CC BY
25
УДК 577.212.3:575.1 13.12
YABBY3-ортологи дикорастущих видов томата: структура, полиморфизм и экспрессия
М. А. Филюшин1*, М. А. Слугина1,2, А. В. Щенникова1, Е. З. Кочиева1,2
Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН,
119071, Москва, Ленинский просп., 33, стр. 2
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
кафедра биотехнологии, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
*E-mail: michel7753@mail.ru
Поступила в редакцию 24.04.2017
Принята к печати 17.10.2017
РЕФЕРАТ Эволюция генов, кодирующих факторы транскрипции семейства YABBY, считается одной из основных причин возникновения плоского листа из радиально-симметричного стебля и многообразия форм гинецея. Показано, что гены YABBY определяют идентичность абаксиальной поверхности всех наземных латеральных органов семенных растений. В настоящей работе клонированы и охарактеризованы полноразмерные последовательности генов, ортологичных YABBY3, у 13 образцов дикорастущих и культивируемых видов томата, отличающихся морфофизиологическими характеристиками листьев, цветков и плодов. Сравнительный анализ выявил высокую гомологию этих последовательностей с известным геном YABBY3 томата (95-99%). Гены-ортологи имели идентичную экзон-интронную структуру и содержали участки, кодирующие консервативные домены HMG-YABBY и Cys2Cys2-цинкового пальца. В этих генах выявлены 317 вариабельных сайтов, при этом 8 из 24 экзонспецифичных SNP приводили к аминокислотным заменам. Сравнительный анализ экспрессии генов YABBY3 в вегетативных и репродуктивных органах одного крас-ноплодного и трех зеленоплодных видов томата выявил некоторые межвидовые отличия в интенсивности экспрессии в листьях, бутонах и цветках.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА YABBY3, полиморфизм, РВ-ПЦР, Solanum секция Lycopersicon, адаксиально-абакси-альная асимметрия.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CRC - CRABS CLAW gene; INO - INNER NO OUTER gene; FIL - FILAMENTOUS FLOWER gene; РВ-ПЦР - ПЦР в реальном времени.
ВВЕДЕНИЕ
Все процессы роста и развития растений контролируются факторами транскрипции, эволюция которых является одной из основных причин морфологического многообразия в растительном царстве [1—4]. В то время как происхождение цветка и репродуктивных органов связывают с дупликацией и изменениями генов семейства MADS-факторов транскрипции [5, 6], возникновение плоского листа из радиально-симметричного стебля и разнообразие форм гинецея считают следствием эволюции генов, кодирующих факторы транскрипции семейства YABBY [7]. Присутствие этих генов у покрытосеменных и голосеменных растений и их отсутствие у мхов и плаунов [8-10] предполагает происхождение генов YABBY от одного или двух предшественников в последнем общем предке семенных растений [10-12]. Диверсификация генов YABBY привела к возникно-
вению отдельных членов семейства с уникальными функциями в развитии листьев, плодолистиков и семязачатков [8, 11, 13, 14]. Среди них гены YABBY2 и YABBY5, которые предположительно участвовали в эволюционной диверсификации морфологии столбика и тычиночной нити [15, 16]. Другие гены YABBY-семейства, INNER NO OUTER (INO) и CRABS CLAW (CRC), возникали, по-видимому, параллельно эволюции плодолистика и семязачатка в процессе модификации листоподобного репродуктивного спорофилла
[11, 17].
У двудольных и однодольных растений гены YABBY играют сходные роли в развитии листа и подобных ему органов, обусловливая их абаксиально-адаксиальную асимметрию, разрастание пластинки и определение границ листа [4, 10, 18]. Помимо этого, гены YABBY вовлечены в процессы образования таких органов цветка, как нектарники, плодолистики
и др. [19-21]. К настоящему времени механизм работы некоторых белков YABBY описан только у модельного растения Arabidopsis thaliana. Так показано, что YABBY1 (или FILAMENTOUS FLOWER, FIL), YABBY3 и YABBY5 совместно с другими компонентами транскрипционного комплекса поддерживают идентичность клеток адаксиальной поверхности листа, а также участвуют в инициации эмбриональной апикальной меристемы побега и ее постэмбриональном поддержании [22]. В активации экспрессии некоторых генов YABBY в нектарниках и плодолистиках принимают участие белки семейства MADS совместно с другими факторами [23]. В свою очередь, YABBY1 вместе с другими транскрипционными факторами контролирует пространственную активность MADS-генов и таким образом участвует в инициации закладки цветковых органов в правильном месте и количестве, определяя судьбу соответствующих клеток [24-26].
Гены YABBY кодируют небольшие белки (180-250 а.о.), состоящие из двух консервативных доменов [27, 28]. В N-концевой части белка находится мотив цинкового пальца Суз2Су52-типа, а на C-конце расположен домен YABBY.
Число генов YABBY в геномах растений варьирует. В геноме A. thaliana таких генов шесть, из которых четыре (YABBY1, YABBY2, YABBY3 и YABBY5) экспрессируются преимущественно в листьях и ли-стоподобных органах (семядоли, чашелистики, лепестки, тычинки и плодолистики), а два других (CRC и INO) - в отдельных репродуктивных органах цветка [10, 23, 27]. У риса Oryza sativa идентифицировано восемь генов, при этом у двух из них (OsYABBY2 и OsYABBY7) выявлено по два транскрипта, обра-
зованных в результате альтернативного сплайсинга [29].
