждые 48 ч культивирования.

Функциональную активность митохондрий и статус хроматина в ооцитах оценивали методом двойного окрашивания с использованием красителей MitoTracker Orange CMTMRos (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) и Hoechst 33258 (2,5 мкг/мл, Thermo Fisher Scientific, Великобритания), описанных нами ранее [17, с. 22].

Реагенты, использованные в экспериментах, за исключением обозначенных в тексте статьи, производства компании Sigma-Aldrich (СШA), пластиковая лабораторная посуда - BD Falcon™ (Becton Dickinson and Co., BD Biosciences, СШA).

Результаты обрабатывали с использованием статистической программы Sigma Stat (Jandel Scientific Software, СШA). Для оценки достоверности переменных частотных значений использовали критерий X2 Пирсона и /-критерий Стьюдента. Значимость различий сравниваемых значений оценивали при следующих уровнях: р < 0,05, р < 0,01 и р < 0,001 для трех независимых экспериментов.

Результаты (Results)

Яйцеклетка животного формируется in vivo из ооцита, завершившего фазу роста, реиницииро-вавшего и завершившего мейоз в антральном фолликуле с вовлечением в вышеуказанные процессы клеток кумулюса и гранулезы. Фертильность гамет оценивается их компетентностью к завершению мейоза (ядерно-цитоплазматическое созревание) и развитием из них биологически полноценных эмбрионов. Наши эксперименты были направлены на моделирование состава сред для созревания ооци-тов свиней, подвергшихся интра- или экстраовари-альной витрификации. С учетом полученных ранее результатов о позитивном влиянии наночастиц хитозана и высокодисперсного кремнезема и роли клеток гранулезы в выше обозначенных эффектах [15, с. 348; 18, с. 349] цель исследования заключалась в идентификации особенностей функционирования структурных компонентов женских гамет после их экстра- или интраовариальной витрифика-ции и культивирования в средах совместно с клетками гранулезы и нВДК. В наших экспериментах проанализированы показатели ядерного созревания (рис. 2) и функциональной активности митохондрий (интенсивность флуоресценции красителя MitoTracker Orange CMTMRos) в нативных и деви-трифицированных ооцитах свиней (рис. 3).

Всего 1166 ооцитов подверглось цитологическому анализу. Результаты оценки статуса хроматина гамет представлены на рис. 4. Лучшие результаты получены во всех экспериментальных группах,

Jt*

Рис. 2. Репрезентативное изображение хроматина ооцита на стадии метафазы II в девитрифицированном ооците Sus Scrofa Domesticus (окраска Hoechst 33258, увеличение х400) Fig. 2. Representative image of oocyte chromatin at the metaphase II stage in a devitrified Sus Scrofa Domesticus oocyte (Hoechst 33258 stain, magnification x400)

Рис. 3. Репрезентативное изображение митохондрий в девитрифицированном ооцитех Sus Scrofa Domesticus на стадии метафазы II (окраска флуоресцентным зондом MitoTracker Orange MTMRos, увеличение х400) Fig. 3. Representative image of mitochondria in devitrified Sus Scrofa Domesticus oocytes at metaphase II stage (staining with a MitoTracker Orange MTMRos fluorescent probe, magnification х400)

щ

ft

M

О

«

Я ?

о

■■J

s

и

контроль нВДК гранулеза гранулеза + нВДК

l

0

20

80

100

40 60

% созревших ооцитов

■ Нативные ооциты ■ Экстраовариальная ■ Интраовариальная

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Рис. 4. Ядерное созревание в нашивных и девитрифицированных (экстра- или интраовариально) ооцитах свиней после культивирования в различных системах (время культивирования - 44 ч, количество ооцитов - 1166, число экспериментов - 5), с:Ь с:а,)-',):а, '■>•, 1:к: Ь:а '■■*, к^ ар < 0,001, ккР < 0,005, &Р < 0,01, с1Р < 0,005, x2-test

Control

HDSns

Granulosa

И»

н68

—

85

н 75

щщ

л89

10

20

60

70

80

90

100

30 40 50 % matured oocytes

MNative oocytes UExtraovarian Intraovarian

Fig. 4. Nuclear maturation of native and devitrified (extra- or intra-ovarian) porcine oocytes after culture in various systems (culture time - 44 hours, number of oocytes - 1166, number of experiments - 5),c:b c:a,f:e,f:d i:h i:g l:k b:a e:d h:g t:j a:i P < 0.001, b:kP < 0.005, i < 0.01, c:lP < 0.005, x2-test

