CC BY
20
162 ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
'9 (110) август 2017 г. / том 1
УДК 617.7-007.681
О.Н. ЛЕВАНОВА1, В.А. СОКОЛОВ1, В.Г. ЛИХВАНЦЕВА2, А.А. НИКИФОРОВ1, С.А. БЕЗРУЧКО3
1Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова, 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9
2Институт повышения квалификации ФМБА России, 125310, г. Москва, Волоколамское шоссе, д. 91 3Клиническая больница им. Н.А. Семашко, 390005, г. Рязань, ул. Семашко, д. 3
Взаимосвязь продукции ММР-9 в слезе с полиморфизмом гена CFH у больных первичной открытоугольной глаукомой
Леванова Ольга Николаевна — очный аспирант кафедры глазных и ЛОР-болезней, тел. +7-920-631-86-71, e-mail: Levanova.olga2013@yandex.ru
Соколов Владимир Анатольевич — доктор медицинских наук, профессор кафедры глазных и ЛОР-болезней, тел. +7-903-835-53-07, е-mail: sva_sva@mail.ru
Лихванцева Вера Геннадьевна — доктор медицинских наук, профессор кафедры офтальмологии, тел. +7-916-659-41-56, e-mail: likhvantseva-4@yandex.ru
Никифоров Александр Алексеевич — доцент кафедры фармакологии, заведующий центральной научно-исследовательской лабораторией, тел. +7-920-970-25-03, e-mail: alnik003@yandex.ru
Безручко Светлана Анатольевна — врач функциональной диагностики, тел. +7-920-980-90-00, e-mail: Bezz75@mail.ru
В статье представлены результаты обследования 66 пациентов с впервые выявленной первичной открыто-угольной глаукомой (ПОУГ) (120 глаз) и 25 пациентов группы контроля (50 глаз). Офтальмологическое обследование дополняли лабораторно-генетическими исследованиями. В слезной жидкости обоих глаз определяли концентрацию ММР-9 «сэндвич»-методом твердофазного иммуноферментного анализа. Гзнетический анализ проводили методом полимеразной цепной реакции. Изучали однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) гена СFН (фактора комплемента Н). Установлена связь продукции ММР-9 с генотипом СFH и распространенность полиморфизма гена CFH при ПОУГ в целом.
Ключевые слова: глаукома, матриксная металлопротеиназа-9, слеза, фактор комплемента Н.
O.N. LEVANOVA1, V.A. SOKOLOV1, V.G. LIKHVANTSEVA2, A.A. NIKIFOROV1, S.A. BEZRUCHKO3
1Ryazan State Medical University named after Acad. I.P. Pavlov, 9 Vysokovoltnaya Str., Ryazan, Russian Federation, 390026
2Institute of Advanced Training of Federal Medical-Biological Agency of Russia, 91 Volokolamskoye shosse, Moscow, Russian Federation, 125371
3Clinical Hospital named after N.A. Semashko, 3 Semashko Str., Ryazan, Russian Federation, 390005
The relationship between the production of MMP-9 in tear and the CFH gene polymorphism in patients with primary open-angle glaucoma
Levanova O.N. — full-time postgraduate student of the Department of Ocular and ENT Diseases, tel. +7-920-631-86-71, e-mail: Levanova.olga2013@yandex.ru
Sokolov VA — D. Med. Sc., Professor of the Department of Ocular and ENT Diseases, tel. +7-903-835-53-07, е-mail: sva_sva@mail.ru Likhvantseva V.G. — D. Med. Sc., Professor of the Department of Ophthalmology, tel. +7-916-659-41-56, e-mail: likhvantseva-4@yandex.ru Nikiforov AA — Associate Professor of Pharmacology Department, Head of the Central Scientific Research Laboratory, tel. +7-920-970-25-03, e-mail: alnik003@yandex.ru
Bezruchko SA — doctor of functional diagnostics, tel. +7-920-980-90-00, e-mail: Bezz75@mail.ru
The article presents the results of examining of 66 patients with newly diagnosed primary open-angle glaucoma (POAG) (120 eyes) and 25 patients of the control group (50 eyes). Ophthalmic examination was complemented with genetic analysis. Concentration of MMP-9 in the lacrimal fluid in both eyes was determined with «sandwich» ELISA. Genetic analysis was performed with polymerase chain reaction. Single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of the gene СFН (complement factor H) were studied. We found the correlation between the MMP-9 production and the genotype СFH, as well as the prevalence of CFH gene polymorphism in patients with POAG in general.