У томата овощного (Solanum lycopersicum), одной из основных овощных культур, идентифицировано девять генов семейства YABBY (YABBY1, YABBY2, YABBY3, YABBY5a, YABBY5b, CRCa, CRCb, FAS, INO) [30, 31]. S. lycopersicum вместе с 12 дикорастущими родственными видами составляют секцию Lycopersicon рода Solanum [32]. Виды томата сильно различаются по морфофизиологическим характеристикам, включая морфологию листа и цветка. В зависимости от строения репродуктивной системы виды томата делятся на само- и перекрестноопыляемые, при этом последние отличаются большим полиморфизмом, крупными цветками и выступающим рыльцем пестика [32]. Известно, что система репродукции, находящаяся в зависимости от морфофизиологии цветка, а также различия в структуре листа могут быть следствием различной активности факторов транскрипции YABBY [7]. В первую очередь, это касается белков группы YABBY1/YABBY3, которые экспрессируются практически во всех асимметричных наземных органах растения.
Идентификация генов, ортологичных YABBY3, у дикорастущих видов томатов и оценка их полиморфизма стали целью данной работы. К настоящему времени полные последовательности гена YABBY3 известны только у двух видов томатов -S. lycopersicum и S. pennellii, а паттерны экспрессии этого гена определены только у S. lycopersicum [31] и S. pimpinellifolium [30]. Поэтому полученные нами данные, основанные на анализе большего количества видов томата, дополнят знания о генах YABBY и их возможных функциях.
Таблица 1. Образцы культивируемых и дикорастущих видов томата, использованных в работе
Вид/подвид/сорт Кат. № ВИР ^стема скрещивания Цвет зрелого плода
S. cheesmaniae (Riley) Fosberg 3969 Cамоопыляемый Красный
S. galapagense Darwin & Peralta 3970 Cамоопыляемый Красный
S. lycopersicum var. humboldtii (Willd.) Dunal 2912 Cамоопыляемый Красный
S. lycopersicum L., cv. Silvestre recordo 1580 Cамоопыляемый Красный
S. pimpinellifolium var. racemigerum (Lange) Brezhnev 1018 Cамоопыляемый Красный
S. chmielewskii (Rick, Kesicki, Fobes & Holle) Spooner, Anderson & Jansen 13725 Cамоопыляемый Зеленый
S. neorickii Spooner, Anderson & Jansen 5033 Cамоопыляемый Зеленый
S. arcanum Peralta 13958 Перекрестноопыляемый Зеленый
S. chilense (Dunal) Reiche 4300 Перекрестноопыляемый Зеленый
S. corneliomulleri Macbr. 4367 Перекрестноопыляемый Зеленый
S. habrochaites Knapp & Spooner 13964 Перекрестноопыляемый Зеленый
S. peruvianum L. 4361 Перекрестноопыляемый Зеленый
S. peruvianum var. dentatum (Dunal) Dunal 3966 Перекрестноопыляемый Зеленый
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для работы был сформирован набор из 13 образцов 11 видов томатов из коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова (ВИР). Исследуемые виды отличались как системой скрещивания, так и морфологическими характеристиками плода (табл. 1).
Растения выращивали из семян в теплице (8/16 ч -ночь/день; 23/28°C - ночь/день; интенсивность освещения - 300-400 мМ/м2). Геномную ДНК выделяли из листьев растений с помощью набора ZR-96 Plant/ Seed DNA Kit (Zymo research, Irvine, США). Спустя 5 недель после высадки растений в теплицу, как только началось формирование плодов, собирали одновременно с каждого растения образцы тканей листьев, молодых бутонов, открытых цветков и незрелых зеленых плодов в период с 9.00 до 12.00. Собранный материал немедленно замораживали и растирали в жидком азоте. Суммарную РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Германия). кДНК синтезировали с использованием набора GoScript (Promega, Madison, США).
На основе полных нуклеотидных последовательностей гена YABBY3 S. lycopersicum (GeneID:101247051) и S. pennellii (GeneID:107026918) были разработаны специфичные праймеры sYB3F 5'-AATCAAATCAATCACAAAARCAG-3' и sYB3R 5'-CACATTAATTGGTTAGACACTTA-3' для амплификации полноразмерных копий этого гена у исследуемых видов. Для секвенирования также были разработаны дополнительные внутренние прайме-ры sYB3ex2R 5'-ATTAGTGCAGTGTCCACATC-3' и sYB3ex4R 5'-TTGATGAATCGGTTGTAAGC-3'. Гены амплифицировали с использованием полиме-разы LongAmp® Hot Start Taq DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, США) в следующих условиях: исходная денатурация (10 мин, 94°C); 35 циклов денатурации (30 с, 94°C), отжига (30 с, 58°C) и синтеза (4 мин, 65°C); завершающий синтез (10 мин, 65°C). ПЦР-фрагменты очищали с помощью QIAEX® II Gel Extraction kit (QIAGEN, Hilden, Германия), клонировали в плазмидный вектор pGEMT-easy (Promega, Madison, США) и секвенировали с использованием систем BigDye и Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Waltham, США; ЦКП Биоинженерия).
Полученные последовательности выравнивали и анализировали с помощью программы MEGA 7.0 [33]. Для сравнительного анализа использовали известные полные последовательности гена YABBY3 двух видов томата (S. lycopersicum cv. Heinz (GeneID:101247051) и S. pennellii (GeneID:107026918)), картофеля S. tuberosum (GeneID:102577797) и A. thaliana (GeneID: 827914).
Положение нуклеотидных и аминокислотных замен определяли относительно последовательности S. lycopersicum cv. Heinz (GeneID:101247051). Структурные домены ортологов YABBY3 определяли с помощью программы NCBI-CDD (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi) и опубликованных данных [27, 28]. Для филогенетического анализа использовали известные последовательности генов, кДНК и белков семейства YABBY S. lycopersicum (SlYABBY1 (XM_004229745), SlY ABBY 2 (XM_00424 1 308), SlY ABBY 3 (XM_004245689), SlYABBY5a (XM_004242 730), SlYABBY5b (XM_004251674), SlFAS (NM_001247461), SlINO (XM_004239291), SlCRCa (XM_004238984), SlCRCb (XM_004228801)) и A. thaliana (AtYABBY1 (AF136538), AtYABBY2 (AF136539), AtYABBY3 (AF136540), AtYABBY5 (NM_179750), AtINO (AF195047), AtCRC (AF132606)). Анализ проводили с использованием пакета программ MEGA 7.0 методом Maximum Likelihood (ML), модели подбирали с помощью программы Modeltest. Возможное влияние аминокислотных замен на структуру и функции белков оценивали с помощью матрицы Грэнтсема [34] и программы PROVEAN [35]. Трехмерную структуру белков анализировали с использованием программы Phyre2 [36] и визуализировали посредством Chimera-1.11.2 (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/).
