CC BY
102
ненте [6]. Лизосомальные ферменты, попавшие в кровь, сами, включаясь в цепной цитолитический процесс, могут вызвать неблагоприятные патологические изменения в организме и вследствие этого являются важным патогенетическим звеном многих заболеваний. С этой точки зрения гиперферментемия при инфаркте миокарда может рассматриваться как диагностический и прогностический признак, характеризующий как наличие самой патологии, так и тяжесть ее клинического течения. Учитывая эти обстоятельства, на следующем этапе работы исследовали изменения активности лизосомальных ферментов в гомогенате сердечной мышцы и в сыворотке крови в динамике развития МИМ.
В условиях наиболее щадящей гомогенизации в среде изотонического раствора сахарозы определялась так называемая свободная активность; после центрифугирования гомогената при 105000§ получалась надосадочная фракция, в которой можно было определить неосаждаемую активность лизосомальных ферментов; наконец, в присутствии тритона Х-100 определялась общая (или удельная) активность лизосомальных гидролаз.
В эксперименте одной группе крыс вводили небольшую дозу аллоксана (100-120 мг/1кг массы животного) который снижает синтез инсулина, однако не вызывает явно проявляющегося диабета. Второй группе вводили однократно адреналин, третьей - через 5-7 дней после аллоксана вводили адреналин в течение 6 дней. Именно в этом случае аллоксан оказался предрасполагающим фактором к развитию эндокринно-метаболических изменений, характерных для МИМ. Наиболее точную информацию можно получить при анализе отношения свободной активности к общей. Оказалось, что все виды указанных воздействий на организм крыс значительно увеличивали отношение свободной активности кислой фосфатазы к общей, по сравнению с контролем: в 1,4 раза - аллоксан, в 1,6 раза - однократное введение адреналина, в 1,8 раза под влиянием адреналина, введенного в течение 6 дней на фоне аллоксана, что указывает на возрастающую степень лабили-зации лизосомальных мембран (Р<0.05) (табл. 2).
Таблица 2
Изменения активности кислой фосфатазы в сердечной мышце и сыворотке крови крыс под влиянием адреналина и аллоксана
Условия опытов Белок Свободн. Общая Своб/общ Сыворотка
Контроль 30) 10,5+0,5 3,9+0,4 11,1+0,6 0,38+0,03 27,6+1,62
Адренал.(18) 10,8+0,6 5,3+0,3* 8,1+0,2* 0,53+0,03* 37,4+2,46*
Аллоксан(19) 9,9+0,5 4,1+0,2 6,9+0,5* 0,62+0,06* 37,2+2,31*
Ал+Адр (14) 11,1+0,7 6,5+0,5* 9,7+0,8 0,67+0,05*# 45,9+2,41*#
Примечание: в скобках - число животных; * - достоверные отличия от интактных животных (Р<0,05); # - достоверные отличия от показателей, крыс после введения аллоксана или однократного введения адреналина интактным животным, (Р<0.05)
В сыворотке крови также значительно возрастает активность кислой фосфатазы: в среднем на 35% под влиянием аллоксана или адреналина. Но длительное введение адреналина на фоне предварительной инъекции аллоксана увеличивало активность кислой фосфатазы в сыворотке крови по сравнению с контролем на 66%. Эта величина достоверно отличалась и от контроля, и от показателей, полученных после введения аллоксана или адреналина интактным животным (Р<0,05) (табл. 2).
Результаты определения активности катепсина D в аналогичных условиях показали следующее. При введении адреналина интактным крысам или на фоне аллоксана, так же как и при введении аллоксана, свободная активность катепсина Э, практически не отличалась от контрольных значений. Однако величина удельной активности катепсина Э в гомогенате из ткани сердечной мышцы значительно уменьшалась под влиянием как однократного адреналина, так и, особенно, под влиянием длительного введения адреналина на фоне аллоксана (Р<0,05).
В этих условиях величина удельной активности катепсина Э снижалась в 1,5 раза, по сравнению с контролем (табл 3). Соответственно, на 25-50% повышалась величина отношения свободной активности катепсина Э к удельной активности под влиянием адреналина и адреналина с аллоксаном. Определение активности катепсина Э в сыворотке крови показало, что однократное введение адреналина интактным животным не влекло за собой увеличения сывороточной активности фермента. В отличие от этого аллоксан увеличивал выход катепсина Э в кровь, но в меньшем размере, чем под влиянием адреналина, введенного в течение 6 дней
после аллоксана. В этих условиях активность фермента повышалась в 2,7 раза, по сравнению с одним аллоксаном (Р<0,05).