где после оттаивания ооциты культивировали совместно с клетками гранулезы и нВДК. Так, более половины ооцитов, витрифицированных экстрао-вариально (61 %), достигли завершающей стадии созревания (метафаза II), при интраовариальной витрификации доля созревших клеток была 29 %, при этом данные показатели оказались достоверно ниже процента завершающих свое созревание на-

ero y

a 3

b

h-»♦

O

Г+

05

0 b

1

CfQ h-

05 СЛ

тивных клеток (89 %, Р < 0,001) (рис. 4). В целом введение в протоколы культивирования как отдельно нВДК или клеток гранулезы, так и совместное их использование при экстракорпоральном созревании значительно повысило показатели криорезистент-ности хроматина ооцитов. При этом максимальный позитивный эффект отмечен при их совместном использовании.

a

c

d

g

? Granulosa + HDSns

s

S

о

о к

и

<и н о S ю

S «

S

о

о S

т

S S S

я

а

S

■е

S

а

н =

в -

-

о

ч:

о

Нативные ооциты

Экстраовариальная

Интраовариальная

0 100 200 300 400 500

Интенсивность флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos ( цА)

Контроль (К) К + 0,001 % нВДК I К + гранулеза "К + гранулеза + 0,001 % нВДК

Рис. 5. Интенсивность флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos (мкА) в ооцитах, прокультивированных в различных системах после интра- или экстраовариальной витрификации (время культивирования - 22 ч, количество ооцитов - 367, число экспериментов - 3),a:b■a:d■a:e■c:d■ c:>-c:f d:f drd:ke:f■e'xn:o■ j:kP < 0,05,a:rh:f h:rh:kceP < 0,01,a:fa:k■a:lam

>, d:nd:oe-.ie:m,e:n,etfifimfafvjir.mj:n,klk:m,k:n,k:op < 0,001, t-критерий Стьюдента

a:n, a:o, b:l, b:m, b:n, b:o, c:k,c:l, c:m, c:n, c:o, d:l, d:m

3

ja

s ,<a

а &

£

Native oocytes

Extraovarian

Intraovarian

0 100 200 300 400 500

Интенсивность флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos (pA)

I Control I Control + 0.001 %HDSns

Control + Granulosa ■ Control + Granulosa + 0.001 % HDSns

Fig. 5. Fluorescence intensity of MitoTracker Orange CMTMRos (pA) in oocytes cultured in different systems after intra- or extra-ovarian vitrification (time of culture - 22 h, number of oocytes - 367, number of experiments - 3),a:b■a:d•a:e•c:d• c:>-c:f d:f d:>-d:k•e:f

,e:k, n:o• j:k p < Q Q5 a:j• b:f, b:j• b:k• c:e p < Q Q} a:f, a:k• a:l,a:m• a:n• a:o• b:l• b:m• b:n• b:o• c:k,c:l• c:m• c:n• c:o• d:l• d:m• d:n• d:o• e:l• e:m,e:n• e:o,f:l, f:m,f:n, f:o,j:l, j:m,j:n• j:o• k :l• k:m,k:n• k:o

P < Q.QQ1, Student's t-test

В следующей серии экспериментов (рис. 5) оценивались показатели функциональной активности митохондрий. Митохондрии обеспечивают клетку аденозинтрифосфатом, необходимым для завершения мейотического созревания, особенности их функционирования - один из биомаркеров функционального состояния гаметы и ее качества [19, с. 696]. Уровень митохондриальной активности оценивали через 22 ч культивирования. В группе интраовариально витрифицированных ооцитов митохондриальный потенциал (в качестве маркера функциональной активности митохондрий использовали показатели интенсивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos в мкА) был значительно снижен по сравнению с ооцитами, витрифи-цированными экстраовариально (41 ± 1,1 мкА против 91 ± 8,3 мкА соответственно, Р < 0,05) (рис. 5). В группе нативных ооцитов показатель интен-

сивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos составил 290 ± 11,9 мкА. Максимальные показатели среди девитрифицированных ооцитов были отмечены в группе экстраовариально витрифицированных ооцитов, прокультивированных в средах, дополненных нВДК и клетками гранулезы (152 ± 14,9 мкА). Девитрифицированные ооциты всех экспериментальных групп отличались низкими показателями интенсивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos от таковой в группе нативных ооцитов.