Экспрессию генов, ортологичных YABBY3, определяли в молодых листьях, молодых бутонах, открытых цветках и зеленых незрелых плодах методом количественной ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) с использованием набора «Реакционная смесь для проведения РВ-ПЦР в присутствии SYBR GreenI и ROX» (ООО «Синтол», Москва, Россия) на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США). Для проведения РВ-ПЦР использовали праймеры tY3rt1F 5'-GTCACACTTACTTCTCTCCTTCAC-3' и tY3rtR 5'-CAGGAGGTCTGTTAACAACGG-3'. Реакции проводили в двух биологических и трех технических повторах в следующих условиях: 95°C - 5 мин; 40 циклов (95°C - 15 с, 62°C - 50 с). Уровень относительной экспрессии оценивали с использованием гена CAC в качестве референсного [37]. Статистический анализ, включая оценку статистической значимости различий экспрессии в различных органах каждого исследуемого вида томата методом t-теста с коррекцией Велча (Unpaired t-test with Welch's correction) (табл. 3), проводили с помощью программы GraphPad Prism v. 7.02.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Полные последовательности генов, ортологичных YABBY3, определены у 13 образцов 11 видов томата
Таблица 2. Характеристика экзон-интронной структуры гена YABBY3 у исследуемых образцов
Вид/подвид/сорт Номер в NCBI Экзон-интронная структура YABBY3 Общая длина, п.н. К к и К Рч § Белок, а.о.
экзон I интронI экзон II интрон II экзон III интрон III экзонIV интронIV экзон V интрон V экзон VI интрон VI экзон VII
S. cheesmaniae KY952537 102 546 150 223 127 314 49 374 76 425 75 180 72 2713 651 216
S. galapagense KY952538 102 531 150 222 127 316 49 373 76 426 75 180 72 2699 651 216
S. lycopersicum cv. Heinz* ID:101247051 102 536 150 222 127 316 49 373 76 426 75 179 72 2703 651 216
S. lycopersicum var. humboldtii KY952544 102 538 150 221 127 313 49 373 76 427 75 180 72 2703 651 216
S. lycopersicum cv. Silvestre recordo KY952543 102 537 150 222 127 316 49 372 76 426 75 180 72 2704 651 216
S. pimpinellifolium var. racemigerum KY952549 102 537 150 222 127 316 49 373 76 426 75 180 72 2705 651 216
S. chmielewskii KY952540 102 537 150 222 127 314 49 371 76 426 75 180 72 2701 651 216
S. neorickii KY952545 102 469 153 218 127 313 49 376 76 426 75 166 72 2622 654 217
S. arcanum KY952547 111 530 150 228 127 316 49 374 76 426 75 166 72 2700 660 219
S. chilense KY952539 102 533 150 224 127 311 49 374 76 426 75 165 72 2684 651 216
S. corneliomulleri KY952541 111 535 150 227 127 314 49 361 76 425 75 166 72 2688 660 219
S. habrochaites KY952542 102 545 150 222 127 274 49 361 76 421 75 178 72 2652 651 216
S. pennelln* ID:107026918 102 522 144 222 127 312 49 372 76 414 75 179 72 2666 645 214
S. peruvianum KY952546 111 539 150 228 127 316 49 365 76 427 75 169 72 2704 660 219
S. peruvianum var. dentatum KY952548 111 485 150 221 127 312 49 374 76 426 75 180 72 2658 660 219
S. tuberosum* ID:102577797 114 552 147 271 127 314 49 398 76 417 75 175 72 2787 660 219
A. thaliana* ID:827914 102 97 138 101 151 93 49 119 76 136 99 440 81 1682 696 231
"Последовательности из базы данных NCBI.
(род Solanum секция Lycopersicon). Сравнительный анализ этих последовательностей выявил их высокую гомологию (идентичность 95-99%) с известным геном YABBY3 томата (ID: 101247051). Общая длина гена варьировала от 2622 п.н. у S. neorickii до 2713 п.н. у S. cheesmaniae. Гены состояли из семи экзонов и шести интронов (табл. 2) и содержали участки, кодирующие консервативные HMG-подобный домен YABBY (125-176 а.о.) и домен цинкового пальца Cys2Cys2-типа (18-62 а.о.) (рис. 1).
Размер кДНК YABBY3 в девяти анализируемых образцах, включая все красноплодные и три зелено-плодных (S. chmielewskii, S. chilense, S. habrochaites) вида, составил 651 п.н. (табл. 2). У S. neorickii размер кДНК составил 654 п.н., что обусловлено дупликацией TCA во втором экзоне (вставка в аминокислотной последовательности N66_H67insH). У S. arcanum, S. corneliomulleri, S. peruvianum и S. peruvianum var. dentatum - 660 п.н., благодаря вставке 9 п.н. в первом экзоне (P17_S18insPPP). У S. pennellii, который считается наиболее древним видом [32], размер кДНК 645 п.н. обусловлен делецией 6 п.н. во втором экзо-не (H67del, H68del). В соответствии с этим длина аминокислотных последовательностей ортологов YABBY3 составила 217 а.о. (S. neorickii), 219 а.о. (S. arcanum, S. corneliomulleri, S. peruvianum и S. peruvianum var. dentatum) и 216 а.о. (остальные образцы). Интересно, что из ранее описанных консервативных мотивов, характерных для белков YABBY1/3, у ор-тологов YABBY3 видов рода Solanum присутствуют кладоспецифичные мотивы FIL-A, -D, -E, -F и -G, но отсутствуют FIL-B и -C, обычно локализованные в междоменной области [12] (рис. 1).