Таблица 3
Изменения активности катепсина О в сердечной мышце и сыворотке крови крыс под влиянием адреналина и аллоксана
Условия опытов Свободная Общая Своб/общ Сыворотка
Контроль (30) 0.38+0.03 1.79+0.14 0.249+0.02 Нет
Адреналин (18) 0.34+0.04 1.36+0.09* 0.310+0.05* Нет
Аллоксан(19) 0.40+0.02 1.77+0.19 0.247+0.03 1.26+0.66
Ал+Адр (14) 0.44+0.02 1.17+0.06* 0.382+0.01*# 3.38+0.56#
Примечание: в скобках - число животных; * - достоверные отличия от интактных животных (P<0,05); # - достоверное отличие показателей, полученных при введении адреналина в течение 6 дней на фоне аллоксана
от показателей, полученных при введении аллоксана, (P<0,05)
Второй очень важный вопрос: каковы источники ЛзФ, появляющихся в крови при поражениях миокарда? Одним из источников может быть сам поврежденный миокард. Но значительным источником ЛзФ в крови при повреждениях миокарда любого генеза являются нейтрофилы крови, а также лейкоциты, мигрировавшие в очаг повреждения. Усиление сывороточной активности лизосомальных ферментов говорит о том, что при этом усиливается секреция лизосомальных белков из нейтрофилов крови. Это подтверждают и данные предварительного цитохимического исследования изменений биоцидной активности нейтрофилов у крыс, у которых перестройку эндокриннометаболических взаимоотношений вызывали снижением продукции инсулина с помощью аллоксана и длительным введением адреналина. Основная роль лизосомальных ферментов при гормональном МИМ состояла не в быстром высвобождении из клеточных структур и прямом повреждающем влиянии на ткани, как это бывает при окклюзионном инфаркте миокарда [2], а в более медленной, постепенной активации лизосом через потенцирование альтерации эндотелия сосудов и кардиомиоцитов агрегированными лейкоцитами, тромбоцитами и продуктами их деятельности (гистамином, серотонином, бета-тромбглобулином, тромбоксаном А2 и др. [4,5]).
Литература
1. Благосклонная Я.В. и др. // РМЖ. 2001. Т.9. № 2. С.67-81.
2. Маянская С.Д. Воспалительные реакции при ишемической болезни сердца и подходы к их коррекции: Автореф. дис. д. м.н. Новосибирск. 1999.
3. Маянская Н.Н. и др. // Тер. архив. 1994. №4. С. 36-39.
4. Маянский А.Н. Лекции по иммунологии. Нижний Новгород, Изд-во НГМА. 2003. 271 с.
5. Маянский Д.Н. Лекции по клинической патологии // М.: ГЭОТАР-Медиа. 2008. 463с.
6. Панин Л.Е., Маянская Н.Н. Лизосомы: роль в адаптации и восстановлении. Новосибирск; Наука. 1987. 198 с.
7. Фрейдлин И.С., Назаров П.Г. // Вест. РАМН. 1999. № 5. С.28-33.
8. Barret A.J. Lysosomal enzymes / In «Lysosomes a Laboratory Handbook», Dingl J.T. (Ed), Ameterdam-London Publ. Co. 1972. P.46-120.
9. De Duve C., Wattiaux R. // Ann. Rev. Physiol. 1966. Vol.28. P435-492.
10. Dinarello C. // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 1997. Vol.11. №3. P.91-103.
11. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R. // J.Biol. Chem. 1951. Vol.193. №1. P.265-275.
12. Webster J.I. // J.I. Webster L. Tonelli, E.M. Sternberg //Ann Rev Immunol. 2002. Vol. 20. P.125-163.
УДК 612.018
ВЗАИМОСВЯЗЬ УРОВНЯ ПОЛОВЫХ СТЕРОИДОВ В МОЗГЕ С ПОВЕДЕНИЕМ И ТРЕВОЖНОСТЬЮ У САМОК КРЫС С РАЗНЫМ
ГОРМОНАЛЬНЫМ СТАТУСОМ
В.А. САШКОВ*
Изучен уровень половых стероидов не только в крови, но и в лимбических структурах мозга у самок крыс с разным гормональным статусом в связи с организацией тревожности и поведения в «открытом поле». Выявлена избирательная взаимосвязь двигательной и исследовательской ак-
*
Институт возрастной физиологии РАО, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 8
тивности, эмоциональности и тревожности с содержанием тестостерона и эстрадиола в гипоталамусе, гиппокампе, миндалине, поясной извилине и лобной коре у интактных самок крыс, а также у животных с экспериментально высоким и низким уровнем половых стероидов. Корреляционный анализ подтверждает представления об избирательном вовлечении половых стероидов различных структур мозга в реализации процессов нервной деятельности и поведенческой адаптации.