Key words: glaucoma, matrix metalloproteinase-9, lacrimal fluid, complement factor H.
Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) — тяжелое заболевание, приводящее к необратимой слепоте и имеющее большое медико-социальное значение. Исследование патогенеза ПОУГ является одним из приоритетных направлений развития офтальмологии.
Многочисленные работы свидетельствуют об участии иммунной системы в механизмах прогрес-сирования ПОУГ [1, 2]. Наряду с показателями, отражающими иммунный статус — иммунорегуля-торными белками-цитокинами, субпопуляциями иммунокомпетентных клеток, в качестве перспективных маркеров признаны ферменты, отвечающие за состояние экстраклеточного матрикса в тканях, в частности, матриксные металлопротеиназы (ММР) [3]. Высказано предположение, что при глаукоме мМр-9 участвует в ремоделировании решетчатой пластинки склеры и области диска зрительного нерва [4].
Иммунная система контролирует гомеостаз на уровне организма и глаза. Сбой в ее регуляции превращает защитные механизмы в орудие повреждения нейронов,синапсов и аксонов[5,6]. Клеточный детрит выводится системой комплемента, которая является частью иммунитета. Она регулируется не-
сколькими белками, включая фактор комплемента Н ^Н) [7].
Контролирующие функции гена CFH нарушаются при мутации фактора Н, приводя к гиперэкспрессии компонентов комплемента. Система комплемента участвует в деструкции синапсов ЦНС [8, 9], что делает его причастным к нейродегенеративным заболеваниям, включая глаукому [8-12]. В связи с этим, анализ состояния гена CFH, отвечающего за регуляцию системы комплемента, становится объектом пристального внимания офтальмологов.
К настоящему времени не установлено, как связаны между собой полиморфизм гена CFH и экспрессия ММР. Между тем, и фактор комплемента Н, и ММР ассоциируются с развитием и прогрессиро-ванием ПОУГ.
Цель исследования — изучить взаимосвязь продукции ММР-9 в слезе у больных с впервые выявленной ПОУГ с различным генотипом CFH.
Материал и методы
Обследованы пациенты с ПОУГ (23 женщины и 43 мужчины). На 34 глазах была 1 стадия, на 35 — 2 стадия, на 35 — 3 стадия и 16 глазах — 4 ста-
Таблица 1.
Концентрация ММР-9 (нг/мл) в слезе у пациентов группы контроля и больных с различными стадиями ПОУГ
Группы пациентов ММР-9 (нг/мл)
Контроль интервал значений 60,0-110,0
(28 глаз) Mean±SD 80,36±14,65
1 стадия ПОУГ (34 глаза) интервал значений 90,0-155,0
Mean±SD 119,18±17,04 р<0,001
2 стадия ПОУГ (35 глаз) интервал значений 100,0-210,0
Mean±SD 130,87±24,18 р<0,001; р1<0,05
интервал значений 100,0-210,0
3 стадия ПОУГ (35 глаз) Mean±SD 146,18±25,44 р<0,001; р<0,001; р2<0,05
интервал значений 125,0-225,0
4 стадия ПОУГ (16 глаз) Mean±SD 161,56±21,81 р<0,001; р<0,001; р2<0,001; р3<0,05
Примечание: р — достоверность показателей по сравнению с контрольной группой, р1 — достоверность показателей по сравнению с 1 стадией ПОУГ, р2 — достоверность показателей по сравнению со 2 стадией ПОУГ, р3 — достоверность показателей по сравнению с 3 стадией ПОУГ
164 р ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА_'9 (110) август 2017 г. / том 1
Рисунок.