В сравнении с ранее охарактеризованным YABBY3 сорта Heinz S. lycopersicum (ID: 101247051) в генах YABBY3 исследуемых образцов выявлено 317 вариабельных сайтов, большей частью локализованных в интронах. В экзонах выявлены 24 замены, из которых восемь несинонимичные. Обнаруженные в кДНК замены локализуются преимущественно в последовательности, кодирующей междоменную область, и на З'-конце. В области, кодирующей домен цинкового пальца, идентифицирована единственная замена - транзиция A59G у S. galapagense, которая приводит к замещению глутамина на аргинин Q20R (рис. 1). В последовательности, кодирующей YABBY-домен, выявлено пять нуклеотидных замен, из которых только транзиция A434G у S. peruvianum var. dentatum (3966) приводит к замещению глутамино-вой кислоты на глицин E145G (рис. 1).
В белках YABBY3 из 11 замещений аминокислотных остатков (рис. 1) четыре (S64C, Y76C, D116G, E145G) признаны радикальными (значения физико-химической дистанции по матрице Грэнтсема
Таблица 3. Результаты оценки статистической значимости различий в уровне экспрессии гена YABBY3 в различных органах у каждого из четырех исследуемых видов томата
S. lycopersicum cv. Silvestre recordo
лист бутон цветок
Бутон 0.0012
Цветок 0.6189 0.0007
Плод <0.0001 <0.0001 <0.0001
S. chmielewskii
лист бутон цветок
Бутон 0.0242
Цветок 0.1117 0.5025
Плод <0.0001 <0.0001 <0.0001
S. peruvianum var. dentatum
лист бутон цветок
Бутон <0.0001
Цветок 0.1014 <0.0001
Плод <0.0001 0.3049 <0.0001
S. habrochaites
лист бутон цветок
Бутон <0.0001
Цветок <0.0001 <0.0001
Плод <0.0001 <0.0001 <0.0001
*Значения р^а!ие < 0.05 считаются значимыми и выделены жирным шрифтом.
< 57.9). В то же время оценка, проведенная в программе PROVEAN, обобщающей известные алгоритмы оценки аминокислотных замен и инделей, определила как радикальную только одну замену (E145G в YABBY-домене у S. peruvianum var. dentatum), тогда как остальные замены, делеции и вставки определены как нейтральные. Исследование влияния замен на функцию белков нуждается в дополнительном экспериментальном анализе.
Моделирование (Phyre2) трехмерной структуры ортологов YABBY3 выявило неупорядоченную организацию более 60% последовательности, в то время как 29% было предсказано с достоверностью более 90% на основе известных структур белков, содержащих HMG-домен (PDB: dlqrva, d1k99a и др.). Достоверно предсказанная последовательность представляла собой домен YABBY, гомологичный домену HMG [10], состоящий из двух а-спиралей, соединенных петлей (helix-loop-helix) (рис. 2). HMG-домен предположительно связывается с малой бороздкой ДНК и изгибает двойную спираль в этой точке [38].
Проведенный филогенетический анализ показал, что все известные гены семейства YABBY S. lycopersicum кластеризуются с соответствующи-
$.lycopersicum cv.Heinz S.lyc. cv. Sylv. recorcfo S. lyç.va r.humboldtii S-pímpinellifolium S.cheesmaniae S.galapagense S.chmielewskii S.neerickiï S.chitense S.habrochaites S-pennellii 5.peruvianum S.peruvianum varient S. corneliomulleri S. arcanum S.tuberosum
$.lycopersicum cv.Heinz lyc. cv. Sylv. recûrdù S. lyc:va r .humboldtii S.pimpinellifolium S.cheesmaniae S.galapagense S.chmielev/skii S.neorickii S.chllense S.habrochaites S .pennellii S.peruvianum 5.peruvianum var. den t S.corneliomulleri S. arcanum S. tuberosum