Ключевые слова: уровень половых стероидов
Половые стероиды оказывают существенное влияние на формирование психического статуса, эмоций и поведения [4]. На это указывает присутствие андрогенов и эстрогенов, а также их рецепторов в различных структурах мозга [9]. Использование радиоиммунных, авторадиографических и иммуноцитохимиче-ских методов исследования показало наличие рецепторов к половым стероидам в гиппокампе, гипоталамусе и коре мозга [13] -структурах, вовлеченных в формирование настроения, поведения и осуществление условнорефлекторной деятельности [5]. При этом не исключается возможность образования половых стероидов клеточными элементами самого мозга и их вовлечение в реализацию процессов высшей нервной деятельности и поведения [12]. Подтверждение этих предположений требует постановки специальных экспериментов на лабораторных животных. Очевидным остается одно - изменение уровня половых стероидов при нарушении гормонального баланса в организме может быть причиной дисфункции регуляторных систем мозга и как следствие - изменением процессов нервной деятельности и поведения. Степень выраженности этих последствий для организма зависит от направленности гормональных изменений, возраста и пола объекта исследования. Однако влияние гормонального статуса на эмоциональность, тревожность, двигательная и исследовательская активность изучено недостаточно.
Цель работы - изучение паттернов корреляционных связей уровня тестостерона и эстрадиола в лимбических отделах мозга (гипоталамус, гиппокамп, миндалина, поясная извилина и лобная кора) с проявлением двигательной и исследовательской активности, эмоциональности и тревожности у самок крыс с экспериментально высоким и низким уровнем половых стероидов.
Материалы и методы исследования. При работе с крысами полностью соблюдались международные принципы Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. В соответствии поставленными задачами было использовано 60 половозрелых самок крыс линии Вистар, разделенных на 4 группы: 1 - контрольные животные; 2 - гонадоэктомированные крысы; 3 - гонадоэкто-мированные крысы на фоне экзогенного введения эстрадиола (0,5 мг/кг); 4 - интактные животные на фоне экзогенного введения эстрадиола (0,5 мг/кг). При моделировании состояний дефицита и избытка половых гормонов у крыс мы руководствовались работами Кирштенблата Я.Д. [2] и Сапронова Н.С. с соавт. [4]. Анализ полученных данных показал, что ложная операция, которая заключалась в небольшом разрезании кожи и проведении манипуляций, как при удалении яичников без соответствующей операции, не оказывает явного влияния на изучаемые поведенческие и биохимические показатели. Поэтому в дальнейшем сравнение показателей у крыс с гонадоэктомией проводили с соответствующими данными интакт-ных животных, которые и служили контролем. Гонадоэктомиро-ванных крыс брали в опыт спустя 14 дней после операции.
Поведение животных оценивали в тесте «открытого поля» по общепринятой методике [1]. По длительности латентного периода выхода из центрального квадрата и числу пересеченных линий судили о двигательной активности. Число вертикальных стоек и обследованных отверстий говорило о степени выраженности исследовательской активности крыс. Число умываний и дефекаций говорило об эмоциональном состоянии животных.
Для комплексной оценки тревожно-фобического статуса крыс был использован многопараметрический метод [3], в основу которого положена ранжированная шкала, характеризующая видоспецифические ответные реакции животного на серию этологи-чески адекватных тест-стимулов. Используемые тесты представляют собой две основные ситуации, в которых крысы демонстрируют ответы, связанные с проявлением тревоги и страха: столкновение с незнакомым неживым объектом или незнакомой ситуацией: спуск с высоты, прохождение через отверстие, выход из домика, выход из центра открытого поля, пячение в обстановке открытого поля; приближение руки экспериментатора - пячение, вокализация, затаивание, прижимание ушей. Для всех тестов, входящих в состав шкалы, были единые пределы изменений ответной реакции: от 0 до 3 баллов. Большая оценка в баллах соответствовала более
выраженной реакции животного и более высокому тревожно-фобическому уровню. Далее подсчитывали суммарную оценку по всем тестам (интегральный показатель тревожности - ИПТ).
Животные каждой группы подвергались поведенческому тестированию, после чего производили гильотинирование, забор стекающей крови и выделение вышеуказанных структур головного мозга на холоде. Ткани мозга подвергали гомогенизации. Затем пробы крови и мозга центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант замораживали при 1=-30°С для последующего определения уровней тестостерона и эстрадиола методом ИФА с использованием наборов фирмы ЭЯО (США).
Полученные данные обработаны по статистической программе 8Р88 (13,00). Оценка достоверности различий шла с использованием 1-критерия Стьюдента (р<0,05). Для выявления зависимости между исследуемыми поведенческими параметрами и уровнем тестостерона и эстрадиола в крови и отдельных структурах мозга у самок крыс с разным гормональным статусом применялся корреляционный анализ по методу Пирсона.