Распространенность полиморфизма гена CFH в контроле и у пациентов с ПОУГ (Цветная иллюстрация на стр. 212)
Примечание: * — достоверность отличий показателей по сравнению с контролем *р<0,05;# — достоверность межгрупповых отличий (1 и 4 стадий ПОУГ) #р<0,05;° — достоверность внутригрупповых отличий °р<0,05
Таблица 2.
Продукция ММР-9 во взаимосвязи с полиморфизмом гена СFH при глаукоме
Частота в % Контроль Группа ПОУГ
ТТ ТС ТТ ТС
ММП-9 <90 нг/мл 3 37,50% 14 70,00% 0 0,00% 0 0,00%
ММП-9 90-130 нг/мл 5 62,50% 6 30,00% 22 36,07% 36 61,02%
ММП-9 >130,0 нг/мл 0 0,00% 0 0,00% 39 63,93% 23 39,98%
Всего 8 20 61 59
Примечание: коэффициент сопряженности 0,650, р<0,001
дия заболевания. На 12 глазах заболевание еще не проявилось.
ПОУГ диагностировали в соответствии с Федеральными стандартами диагностики ПОУГ (код МКБ: 40.1). Офтальмологическое обследование дополняли лабораторно-генетическими исследованиями. Концентрацию ММП-9 в слезной жидкости обоих глаз определяли «сэндвич»-методом твердофазного иммуноферментного анализа (тест-набора фирмы «Bander Medsystems»). Генетический анализ проводили методом полимеразной цепной реакции. Изучали однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) гена CFH (фактора комплемента Н). Генотип определяли по ДНК, выделенной из лейкоцитов цельной периферической крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» и системы «SNP-экспресс-РВ» (ООО НТП «Литех», г. Москва).
Контролем служили 25 пациентов без ПОУГ (15 мужчин и 10 женщин). Группа сравнения (контроль) была рандомизирована по гендерному признаку, возрасту, распространенности сердечно-сосудистых заболеваний, аметропиям. Такой подход минимизировал роль этих факторов риска, способствуя более точной оценке роли ММР-9 во взаимосвязи с генотипом CFH.
Результаты исследования анализировали с помо-
щью пакета прикладных статистических программ SAS (Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., США) с применением стандартных алгоритмов вариационной статистики (корреляционный анализ, анализ таблиц сопряженности, различные типы межгруппового сравнения) позволяет судить о высокой достоверности данных.
Результаты исследования
Определены референтные значения для ММР-9 в слезной жидкости здоровых лиц (контроль) и у больных глаукомой (табл. 1). Средне-групповые показатели ММР-9 увеличиваются от стадии к стадии заболевания. Т.е. более высоким значениям ММР-9 соответствовали признаки усугубления патологического процесса. Затем сделана попытка установить — как связана продукция ММР-9 с генотипом CFH и распространенность полиморфизма гена CFH при ПОУГ в целом.
Гомозигот по полиморфизму Т402Н обозначали как генотип СС, гетерозигот, имеющих только одну аллель Т402Н, как генотип ТС, а гомозигот без данного полиморфизма, обозначали как генотип ТТ. Среди обследованных больных не обнаружили лиц с гомозиготным полиморфизмом по аллели 402Н (СС) в гене.
Было установлено, что распространенность гомозигот с отсутствием полиморфизма гена CFH (генотип ТТ) составляет 52% популяции ПОУГ против 32% контроля (р<0,05); частота гетерозигот (генотип ТС) — 48% против 68%, соответственно (р<0,05). Манифестация ПОУГ ассоциируется с но-сительством фактора мутации (75% гетерозигот на 1 стадии). От стадии к стадии частота гетерозигот снижается с 75% до 30% (4 стадия, р<0,05), гомозиготы, напротив, выявляются чаще, достигая 70% к 4 стадии (р<0,05) (см. рис.). Превалирование локальных мутаций по аллелю 402Н в гене фактора комплемента Н на этапе манифестации ПОУГ косвенно свидетельствовало о том, что нарушение регуляции в системе комплемента может стать предрасполагающим фактором, обуславливающим повышенную чувствительность к патогенным механизмам ПОУГ и тип иммунного реагирования в ответ на него (продукция ММП).