S.lycopersicum cv.Heinz S. lyc. cv. Sylv. record о S.lyc. var, h umboldtii $. pimp<n eltifolium S.cheesmaniae S.galapagense S.chmielev/skii S.neorickii S.chitense S.habrochaites S.pennellii S.peruvianum S.peruvianum var. dent S.comeliemullen S.arcanum S. tuberosum
* 20 * 40
HSSSNaLSLDHLPPPPP----seqlcyvhcnvcdtvlavsvpcts
HSSSNSLSLDHLEPPPP----SEQLCYVHCNVCDTVLAVSVPCTS
MSSSNSLSLDHLPPPPP----SEßLCYVHCNVCDTVLAVSVPCTS
MSSSNSLSLDHLPPPPF----SEQLC Y VHCU VC: DT VLAVS VFCTS
MS3SNSLSLDI1LPPPPP----SEQLCYVHCNVCDTVLAVSVPCTS
MSSSNSLSLDI1LPPPPP----SE RLC Y VHCN VCDT VLA.VS V PCT S
MSSSNSLSLDHLFPPPP----SEQLCY VHCNVCDTVLAVSVPCTS
MSSSWSLSLDHLPPPPP----SEQLC Y VHCIM VC DT VLAV SV PCT S
MS3SNSLSLDI1LSPPPP----SE Q LC YVUCN VCDT VLAVS V PC T
MS3SNSLSLDI1LPPPPP----SE Q LC YVIICN VC D T VLAVS V PCT S
MS'SSNSLSLDHLPPPFF----S E QLC Y VHCIM V С DTVLAVSV PCT S
MS SSNSLSLDI1LPPPPPPPP- SEQLC YVI-ICNVCD T VLA.VS V PC T S MS 3SNSLSLDI1LPPPPPPPP-SEQLCYVHCNVCDTVLAVSVPCTS MS'SSNSLSLDIILPPPP P E PP - SE Q LC Y VHCN VCD T VLAVS V PC T S MSSSNSLSLDHLPPPP P PPP - S E QLC Y VHCN VCDT VLAVS V PC T S MSSSNSLSLDIILPPPPPPPPFSEQLCYVIICNVCDTVLAVSVPCT
EcjLCYVHCNVCDTVLAVSVPCTS
FIL-A
SO
HHFGETYFS
HHFGHTYFS
HHFGETÏFS
HHFGETYFS
HHFGETYF
HHFGETYF
HHFGETYF
HHFGPTYF
HHFGFTYF
IiHFGETYF
HI1FGHTYF
HHFGPTCF
HHFGPTYF
HHFGETYF
HH FGPTYF
HHFGPTYF
* 60 * LFKTVTVRCGHCTNLLPGWLLPSTN-HHH LFKTVTVRCGHCTNLLPGWLLPCTN-HHH LFKTVTVRCGHCTMLLPGWLLPSTN-HHH LFKTVTVRCGHCTHLLPGWLLPSTN-HHH LFKTVTVRCGIICTNLLPGHLLPÍ3TN -IIHU LFKTVTVRCGHCTNLLPGWLLPSTN-HHU LFKTVTVRCGHCTNLLPGWLLPSTN-HHH L ;-'K T VTV RCGH С T N L,PC W L ^ PS TNRHHH LFKTVTVRCGIICTNLLPGWLLPSTN-I]I1H LFKTVTVRCGHCTNLLPGKLLPSTN-HHH
LFKTVTVRCGHCTNLLPGWLLPSTN---H
LFKTVTVRCGEICTNLLPGWLLPSTN-HHH LFKTVTVRGGHCTNLLPGWLLPSTN-НИН LFKTVTVRGGHCTNLLPGWLLPSTN ■ HH1I LFKTVTVRCGHCTNLLPGKLL,P3TN-HHH LFKTVTVRGGHCTNLLPGWLLPSTN- - II II LFRTVTVRCGHCTWLLPGWLL
HNLLDEI HSLLD5I HNLLDEI HNLLDEI HNLLDEI HNLLDEI HNLLDEI HNI.I.riFT HWT.i.n^T HNLLDEI HNLLDEI HNI.T.DF T
HNT.T.D^T HNLLDEI ЯИ! T.DFI HNT.T.É^T
S NAT S NAT ÏNAT
;nat ;nat ;nat ;nat
■ HAT ÏNAT
;nat ;nat
T N Л T ÏNAT
;nat
ÏNA.T ÎWAT
100 PNFLMNQ PNFLMNQ PNFLMNQ PNFLMNQ PNFLMNQ PNFLMHQ PNFLMNQ ^NFT.MNQ l'Nrl.Mti'. PNFLMNQ PNFLMNQ PNFi.MNQ FNFT.MNQ PNFLMNQ PNFT.MNQ PÏIFi.MHQ
SNSÄHE NSAHS NSAHE NSAHE SNSAHE SNSAHE NSAHE SNSAHF: SNSART NSAHE NSAHE 5NSS4?: SNSAHF NSAHE SN SA H3: SNSAHE
12 Û
FVQLE>ARPGFDDL FVQLPARPGFDGL FVQLPAR.PGFDDL FVQLFARPGFDDL FVQLPARPGFDDL FVQLPAR.PGFDDL FVQLPARPGFDDL FVQT.PAIÍPGFDD", FVQT.PflRPGFDI)', FVQLPARPGFDDL FVQLPARPGFDDL FVQ7. PAR PGFPjDr. FVQT.PARPGFDHir FVQLPARPGFDDL FVQT. PA R PG F D D Г FVQT.PARPGFDD".
F1L-D
140
PRPPPVVNRPPEKRQRVPSAYNRFIK PRPPPWNRPPEKRQRVPSAYNRFIK PRE1 PPVVNRPPEKRQR.VPSAYNRFIK F RPF PWNRPPEKRQRVPSAYNRFIK PRPPPVVNRPPEKRQRVPSAYNRFIK PRE1 P PVVNRPPEKRQRVPSAYNRFIK PRPPPVVNRPPEKRQRVPSAYNRFIK PPFPPVVNUPPF.K-RQRVPSAYNPFTK PPPPPVVNÍÍPT'F.KRQRVPSAYNPFTK PRPPPVVNRPPEKRQRVPSAYNRFIK PRPPPVVNRPPEKRQRVPSAYNRFIK FPFPPVVNRPFF.KFQRVPS AYNRFTK FR FPPVVNRPFF.K"RQRVPS AYNPFTK PRPPPVVNRPPEKRQRVPSAYNRFIK PRPPPVVNRPPF.KRQRVPSAYNRFTK PRPPPVINRPPFPTPQRVPSAYNRFTK vNRPPEKRQHVPSAYHRFIK
PET E Ff T