Данные по оценке фертильности ооцитов представлены на рис. 6-8. Уровень дробления при ин-траовариальной витрификации в контрольной группе не превысил 1 %, совместное введение нВДК и клеток гранулезы в среду дозревания повысило вышеуказанный показатель до 21 %, в этой же группе 1 эмбрион достиг стадии поздней морулы (рис. 6).

a

а

в

s =

я в

о

a

M

о

ч: я

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

контроль

нВДК

гранулеза

s и

гранулеза + нВДК

0

10

н l

70 80

20 30 40 50 60 Доля раздробившихся клеток, %

■ Интраовариальная ■ Экстраовариальная I Нативные ооциты

Рис. 6. Выход раздробившихся клеток (%), развившихся из ооцитов, прокультивированных в различных системах после интра- или экстраовариальной витрификации (количество ооцитов - 1509, число экспериментов - 4),

Ь:<; Ь:в; 1:]; <:И р < 0 05' а ^ С' Ь:И; Ь:1; Ь:]; Ь:к; Ь:1; с:§; <:§; в:/;/:И ;И:1; к:1 р < 0 01' а а а:/; а:И; а:г; а:]; а:к; а:1; с:<; с:/; с:И; с:1; с:]; с:к; с:1; <:в; <:]; <:к; <1:1; в:И; в:1; в:]; е:к; е:1;

/:1 М/:к;/:1; £:И; £:]; £:к; £I; И:]; И:к; И:1; 1:1 р < 0,001, у^Ае^

3 «

в «

а.

§

о б

Control

HDSns

Granulosa

н i

-^g

-ik

Granulosa + HDSns

h

н l

60

70

80

CtQ У a

b

о

Г+

П>

0 b ¡3

1

СfQ h-

П)

СЛ

0 10 20 30 40 50 Embryo cleavage, %

Я Intraovarian ■ Extraovarian I Native oocytes

Fig. 6. Level of cleavage (%) of embryos developed from oocytes cultured in various systems after intra- or extra-ovarian vitrification (number of oocytes - 1509, number of experiments - 4),b:d; b:e; i:j;P < 0.05; a:g; b:c; b:h; b:i; b:j; b:k; b:l; c:g; d:g; e:f; f:h ;h:i; k:lP <

0 01' a:b; ad a:f a'h; a:'; a:J; a:k; a:l; c:d; c:f; c:h; c:i; c:j; c:k; c:l; d:e; d:i; d:j; d:k; d:l; e:h; e:i; e:j; e:k; e:l; f:I;f:j; f:k; f:l; g:h; g:i; g:j; g:k; g:l; h:j; h:k; h:l; i:lp < 0 001 y^-test

При добавлении в состав среды для культивирования интраовариально верифицированных ооцитов только гранулезных клеток достоверных различий в доле раздробившихся клеток не обнаружено. Положительный эффект (увеличение уровня дробления с 1 % до 11 %, Р < 0.01) выявлен также при дополнении состава культуральных сред интраова-риально верифицированных ооцитов нВДК.

Доля дробящихся клеток значительно увеличилась при использовании в системе дозревания экстраовариально верифицированных ооцитов с нВДК (3 % в контроле против 14 %, Р < 0,01) и при совместном использовании нВДК и клеток грануле-зы (3 % в контроле против 31 %, Р < 0,001).

Результаты анализа потенций раздробившихся „ „ .....,,

_ Рис. 7. Доимплантационные эмбрионы Sus Scrofa Domes-

зигот к развитию до доимплантадионных эмбрио- ticus (увеличение х100)

нов (рис. 7) представлены на рис. 8. Fig. 7. Pre-implantation embryos of Sus Scrofa Domesticus