Результаты. Нейроактивные стероиды в мозге. Анализ уровня половых стероидов у самок крыс с разным гормональным статусом показал, что содержание тестостерона у овариоэктомиро-ванных самок крыс достоверно снижается в плазме крови и гипоталамусе, практически не изменяется в миндалине и поясной извилине и несколько повышается в гиппокампе и лобной коре по сравнению с данными интактных животных. Гонадоэктомированные самки, получавшие эстрадиол, отличаются снижением концентрации тестостерона в плазме крови и повышением его значений в гипоталамусе, гиппокампе, миндалине, поясной извилине и лобной коре по сравнению с контролем. У самок крыс на фоне экзогенного введения эстрадиола во всех изученных структурах мозга выявлено достоверное повышение содержания тестостерона по сравнению с данными интактных животных (рис. 1).
Уровень эстрадиола у самок крыс с удаленными яичниками достоверно снижается по сравнению с контролем в плазме крови и во всех изученных структурах мозга. Овариоэктомированные самки, получавшие эстрадиол, отличаются повышением содержания эстрадиола в миндалине при одновременном его снижении в гипоталамусе, гиппокампе, поясной извилине, лобной коре и плазме крови по сравнению с интактными крысами. У самок крыс на фоне экзогенного введения эстрадиола уровень эстра-диола в гипоталамусе практически не изменяется по сравнению с контролем, повышается в плазме крови и снижается в гиппокампе, миндалине, поясной извилине и лобной коре (рис. 2).
Поведение в «открытом поле». Изучение поведения в «открытом поле» самок крыс с разным гормональным статусом позволило выявить, что овариоэктомированные самки крыс отличаются достоверным увеличением латентного периода выхода из центра «открытого поля» и снижением числа умываний и дефекаций по сравнению с контролем. Это указывает на снижение эмоциональности и появление чувства страха у самок крыс с удаленными яичниками (рис. 3). Гонадоэктомированные самки на фоне экзогенного введения эстрадиола отличаются от крыс контрольной группы снижением частоты грумминга. Показатели же, характеризующие двигательную и исследовательскую активность самок с удаленными яичниками на фоне введения эстрадиола, значимо не меняются (рис. 3). Экзогенное введение эстрадиола самкам крыс сопровождается достоверным увеличением двигательной и исследовательской активности при снижении эмоциональности по сравнению с контролем. На это указывает снижение проявлений грумминга и величины латентного периода выхода из центрального квадрата, увеличение числа пересеченных линий, вертикальных стоек и обследованных отверстий по сравнению с показателями интактных животных (рис. 3).
Тревожно-фобический статус. Тревожно-фобический статус самок крыс также изменяется при экспериментальном нарушении гормонального баланса в организме. Овариоэктомирован-ные самки отличаются достоверным увеличением интегрального показателя тревожности по сравнению с контролем. На это указывает увеличение времени прохождения через отверстие и выхода из центра «открытого поля», частоты реакций затаивания, вокализации и прижимания ушей. Однако латентный период спуска с высоты и выхода из «домика» и количество реакций пячения уменьшается по сравнению с интактными животными (рис. 4). У животных с удаленными яичниками на фоне экзогенного введения эстрадиола интегральный показатель тревожности достоверно не изменяется по сравнению с интактными крысами.
Однако при этом выявлено уменьшение латентного периода спуска с высоты и увеличение времени выхода из «домика», прохождения через отверстие и выхода из центра «открытого поля», количества реакций пячения, затаивания, вокализации и прижимания ушей по сравнению с контролем (рис. 4). Экзогенное введение эстрадиола самкам крыс также не влияет на значения интегрального показателя тревожности в целом. Однако составляющие его показатели несколько изменяются по сравнению с контролем: увеличивается время прохождения через отверстие и центра «открытого поля», количество реакций затаивания, вокализации и прижимания ушей при уменьшении латентного периода выхода из «домика» и числа реакций пячения (рис. 4).
Пп&злакрокн в Гйттиамус
4.5 3 -I
■■■■■■■ ШЯВЯші I I ell
12 3 4 Птхикмт в 4.5 1 2 3 №ШЛ№ 4
t 3 «
ПсіХНІЯНЗГНІИНІ
ШШк
Рис. 1. Особенности уровня тестостерона в плазме крови (нг/мл) и в различных структурах мозга (мкг/г) у самок крыс с разным гормональным статусом. Примечание: 1 - самки-контроль; 2 - гонадоэктомированные самки; 3 - гонадоэктомированные самки, получавшие эстрадиол (G,5 мг/кг); 4 - самки, получавшие эстрадиол (G,5 мг/кг);
* - р^^б по сравнению с контролем
Корреляционные связи уровня половых стероидов в мозге с отдельными составляющими поведения и тревожностью. Корреляционный анализ свидетельствует о существовании различий в организации патернов взаимосвязей содержания половых стероидов в различных структурах мозга с проявлением тревожности и поведения в «открытом поле» у самок крыс с разным гормональным статусом.