ES ! EKT EET EË.1 ЕЕ Г EEI EET EE3 EE: Eki EG i EE í EEL EEÏ Eel
1 GO
QR TKAGNPHT QF.T KAGNPD1 g R 1 К A G N F □ 1 QRTKAGNPHT QR TKAGNP"JT g H "I К A G N p :n QRI К A G N P : ] 1 gRIKAGNPDl QRPKAGNPDI Qfi J KAGNPD 1 QR1KAGNPDI QRIKAGNPDI QRIKAGNPÛI OR I KAGNPI1 I QRIKAGNPDI QRLKAGNPDI QRIKAGNPDI
PRFiAFSAAAKNWAHF
h RFA FS aaaknwa h f
H RF A FÏÏА А А К NW A H F HRFAFSAAAKNWAHF HRFAFSAAAKNKTAHF HRp:AE"'yAAAKNVJAHF
hre:afhaaakhwahf
HREAf'SMAKNNAHI' HRFAFSAAAKNKIAHF HREAfSAAAKNWAHP HREAfSAAAKMHAHr HKEAfSAAAKllilAHf HRP: АРУ A A AKNVJAHF HRCAESAAAKNWAHf HREAI'SAAAliMVIAHf HRïAPSAAAKNWAHf HREAFSAAAKNWAHF
180 * 2 О О-
PH TQFGI.MPDQTVKRTNVFQQDGE P H T Q FGT.HPDQTVKR T NVRQQ DG E PHTUP'Gl MPDUTVKRTNVRyßnüK PRTQFGT.MPDQTVKRTNVRQQDGF PRTQFGT.MPPQTVFRTNVFQQDGR 'H I UFG ]-M l'U^TVKRÏNVRÇ tjnGF PH TÜKtnl.MPDpTVKR'l1 E
P H1Q t GLM P DÖ'l'VKRtH VRgQ OSE PHTQFGI.M PDQTVKRTNVRQQDGR
PHIQh'G I.MPEQTVKRTNVHQQbGE PHLQFGLMPDCTVKRTNVRQQDGE PHIQFGLMPDOTVKRTNVRQQDGE PH L UFG LHPtJ^TVKRTÑVRy^DGE PH.IQV'GLMPDQTVKR'I'NVRCOÜGE PHLQE'GLMPDQTVKRTNVROQDGE P J; 1 Ó P G L И P Li; ■! JK ЙТ N VRC Q D S t: PHI ---
DVT.TKDG7 rJVT.TKPJGT
DVT.TKDGT DVT.T KFJG Pi P3V I .T К DG Г DV I ЛГ К DG Г, □VLTKDG DVT,TKDGI. DVl.TKDGL DVLTK.DGL DVLTKDGL □ VL.TKDGI. DVljT KDGi, DVLTKDGL DVLMKDGL
220
PNTSANVSVSPY FHT5AWV5VSPY FN'FSANVSVSPY FNTSAWVSVSPY FNTSAHVSVSPY FNTSANVSVSPY h'MTSAN VSVS PY fNTSANVSVSPY FNTSAHVSVSPY
b'NTSAPIVSVSPY FNT'SANVSVSPY P'NXSANVSVSPY FtJTSANVSVS PY FNTSANVSVSPY fNTSANVSVSPY FNTSANVSVSPY
69 69 69 69 69 69
69
70 69 69 67 72 72 72 72 72
14 Í 143 1 3 3 143 14 3 143 143 14 1 143 143 14 1 1.4 6 1 4 6 14 6 1 4 S 1 4 6
2 1 6
2 1 6
?Л 6
21 6
2Л 6
2 1 6
21 6
217
21 6
21. 6
214
21 9
2 1 9
2 ]. 9
2 1 9
2 1 a
FÍL-E
FÎL-F
FIL-G
Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей ортологов YABBY3 у образцов видов томата и картофеля (S. tuberosum). Домен цинкового пальца подписан синим шрифтом, домен YABBY - зеленым. Замены, делеции и вставки выделены красным. Консервативные мотивы, специфичные для клады YABBY1/YABBY3, подчеркнуты и подписаны
ми ортологами A. thaliana (рис. 3). На дендрограм-ме, построенной по кДНК, гены YABBY формировали четыре субкластера: YAB1/3 (гены YABBY1 и YABBY3); YAB2/5 (YABBY2, YABBY5 и FAS); CRC (гены CRC); INO (гены INO) (рис. 3А). Кластеры, образованные в результате анализа аминокислотных последовательностей (рис. 3Б), были аналогичны вышеописанным, за исключением YABBY2 и YABBY5, которые формировали отдельные субкластеры, что соответствует предложенному ранее разделению семейства YABBY на пять подсемейств [10, 23]. Филогенетический анализ, основанный на геномных последовательностях YABBY3, разделил анализируемые образцы видов томата на два кластера с ответвлением наиболее древнего вида S. pennellii и картофеля S. tuberosum (рис. 4). Результаты в целом находятся в согласии с разделе-
нием томатов как на зеленоплодные и красноплод-ные, так и на само- и перекрестноопыляемые виды. При этом два зеленоплодных самоопыляемых вида S. chmielewskii и S. neorickii попадают в противоположные кластеры, соответствуя, видимо, эволюционно-пограничной точке происхождения красноплодных самоопыляемых видов из зеленоплодных перекрест-ноопыляемых.