(magnification x100)

a

e

s s

(-4

о к о к

и

<и н о S

VO

s «

s

(-4

о R О

s IQ

о

4 «

5

s U

контроль

нВДК

гранулеза

гранулеза + нВДК

10 20 30 40 50 60 Доля раздробившихся клеток, %

H l

70

80

I Интраовариальная

Экстраовариальная ■ Нативные ооциты

Рис. 8. Выход эмбрионов на стадиях поздней морулы и бластоцисты из ооцитов, прокультивированных в различных системах после интра- или экстраовариальной витрификации (количество ооцитов - 1509, число экспериментов - 4), т:г;т:* п:*; о:г;о:*; ч:г; ":х Р < 0,05;п:г; г:и;р:,: ,:"Р < 0,01; т:,: т:и; т:";т:щ т:х;п:,: п:и; п:";п:щп:х; °'Л; о:и; о:"; о:ж о:х;р:ш;р

рщ р:х; ч.и; «х; г.щ г.*; ,и; ,у; м; ,-.у; и*; и:х; «:хр < 0,001, X1-teSt

О

-о «

а

Control н e

HDSns

Granulosa

Granulosa + HDSns

h I

10 20 30 40 50 Embryo cleavage, %

60

70

80

^Intraovarian Extraovarian I Native oocytes

Fig. 8. Development of embryos from oocytes cultured in various systems after intra- or extra-ovarian vitrification (number of oocytes - 1509, number of experiments - 4), m:r; m:s; n:s; o:r; o:s; q:r; q:s; t:u; v:xP < 0.05;n:r; r:u;p:t; t:w P < 0.01; m:t; m:u; m:v; m:w; m:x; n:t; n:u;

nv n:w; n:x; o:t; o:u; o:v; o:w; o:x;p:u;p:v; p:w;p:x; q:t; q.u; q:v; qw; q:x; „; r:w; r:x; su; :; s:x; U,; t:x; u:x; w:x p < 0.001, f -test

Использование в системе дозревания совместно с соматическими клетками фолликула наночастиц высокодисперсного кремнезема благоприятно сказалось на формировании эмбрионов при пролонгированном культивировании. Так, уровень эмбрионов на стадиях поздней морулы и бластоцисты в группе, где развивались эмбрионы из экстраовари-ально витрифицированных ооцитов, созревших в присутствии клеток гранулезы и нВДК, составил 9 % (рис. 8).

Следует отметить, что работы по экстраовари-альной витрификации женских гамет свиней находятся на уровне исследовательских проектов и до сих пор, начиная с 2014 года [3, с. 6], когда японские исследователи получили живое потомство из витрифицированных на стадии зародышевого пузырька ооцитов свиней, выход эмбрионов на стадии поздней морулы и бластоцисты не превышает 5-7 %, при интраовариальной витрификации аналоги наших экспериментов отсутствуют. Анализ

полученных данных выявил четко выраженный положительный эффект совместного использования нВДК с клетками гранулезы в протоколах экстракорпорального созревания как нативных, так и девитрифицированных ооцитов. Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion) Создание криобанка донорских ооцитов животных - ключ к решению многих проблем, связанных с совершенствованием и повышением эффективности внедрения клеточных репродуктивных технологий в практику животноводства, ветеринарию, биомедицину. Витрификация незрелых ооцитов у животных позволит использовать большее количество гамет, т. к. яичники животных содержат огромное количество рекрутированных и «спящих» фолликулов с ооцитами на стадии диплотены. Для сохранения жизнеспособности витрифицирован-ных женских гамет животных криобиологами и эмбриологами разработаны криопротекторные агенты и предложены среды для культивирования ооцитов

0

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

0

разных видов животных, однако фертильность де-витрифицированных ооцитов и их компетентность к оплодотворению продолжает оставаться на низком уровне. Наши исследования были направлены на разработку сред для дозревания донорских оо-цитов, витрифицированных интра- или экстраова-риально. С учетом результатов выполненных ранее экспериментов, свидетельствующих о позитивном влиянии клеток гранулезы и наночастиц высокодисперсного кремнезема на показатели фертильности нативных свиных ооцитов, среды для созревания девитрифицированных ооцитов дополняли гранулезными клетками и нВДК. В своих исследованиях мы опирались на знания о характере деструктивных изменений на ооцит-кумулюсные взаимодействия и имеющиеся сведения о росте уровня генерации активных форм кислорода в клетках, подвергшихся обработке ультранизкими температурами. Полученные результаты свидетельствуют об увеличении доли ооцитов, реинициировавших и завершивших мейотическое созревание. Как известно, после де-витрификации процент денудированных ооцитов возрастает, а введение в систему дозревания клеток гранулезы (продуцентов целого комплекса биологически важных модуляторов формирования яйцеклетки), по-видимому, восполняет продукцию оставшихся после витрификации клеток кумулюса. Целесообразность превентивной обработки донорских ооцитов нВДК и их введение в состав культу-ральных сред мы обосновывали антиоксидантными свойствами нВДК и возможностью снижения ими температуры замораживания. При замораживании мембран митохондрий, истощенных по холестерину, фазово-структурные переходы липидов из жидкокристаллического в гель-состояние и их латеральное разделение охватывают весь липидный бислой. В области фазового перехода липидных молекул более упорядоченные области мембраны сосуществуют с разупорядоченными (жидкими), что ведет к фазовому разделению липидов и появлению трансмембранных дефектов. На фоне латерального разделения липидов возникает разупорядочивание белковых молекул, а позже их слияние в агрегированные структуры. Наночастицы высокодисперсно-