У самок контрольной группы обнаружено 8 значимых корреляций. Эти крысы имеют связь латентного периода выхода из центра «открытого поля» с содержанием эстрадиола в миндалине (r=-G,56). Число пересеченных линий у этих животных коррелирует с уровнем тестостерона в гипоталамусе (r=G,55), а количество вертикальных стоек - со значениями эстрадиола в гиппокампе (r=G,68). Кроме того, у интактных самок выявлена зависимость числа обследованных отверстий с уровнем тестостерона в миндалине (r=-G,8), а интегрального показателя тревожности - с содержанием эстрадиола в гипоталамусе (r=G,65) и лобной коре (r=-G,69). Количество умываний у этих крыс коррелирует с уровнем тестостерона - в гипоталамусе (r=G,74) и эстрадиола - в лобной коре (r=G,7). При этом однонаправленно с проявлением эмоциональности и тревожности связаны концентрации половых стероидов в гипоталамусе, а содержание тестостерона и эстрадиола в миндалине разнонаправленно коррелирует с проявлением двигательной и исследовательской активности.
У овариоэктомированных самок количество корреляционных связей рассматриваемых поведенческих и биохимических признаков увеличивается [13] по сравнению с контролем. Кастрированные самки имеют связь латентного периода выхода из центра «открытого поля» с уровнем тестостерона в поясной извилине (r=-G,63), а число пересеченных линий коррелирует со значениями эстрадиола в гиппокампе (r=G,52) и поясной извилине (r=G,62). У этих животных также выявлена взаимосвязь числа вертикальных стоек с содержанием эстрадиола в гиппокампе (r=G,59) и поясной извилине (r=G,76), а интегрального показателя тревожности - со значениями тестостерона в гипоталамусе (r=G,64) и эстрадиола в поясной извилине (r=G,58). Проявление грумминга в тесте «открытого поля» у кастрированных
самок коррелирует с уровнем эстрадиола в миндалине (r=-G,63), поясной извилине (r=-G,77) и лобной коре (r=G,69), а число болюсов зависит от значений тестостерона в гипоталамусе (r=G,79). При этом наиболее сильно с проявлением тревожности и эмоциональности связаны уровни тестостерона в гипоталамусе и эстрадиола в миндалине, поясной извилине и лобной коре. Значения двигательной и исследовательской активности у этих крыс однонаправленно связаны с содержанием эстрадиола в гиппокампе и поясной извилине.
У овариоэктомированных самок крыс на фоне экзогенного введения эстрадиола обнаружено б значимых корреляций. Среди них частота грумминга связана с содержанием эстрадиола (r=G,76) в миндалине и лобной коре (r=G,83). Число болюсов у этих крыс зависит от уровня эстрадиола в лобной коре (r=G,68), а интегральный показатель тревожности коррелирует со значениями эстрадио-ла в гипоталамусе (r=G,81). При этом проявление эмоциональности и тревожности у кастрированных самок крыс на фоне экзогенного введения эстрадиола положительно коррелируют со значениями эстрадиола в гипоталамусе, миндалине и лобной коре.
Самки крыс с экзогенным введением эстрадиола отличаются наличием б значимых корреляционных связей исследуемых поведенческих и биохимических признаков. Количество пересеченных линий и число вертикальных стоек в тесте «открытого поля» у этих крыс связано с уровнем эстрадиола в гиппокампе (r=G,6 и r=G,55, сответственно). Кроме того, у самок крыс с экспериментально высоким уровнем эстра-диола, выявлена взаимосвязь интегрального показателя тревожности от значений тестостерона в гипоталамусе (r=-G,82) и гиппокампе (r=G,58).
Результаты проведенных исследований позволили выявить, что снижение системного уровня половых стероидов у самок крыс сопровождается уменьшением эмоциональности и увеличением тревожности по сравнению с контролем. Эти факты соответствуют результатам исследований [4], подтверждая имеющиеся представления, что снижение содержания половых гормонов в крови глубоко изменяет деятельность головного мозга и отдельных его структур, приводя к нарушениям психических функций [8]. Экзогенное введение эстрадиола, как показали результаты настоящего исследования, сопровождается снижением эмоциональности и повышением двигательной и исследовательской активности по сравнению с контролем.
П».*лцчіп Гшаї^ікг'с
и 60 45
15 1 1 * И п вш ■
І ■ • 1 !■■■■! V///////A
2 3 Í
Шх;вм дшш
* * ШШ
2 3 X
Л* о» 11*1'л
Рис. 2. Особенности уровня эстрадиола в плазме крови (пг/мл) и в различных структурах мозга (нг/г) у самок крыс с разным гормональным статусом. Примечание: 1- самки-контроль; 2 - гонадоэктомированные самки; 3 -гонадоэктомированные самки, получавшие эстрадиол (0,5 мг/кг); 4 - самки, получавшие эстрадиол (0,5 мг/кг); * - р<0,05 по сравнению с контролем.