Данные экспрессии генов YABBY покрытосеменных предполагают, что гены YABBY1/3 сохранили древний паттерн экспрессии [12], транскрибируясь в абаксиальной части примордиев всех наземных боковых органов (за исключением семязачатков) [25, 41]. Это подтверждается и полученными данными, отражающими экспрессию гена YABBY3 в вегетативных и генеративных органах S. chmielewskii, S. lycopersicum cv. Silvestre recordo, S. habrochaites
Рис. 2. Трехмерная структура белка YABBY3 S. lycopersicum cv. Heinz (кДНК XM_004245689). Образующие YABBY-домен а-спирали, соединенные петлей, указаны стрелками
S. arcanum
S. lycopersicum var. humboldtii
S. chmielewskii
SIYABBY3
S. corneliomulleri
S. cheesmaniae
S. galapagense
S. lycopersicum cv. Silvestre recordo
S. pimpinellifolium var. racemigerum
S. peruvianum
S. habrochaites
S. peruvianum var. dentatum
S. neorickii
S. chilense
SlYABBYl
AtYABBY3
AtFIL
SlYABBY2
SlFAS
AtYABBY2
AtYABBY5
SlYABBY5a
SlYABBY5b
AtCRC
SlCRCa
SlCRCb
SlINO
AtlNO
YAB1/3
YAB2/5
CRC
INO
S. peruvianum
S. peruvianum var. dentatum S. corneliomulleri S. arcanum S. neorickii S. cheesmaniae S. chmielewskii
S. lycopersicum var. humboldtii
S. galapagense
SlYABBY3
S. pimpinellifolium var. racemigerum S. habrochaites
S. lycopersicum cv. Silvestre recordo S. chilense -SlYABBYl -AtYABBY3
AtFIL -SlYABBY2
SlFAS -AtYABBY2 AtYABBY5 SlYABBY5a SlYABBY5b AtCRC SlCRCa SlCRCb SlINO AtINO
YAB1/3
YAB2
YAB5
CRC
INO
Л
Б
Рис. 3. Филогения генов семейства YABBY у S. lycopersicum (Sl) и A. thaliana (At) по кДНК (А) и аминокислотным последовательностям (Б) (MEGA 7.0, метод ML; (А)-модель Hasegawa-Kishino-Yano [39] + Gamma distributed with invariant sites), (Б)-модель Dayhoff [40] + Gamma distributed)
S. cheesmaniae
S. lycopersicum var. humboldtii
S. lycopersicum cv. Heinz
S. lycopersicum cv. Silvestre recordo
S. pimpinellifolium var. racemigerum
S. galapagense
S. chmielewskii
S. neorickii
S. corneliomulleri
S. habrochaites
S. arcanum
S. peruvianum
S. chilense
S. peruvianum var. dentatum S. pennellii S. tuberosum
U
S
1.5
и и Ф
а с
и
2 1.0
х
ф
ш
О
а
■а С
Ф
и О
0.5
0.0
В Ü □ □
0 в в ^^^ ш
I
I
I
Ï
Т-Г
L B Fl Fr L B Fl Fr L B FL Fr L B Fl Fr S. lycopersicum S. chmielewskii S. peruvianum S. habrochaites
cv. Silvestre recordo
var. dentatum
4
Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное на основании геномных последовательностей YABBY3 образцов культивируемых и дикорастущих видов томата в сравнении с YABBY3 картофеля S. tuberosum (МЕОД7.0, метод ML; модель + С+1). RF - красно-плодные образцы; GF - зеленоплод-ные образцы; SC - самоопыляемые образцы; SI - пере-крестноопыляемые образцы
Рис. 5.Относительные уровни экспрессии гена YABBY3 в листьях молодых бутонах (В), открытых цветках ^1) и зеленых незрелых плодах ^г) четырех образцов томатов
и S. peruvianum var. dentatum. У S. habrochaites экспрессия гена в листьях несколько выше, чем в цветках, а у остальных трех видов отсутствуют статистически значимые различия в уровнях экспрессии в цветках и листьях (рис. 5, табл. 3). При этом у исследуемых видов, кроме S. peruvianum var. dentatum, ген YABBY3 в плодах практически не экспрессиру-ется (рис. 5). Данные четыре вида были выбраны для анализа экспрессии в силу их принадлежности к четырем эволюционно отдаленным друг от друга группам. S. lycopersicum является красноплодным, самоопыляемым видом относительно недавнего происхождения; S. chmielewskii — зеленоплодный, но самоопыляемый - на эволюционной лестнице стоит между красноплодными самоопыляемыми и зеленоплодными перекрестноопыляемыми видами; S. peruvianum - представитель зеленоплодных перекрестноопыляемых видов; и, наконец, S. hab-rochaites (зеленоплодный перекрестноопыляемый) считается одним из наиболее древних видов томата [32]. Паттерн экспрессии YABBY3 S. peruvianum var. dentatum несколько отличался от паттерна у остальных анализируемых образцов, хотя причина низкого уровня экспрессии в бутоне не совсем ясна (рис. 5). У S. habrochaites динамика экспрессии аналогична динамике у S. lycopersicum и S. chmielewskii, однако уровень транскрипции во всех анализируемых органах почти в 2 раза ниже. В целом, выявленные паттерны экспрессии YABBY3 у S. lycopersicum, S. chmielewskii и S. habrochaites совпадают с таковыми у S. pimpinellifolium, где максимальный уровень экспрессии YABBY3 наблюдается в молодых бутонах и снижается по мере развития цветка и плода [30].
Показано, что у A. thaliana как конститутивная экспрессия гена YABBY3, так и ее выключение приводят к аномальному развитию листьев и цветков из-за потери полярной дифференцировки органов [18]. Вариабельность уровня экспрессии этого гена также может отражаться на строении и морфофизи-ологии органов, в частности, листьев, цветков и плодов анализируемых образцов томата. Значимый уровень экспрессии гена в плодах S. peruvianum var. dentatum может указывать на вероятное сохранение идентичности абаксиальной ткани в оболочке плода.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе в 13 образцах культивируемых и дикорастущих видов томата идентифицированы гены, ортологичные YABBY3. Эти гены кодируют факторы транскрипции, которые играют одну из ключевых ролей в определении абаксиально-адаксиальной асимметрии всех наземных латеральных органов растения. Структура генов YABBY3 и кодируемых ими белков сходна с ранее охарактеризованными членами семейства YABBY. Филогенетический и экс-прессионный анализ подтвердил, что идентифицированные гены относятся к подсемейству YABBY1 / 3 и, возможно, имеют консервативные функции в различных видах томата.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 16-1610022 с использованием экспериментальной установки искусственного климата ЭУИК и ЦКП Биоинженерия (ФИЦ Биотехнологии РАН).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Альберт Е.В., Ежова Т.А. // Генетика. 2013. Т. 49. № 2. С. 149-163.
2. Лутова Л.А., Додуева И.Е., Лебедева М.А., Творогова В.Е. // Генетика. 2015. Т. 51. № 5. С. 539-557.
3. Castrillo G., Turck F., Leveugle M., Lecharny A., Carbonero P., Coupland G., Paz-Ares J., Onate-Sanchez L. // PLoS One. 2011. V. 6. № 6. e21524.