перехода липидов к более низким температурам (укорочение диапазона фазового перехода), что снижает степень сближения белков и образования белковых агрегатов. Также адсорбция наночастиц (отрицательно заряженных) на участках мембраны митохондрий (белках), имеющих пониженный заряд, возникающий при повышении концентрации солей и катионов (белки не несут никакого заряда, находятся близ своей изоэлектрической точки), приводит к электростатическому отталкиванию белковых структур друг от друга и торможению образования агрегатов. Наночастицы способствуют снижению степени открытия неспецифических митохондриальных пор, которые образуются как дефекты мембраны при криогенном окислительном стрессе, что является следствием торможения латерального разделения липидов.

Выявленные нами различия в интенсивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos (биомаркера функциональной активности митохондрий) в ооцитах в зависимости от способа их витрификации свидетельствуют о глубоких нарушениях в функционировании митохондрий гамет, подвергшихся интраовариальной витрификации, что привело к негативным результатам по получению из них эмбрионов.

В целом результаты сравнительного анализа показателей жизнеспособности донорских ооцитов, подвергшихся интра- или экстраовариальной ви-трификации и прокультивированных в различных системах созревания, выявили позитивный эффект превентивной инкубации (до витрификации) оо-цитов с нВДК и их введения совместно с клетками гранулезы в состав в культуральных и криопротек-торных сред на функциональную активность митохондрий и статус хроматина ооцитов. Вышесказанное позволяет рекомендовать разработанные протоколы интра- и экстраовариальной витрификации для криосохранения донорских ооцитов Sus Scrofa Domesticus.

Благодарности (Acknowledgments)

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (ГЗ № 0445-2021-0005).

OQ У a

b

h-i«

О

г+

п>

0 b

1

OQ h-

П)

СЛ

го кремнезема способствуют снижению фазового

Библиографический список

1. Шинкарецкая Г. Г. Генофонд животных: проблема исследования и сохранения // Образование и право. 2020. № 2. С. 128-137.

2. Romar R., Canovas S., Matas C., Gadea J., Coy P. Pig in vitro fertilization: where are we and where do we go? // Theriogenology. 2019. No. 137. Pp. 113-121.

3. Chen P. R., Uh K., Redel B. K., Reese E. D., Prather R. S., Lee K. Production of Pigs From Porcine Embryos Generated in vitro // Frontiers in Animal Science. 2022. Vol. 3. Article number 826324. DOI: 10.3389/ fanim.2022.826324.

4. Son W. Y., Henderson S., Cohen Y., Dahan M., Buckett W. Immature oocyte for fertility preservation // Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 2019. No. 10. Article number 464. DOI: 10.3389/fendo.2019.00464.

5. Tharasanit T., Thuwanut P. Oocyte cryopreservation in domestic animals and humans: principles, techniques and updatedoutcomes // Animals. 2021. Vol. 11. Pp. 2949. DOI: 10.3390/ani11102949.

s

S

(-4

о к о к

и

<и н о S

VO

S «

S

(-4

о R О S IQ

6. Fowler K. E., Mandawala A. A., Griffin D. K., Walling G. E., Harvey S. C. The production of pig preim-plantation embryos in vitro: current progress and future prospects // Reproductive Biology. 2018. Vol. 18 (3). Pp. 203-211.