Предполагается, что изменение уровня эстрогенов у самок может трансформировать стратегию поведения крыс - животные с высоким уровнем эстрогенов предпочитают стратегии, основанные на визуальных стимулах, тогда как крысы с низким уровнем эстрогенов предпочитают стратегии, основанные на предшествующем эффективном опыте [14]. Кроме того, причиной выявленных изменений в поведении самок крыс после гонадоэктомии и на фоне экзоген-
ного введения эстрадиола может являться и нарушение функции нейромедиаторных систем мозга при изменении гормонального баланса в организме. Об этом свидетельствует изменение моноамин-ного метаболизма в гипоталамусе, гиппокампе и коре мозга у крыс на фоне гонадоэктомии и экзогенного введения половых стероидов [б].
Рис. З. Особенности поведения в «открытом поле» самок крыс с разным гормональным статусом. Примечание: 1 - самки-контроль; 2 - гонадоэк-томированные самки; 3 - гонадоэктомированные самки, получавшие эстрадиол (G,5 мг/кг); 4 - самки, получавшие эстрадиол (G,5 мг/кг); * -р^^ по сравнению с контролем
Рис. 4. Особенности тревожно-фобического статуса (на основе интегрального показателя тревожности) самок крыс. Примечание: 1 - самки-контроль; 2 - гонадоэктомированные самки; 3 - гонадоэктомированные самки, получавшие эстрадиол (G,5 мг/кг); 4 - самки, получавшие эстрадиол (G,5 мг/кг); * - р^^ по сравнению с контролем
Повышение концентрации тестостерона в гиппокампе и лобной коре у кастрированных самок крыс на фоне снижения его плазменного уровня при овариоэктомии подтверждает возможность его образования в данных структурах мозга. Полученные нами данные соответствует результатам предыдущих исследований, согласно которым гиппокампальные пирамидальные нейроны, в частности, имеют все необходимые механизмы для синтеза прегненолона, дегидроэпиандростерона, тестостерона, дегидротестостерона и эстрадиола [12]. Кроме того, полученные нами данные позволили выявить статистически значимое повышение уровня тестостерона в мозге и плазме крови у самок крыс, получавших эстрадиол, по сравнению с контролем. Это подтверждают возможность проникновения тестостерона через гематоэнцефа-лический барьер в мозг и возможность последующего преобразования тестостерона в эстрадиол клеточными элементами мозга. Эти процессы осуществляются ферментом ароматазой [11] во многих мозговых образованиях, включая гипоталамус, гиппокамп, миндалину и неокортекс [7]. Продукция эстрогенов в мозге зависит от внешних источников андрогенных предшественников [1G]. Поэтому присутствие тестостерона является важным в обеспечении необходимого субстрата для биосинтеза эстрогенов в мозге. При этом выявленные изменения уровня тестостерона в гипоталамусе у интактных животных коррелируют со значениями двигательной активности и эмоциональности, а у крыс с высоким и низким уровнем половых стероидов его уровень влияют на их тревожно-фобический статус.
Достоверный спад уровня эстрадиола во всех изученных структурах мозга у кастрированных самок крыс и его рост на фоне экзогенного введения эстрадиола интактным животным взаимосвязано с особенностями их тревожно-фобического статуса и поведения в «открытом поле». Наиболее значимым в поведении и тревожности овариоэктомированных самок, как показали результаты
настоящего исследования, оказывается уровень эстрадиола в гиппокампе и поясной извилине, а у крыс на фоне экзогенного введения эстрадиола его значения в гиппокампе коррелируют с проявлениями двигательной и исследовательской активности. Изменение паттернов корреляционных связей отдельных составляющих поведения и уровня стероидных гормонов в мозге у самок крыс с разным гормональным статусом подтверждает представления об избирательном вовлечении ряда нейроактивных стероидов в различные структуры мозга при реализации поведения и тревожности.
Выводы. Снижение системного уровня половых гормонов при гонадоэктомии самок идет с уменьшением эмоциональности и увеличением тревожности по сравнению с контролем. Экзогенное введение эстрадиола самкам крыс приводит к снижению эмоциональности, увеличению двигательной и исследовательской активности по сравнению с данными интактных животных.
Отсутствие выраженных изменений в поведении и тревожности овариоэктомированных самок крыс на фоне экзогенного введения эстрадиола по сравнению с гонадоэктомированными самками говорит о нивелировании эффектов гонадоэктомии на поведение и тревожность экзогенным введением эстрадиола.
Рост содержания тестостерона в гиппокампе и лобной коре у овариоэктомированных самок при снижении его уровня в плазме крови говорит о возможности его образования в мозге.
Обнаруженные изменения уровня тестостерона и эстрадио-ла в лимбических отделах мозга у самок крыс с разным гормональным статусом избирательно взаимосвязаны с их тревожно-фобическим статусом и поведением в «открытом поле». Наиболее значимым в организации двигательной и исследовательской активности, эмоциональности и тревожности у самок крыс с высоким и низким уровнем половых гормонов является концентрация эстрадиола в гиппокампе и поясной извилине.