4. Yang C., Ma Y., Li J. // J. Exp. Bot. 2016. V. 67. № 18. P. 55455556.
5. Gramzow L., Ritz M.S., Theissen G. // Trends Genet. 2010. V. 26. № 4. P. 149-153.
6. Melzer R., Theissen G. // Methods Mol. Biol. 2011. V. 754. P. 3-18.
7. Sarojam R., Sapp P.J., Goldshmidt A., Efroni I., Floyd S.K., Eshed Y., Bowman J.L. // Plant Cell. 2010. V. 22. № 7. P. 21132130.
8. Floyd S.K., Bowman J.L. // Int. J. Plant Sci. 2007. V. 168. № 1. P. 1-35.
9. Rensing S.A., Lang D., Zimmer A.D., Terry A., Salamov A., Shapiro H., Nishiyama T., Perroud P.F., Lindquist E.A., Ka-misugi Y., et al. // Science. 2008. V. 319. № 5859. P. 64-69.
10. Finet C., Floyd S.K., Conway S.J., Zhong B., Scutt C.P., Bowman J.L. // Evol. Dev. 2016. V. 18. № 2. P. 116-126.
11. Yamada T., Yokota S., Hirayama Y., Imaichi R., Kato M., Gasser C.S. // Plant J. 2011. V. 67. № 1. P. 26-36.
12. Bartholmes C., Hidalgo O., Gleissberg S. // Plant Biol (Stuttg.). 2012. V. 14. № 1. P. 11-23.
13. Meyerowitz E.M. // Cell. 1997. V. 88. № 3. P. 299-308.
14. Bowman J.L., Eshed Y., Baum S.F. // Trends Genet. 2002. V. 18. № 3. P. 134-141.
15. de Almeida A.M.R., Yockteng R., Schnable J., Alvarez-Buyl-la E.R., Freeling M., Specht C.D. // Sci. Rep. 2014. V. 4. Article number 6194.
16. Morioka K., Yockteng R., Almeida A.M., Specht C.D. // Front Plant Sci. 2015. V. 6. Article 1106.
17. Kelley D.R., Skinner D.J., Gasser C.S. // Plant J. 2009. V. 57. № 6. P. 1054-1064.
18. Siegfried K.R., Eshed Y., Baum S.F., Otsuga D., Drews G.N., Bowman J.L. // Development. 1999. № 126. P. 4117-4128.
19. Villanueva J.M., Broadhvest J., Hauser B.A., Meister R.J., Schneitz K., Gasser C.S. // Genes Dev. 1999. V. 13. № 23.
P. 3160-3169.
20. Fourquin C., Vinauger-Douard M., Fogliani B., Dumas C.,
Scutt C.P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 12. P. 4649-4654.
21. Lee J.Y., Baum S.F., Alvarez J., Patel A., Chitwood D.H., Bowman J.L. // Plant Cell. 2005. V. 17. № 1. P. 25-36.
22. Stahle M.I., Kuehlich J., Staron L., von Arnim A.G., Golz J.F. // Plant Cell. 2009. V. 21. № 10. P. 3105-3118.
23. Lee J.Y., Baum S.F., Oh S.H., Jiang C.Z., Chen J.C., Bowman J.L. // Development. 2005. № 132. P. 5021-5032.
24. Sawa S., Ito T., Shimura Y., Okada K. // Plant Cell. 1999. V. 11. № 1. P. 69-86.
25. Sawa S., Watanabe K., Goto K., Kanaya E., Morita E.H., Okada K. // Genes Dev. 1999. V. 13. № 9. P. 1079-1088.
26. Chen Q., Atkinson A., Otsuga D., Christensen T., Reynolds L., Drews G.N. // Development. 1999. № 126. P. 2715-2726.
27. Bowman J.L. // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. V. 3. P. 17-22.
28. Kanaya E., Nakajima N., Okada K. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 14. P. 11957-11964.
29. Toriba T., Harada K., Takamura A., Nakamura H., Ichikawa H., Suzaki T., Hirano H.Y. // Mol. Genet. Genomics. 2007. V. 277. № 5. P. 457-468.
30. Huang Z., van Houten J., Gonzalez G., Xiao H., van der Knaap E. // Mol. Genet. Genomics. 2013. V. 288. № 3-4. P. 111-129.
31. Han H.Q., Liu Y., Jiang M.M., Ge H.Y., Chen H.Y. // Genet. Mol. Res. 2015. V. 14. № 2. P. 7079-7091.
32. Peralta I.E., Spooner D.M., Knapp S. // Systematic Botany Monographs Am. Soc. Plant Taxonomists, USA. 2008. V. 84. 186 p.
33. Kumar S., Stecher G., Tamura K. // Mol. Biol. Evol. 2016. V. 33. № 7. P. 1870-1874.
34. Grantham R. // Science. 1974. V. 185. P. 862-864.
35. Choi Y., Sims G.E., Murphy S., Miller J.R., Chan A.P. // PLoS One. 2012. V. 7. № 10. e46688.
36. Kelley L.A., Mezulis S., Yates C.M., Wass M.N., Sternberg M.J. // Nat. Protoc. 2015. V. 10. № 6. P. 845-858.
37. Expósito-Rodríguez M., Borges A.A., Borges-Pérez A., Pérez J.A. // BMC Plant Biol. 2008. V. 8. № 131. P. 1-12.
38. Bowman J.L., Smyth D.R. // Development. 1999. № 126. P. 2387-2396.
39. Hasegawa M., Kishino H., Yano T. // J. Mol. Evol. 1985. V. 22. № 2. P. 160-174.
40. Dayhoff M.O., Schwartz R.M., Orcutt B.C. // Atlas Protein Sequence and Structure. 1978. V. 5. P. 345-352.
41. Golz J.F., Roccaro M., Kuzoff R., Hudson A. // Development. 2004. № 131. P. 3661-3670.