7. Appeltant R., Somfai T., Kikuchi K. Faster, cheaper, defined and efficient vitrification for immature porcine oocytes through modification of exposure time, macromolecule source and temperature // Cryobiology. 2018. Vol. 85. Pp. 87-94.

8. Somfai T., Haraguchi S., Dang-Nguyen T. Q., Kaneko H., Kikuchi K. Vitrification of porcine immature oocytes and zygotes results in different levels of DNA damage which reflects developmental competence to the blastocyst stage // PLoS ONE. 2023. Vol. 18 (3). Article number e0282959. DOI: 10.1371/journal.pone.0282959

9. Casillas F. The Porcine Experimental Model for Oocyte Cryopreservation by Vitrification // AJBSR. 2020. Vol. 9 (2). Pp. 165-169.

10. López A., Betancourt M., Ducolomb Y., Rodríguez J. J., Casas E., Bonilla E., Bahena I., Retana-Márquez S., Juárez-Rojas L., Casillas F. DNA damage in cumulus cells generated after the vitrification of in vitro matured porcine oocytes and its impact on fertilization and embryo development // Porcine Health Management. 2021. Vol. 7 (1). DOI: 10.21203/rs.3.rs-441164/v1.

11. Савченко Д. С. Изучение антиоксидантных свойств нанокомпозита высокодисперсного кремнезема с наночастицами серебра // Медицина и образование в Сибири. 2013. № 6. С. 23-30.

12. Remiao M. H., Segatto N. V., Pohlmann A., Guterres S. S., Seixas F. K., Collares T. The potential of nanotechnology in medically assisted reproduction // Frontiers in Pharmacology. 2018. Vol. 8. DOI: 10.3389/ fphar.2017.00994.

13. Kuzmina T. I., Chistyakova I. V., Tatarskaya D. N. The influence of highly dispersed silica nanoparticles on the functional activity of mitochondria and chromatin state in native and devitrified Bos Taurus oocytes // Agricultural Biology. 2020. Vol. 55 (4). Pp. 784-793.

14. Casillas F., Ducolomb Y., López A., Betancourt M. Effect of porcine immature oocyte vitrification on oocyte-cumulus cell gap junctional intercellular communication // Porcine Health Management. 2020. Vol. 6 (1). DOI: 10.1186/s40813-020-00175-x.

15. Kuzmina T. I., Chistyakova I. V., Prituzhalova A. O., Tatarskaya D. N. The role of highly dispersed silica nanoparticles in the realization of the effects of granulosa on the maturation and fertilization competence of Sus scrofa domesticus oocytes // Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2022. Vol. 26 (3). Pp. 234-239.

16. Зюзюн А. Б., Щербак О. В., Осипчук О. С., Ковтун С. I., Дзщюк В. В. Застосування наноматерiалу в ембрюгенетичнш системi in vitro отримання ембрюшв свиней // Фактори експериментально! еволюци органiзмiв. 2015. Т. 17. С. 164-168.

17. Кузьмина Т. И., Альм Х., Торнер Х. Методы получения эмбрионов свиней in vitro: методические рекомендации. Санкт-Петербург, Пушкин: Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии, 2008. 38 c.

18. Roy P. K., Qamar A. Y., Fang X., Kim G., Bang S., Zoysa M., Shin S. T., Cho J. Chitosan nanoparticles enhance developmental competence of in vitro-matured porcine oocytes // Reproduction in Domestic Animals. 2020. Vol. 56 (2). Pp. 342-350.

19. Al-Zubaidi U., Liu J., Cinar O., Robker R. L., Adhikari D., Carroll J. The spatio-temporal dynamics of mitochondrial membrane potential during oocyte maturation // Molecular Human Reproduction. 2019. Vol. 25 (11). Pp. 695-705.

Об авторе:

Татьяна Ивановна Кузьмина, доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник, заведующая лабораторией биологии развития, ORCID 0000-0002-4218-6080, AuthorID 78163; +7 921 392-19-47, prof.kouzmina@mail.ru

Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения животных - филиал Федерального исследовательского центра животноводства - ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста, Санкт-Петербург, Россия

References

1. Shinkaretskaya G. G. Genofond zhivotnykh: problema issledovaniya i sokhraneniya [Animal gene pool: the problem of research and conservation] // Education and Law. 2020. No. 2. Pp. 128-137. (In Russian.)