5. Получены данные, свидетельствующие о существовании корреляционных связей между содержанием кортикостерона, тестостерона и эстрадиола в лимбических структурах мозга с результатами поведенческого тестирования самок крыс с разным гормональным статусом. Изменение паттернов наблюдавшихся корреляций у самок крыс с высоким и низким уровнем половых стероидов подтверждает представления об избирательном вовлечении отдельных нейроактивных стероидов в различных структурах мозга в реализации поведения и тревожности.
Литература
1. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высшая школа 1991. 399 с.
2. Кирштенблат Я.Д. Практикум по эндокринологии. // М: Высшая школа. 1969. 234 с.
3. Родина В.И. и др. // Патологическая физиология и общая патология. 1992. №5. С. 11-13.
4. Сапронов Н.С., Федотова Ю.О., Гончаров Н.П. // Вестник РАМН. 2001. № 12. С. 29-34.
5. Хамильтон Л. У. Основы анатомии лимбической системы крысы. М.: Изд-во МГУ, 1984. 184 с.
6. Bitar M.S., Ota M., Linnoila M., Shapiro B.H. Modification of gonade ctomy-induced increases in brain monoamine metabolism by steroid hormones in male and female rats. // Psychoneuroendocrinology. 1991. Vol. 16. № 6. P. 547-557.
7. Compaan J.C., Hutchison J.B., Wozniak A., de Ruiter A.J., Koolhaas JM. Brain aromatase activity and plasma testosterone levels are elevated in aggressive male mice during early ontogeny. // Brain Res. Dev. Brain Res. 1994. Vol. 82. № 1-2. P. 185-192.
8. Genazzani A.R., Pluchino N., Lui si S., Lui si M. Estrogen, cognition and female ageing. // Human Reproduction Update. 2007. Vol. 13. № 2. P. 175-187.
9. Kolata O.B. Sex hormones and brain development. // Science. 1979. Vol. 205. № 4410. Р. 985-987.
10. Labrie F., Belanger A., Luu-The V., Labrie C., Simond J., Cusan L., Gomez J.L., Candas B. DHEA and the intracrine formation of androgens and estrogens in peripheral target tissues: its role during aging. // Steroids. 1998. Vol. 63. P. 322-328.
11. McEwen B. // Reproduct Physiology. 1983. Vol. 4. P. 99145.
12. Mukai H., Takata N., Ishii H.T., Tanabe N., Hojo Y., Furukawa A., Kimoto T., Kawato S. Hippocampal synthesis of estrogens and androgens which are paracrine modulators of synaptic plasticity: synaptocrinology // Neuroscience. 2006. Vol. 138. №3. P. 757.
13. Neil J., MacLusky I.L., McEwen В. The development of estrogen receptor systems in the rat brain: Perinatal development. // Brain Research.1979.Vol. 178. №1. P. 129-142.
14. Shors T.J. Estrogen and learning: Strategy over parsimony. // Learning & Memory. 2001. Vol. 12. P. 84-85.
INTERRELATION OF THE LEVEL OF SEXUAL STEROIDS IN THE BRAIN WITH THE BEHAVIOR AND THE ANXIETY OF FEMALE RATS WITH THE DIFFERENT HORMONAL STSTUS
V.A. SASHKOV
The level of the sexual steroids not only in blood, but also in limbic structures of a brain at female rats with the different hormonal status is investigated in connection with the organization of anxiety-phobic state and behavior in « an open field ». There was a selective correlation identified between the motion behavior, exploratory activities, affectivity, anxiety and the levels of testosterone and estradiol in the hypothalamus, hippocampus, amygdale, cingulated and frontal cortex in the control female rats and in the animals with the experimental high and the low of the levels of the sex steroids. Correlation analysis carried out for the above purpose confirms perception of selective use of brain structures and of separate the sexual steroids in the realization the nervous activity and behavioral adaptation.
Key words: level of the sexual steroids
УДК 616.36-004+616.36-002
ЗАКОНОМЕРНОСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ ГЕПАТОЦИТОВ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФЕТАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ПЕЧЕНИ ПРИ ЦИРРОЗЕ ПЕЧЕНИ У КРЫС (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
Э.М. ШЕНДЕР, А.Е. КОЛОСОВ*
Ключевые слова: фетальная трансплантация ткани, лазерное облучение
Приоритетные методы патогенетической терапии развиваются благодаря новым медицинским технологиям. Задача восстановления печени при циррозе, решаемая с помощью клеточной трансплантологии, возникает на основе органной недостаточности [2-3,6]. регенерация, рост и дифференцировка в ткани печени реципиента ускоряются после предварительной трансплантации ограниченного числа фетальных клеток печени человека [7,8]. Высокое избирательное воздействие на ткани человека при различной патологии стало возможным после внедрения лазеров в практическую медицину. Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), действуя на ионные каналы клеточной мембраны, способно менять ее билипидный слой, достигать митохондрий и воздействовать на рецепторы клеток [9-12].
Данная статья посвящена изучению характерного влияния трансплантации фетальных тканей печени, предварительно облученных НИЛИ, на регенерацию гепатоцитов реципиента.
Цель исследования - изучение закономерностей регенеративной активности гепатоцитов реципиента после трансплантации фетальных тканей печени, облученных НИЛИ.
Объекты и методы исследования. Объектом хронического эксперимента служили 85 половозрелых крыс-самцов линии «Вистар» средней массой 200 г. Крысы содержались в стандартных условиях вивария при 18-20°С на смешанном рационе питания со свободным доступом к воде.
Все животные были разделены на следующие группы:
1 - здоровые интактные животные;
2 - здоровые особи, которым проводили стимуляцию регенерации гепатоцитов посредством трансплантации ткани печени 20-дневных эмбрионов крыс, по морфологическому строению соответствующей печени 5-месячного зародыша человека [1];
3 - здоровые животные, которым проводилась стимуляция регенерации печени с помощью трансплантата фетальных гепа-тоцитов 20-дневных эмбрионов крыс сразу после воздействия на них НИЛИ в заданных параметрах.
Аллофетотрансплантат готовился методом гомогенизации фрагментов ткани печени. Он представлял собой суспензию с количеством жизнеспособных ядросодержащих клеток 3-5*105 [5]. Трансплантацию осуществляли посредством внутрибрюшин-ной инъекции. Животных выводили из эксперимента через сутки.
Морфологический материал фиксировался в 10% растворе формалина, обезвоживался и заливался в парафин. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, ШИК-реакцией. Морфометрическое исследование осуществлялось по методам Г.Г. Автандилова. На условной единице площади в ткани печени подсчитывались диаметры клеток и их ядер, расчитывался митотиче-
ский индекс гепатоцитов (отношение числа митозов гепатоцитов к числу способных к делению клеток печени на единицу площади).
Количество Т- и В-лимфоцитов определялось непрямым методом Кунса с помощью МКАТ («Ortho») в 1 мм2 гистологического среза ткани печени. Гепатоциты, вступившие в апоптоз, определяли с помощью специфических антител к нуклеотидам ядерной ДНК («RD systems»). Индекс апоптоза (ИА) вычисляли по % содержания клеток с позитивной реакцией на 500 клеток.
Результаты. Все результаты обрабатывались статистически по t критерию Стъюдента. При микроскопическом исследовании во всех группах животных ткань печени имела типичный рисунок строения. При морфометрическом анализе установлено, что во 2 и, особенно, в 3 группе возрастало количество гепатоци-тов, находящихся в митотическом периоде (рис.1).
Рис.1. Закономерности в протекании митотического цикла гепатоцитов (в%) у трех групп животных (р<0,05).
Отмечено, что большинство клеток находилось в периоде интерфазы, которая оказалась наиболее чувствительной к воздействию на печень. Максимальный митотический индекс зарегистрирован нами при внутрибрюшинном введении облученных НИЛИ фетальных гепатоцитов животным 3 группы. Ядерноцитоплазматическое соотношение в клетках печени смещалось в сторону ядра в большей степени у особей 3 группы. В этой группе регистрировали максимум двухядерных гепатоцитов.
У животных 2 и, особенно, 3 групп, возрастало количество Т-лимфоцитов (рис. 2).
Рис.2. Содержание Т-лимфоцитов в ткани печени в 1, 2 и 3 группах животных (р<0,05)
Возрастание числа Т-лимфоцитов в ткани печени произошло в связи с тем, что данная популяция клетки является переносчиком регенерационной информации [4]. Наряду с этим увеличение индекса апоптоза можно рассматривать как компенсаторный процесс для поддержания численного состава гепатоцитов при стимуляции их пролиферативной активности под воздействием трансплантации фетальных тканей печени (рис.3).
Рис. 3. Динамика индекса апоптоза гепатоцитов в 1, 2 и 3 группах животных (р<0,05)
Трансплантация фетальных тканей печени, предварительно облученных низкоинтенсивным лазером, здоровым крысам стимулирует у них митотическую активность гепатоцитов, повышает индекс апоптоза и увеличивает число Т-лимфоцитов.
Литература
1. Батанов А.Н. и др. // Бюл.экспер.биол. 2000.Т.130, №8. С.216-219.
2. Мулдашев Э.Р. и др. // Морфология, 2002, Т22, №3, С.109.
3. Рябинин В.Е. // Вест. транспл. и искусст. органов, 2002, №1, С.42-49.
610027, г. Киров, ул. К. Маркса, 112, Кировская ГМА