Достоверно чаще концентрация ММР-9 выше у больных с генотипом ТТ гена СFH, чем объяснялась аккумуляция больных с этим генотипом на более высоких стадиях ПОУГ (табл. 2). Кроме того, выявлена отрицательная корреляционная связь полиморфизма гена СFH (генотип тС) с продукцией ММР-9 (коэффициент корреляции по Пирсону г=-0,2950, р<0,001).
Обсуждение результатов
Наши данные согласуются с мнением L. Яеп (2010 г.), возлагающим на систему комплемента важную роль в патогенезе ПОУГ. Сокращение доли пациентов с гетерозиготным полиморфизмом гена CFH по мере прогрессирования заболевания объясняется тем, что у гетерозигот (генотип ТС) заболевание протекает медленнее, они дольше остаются на 1 стадии ПОУГ, а гомозиготы (генотип ТТ) ассоциируется с более агрессивным течением патологического процесса, отвечая более высоким уровнем иммунного реагирования (включая ММР-9).
Исследования выявили прямую сопряженную связь концентрации ММР-9 в слезе у больных ПОУГ с генотипом ТТ.
Таким образом, работа представила доказательства взаимосвязи продукции ММР-9 с полиморфизмом гена СFH, а также расширило список генетических мутаций, принимающих возможное участие в патогенезе ПОУГ. Кроме того, активация системы комплемента у больных ПОУГ при прогрессирова-нии заболевания представляет определенную мишень для фармакологической интервенции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Рукина Д.А., Догадова Л.П., Маркелова Е.В., и др. Иммунологические аспекты патогенеза первичной открытоугольной глаукомы // РМЖ. Клиническая Офтальмология. — 2011. — №4. — С. 162-165.
2. Лихванцева В.Г., Габибов А.А., Соломатина М.В., и др. Роль иммунных реакций в патогенезе оптической нейропатии при нормотензивной глаукоме // Национальный журнал Глаукома. — 2014. — Т. 13, №2. — С. 17-27.
3. Соколов В.А., Леванова О.Н. Роль матриксных металло-протеиназ в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы // Российский Медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. — Рязань, 2013. — №2. — С. 136-141.
4. Yan X., Tezel G., Wax M.B. Matrix metalloproteinases and tumor necrosis factor alpha in glaucomatous optic nerve head // Archives of Ophthalmology. — 2000. — Vol. 5. — P. 666-674.
5. Tezel G., Wax M. The mechanisms of hsp27 antibody-mediated apoptosis in retinal neuronal cells // J. Neurosci. — 2000. — Vol. 20. — Р. 3552-3562.
6. Wax M.B. Induced autoimmunity to heat shock proteins elicits glaucomatous loss of retinal ganglion cell neurons via activated T-cell-derived fas-ligand // J. Neurosci. — 2008. — Vol. 28, №46. — Р. 12085-12096.
7. Zipfel P. Complement and immune defense: from innate immunity to human diseases // Immunol. Lett. — 2009. — Vol. 126. — Р. 1-7.
8. Stevens B. The classical complement cascade mediates CNS synapse elimination // Cell. — 2007. — Vol. 131. — Р. 1164-1178.
9. Ren L., Danias J. A role for complement in glaucoma? // Adv. Exp. Med. Biol. — 2010. — Vol. 703. — Р. 95-104.
10. Rosen A., Stevens B. The role of the classical complement cascade in synapse loss during development and glaucoma // Adv. Exp. Med. Biol. — 2010. — Vol. 703. — Р. 75-93.
11. Jha P. Complement mediated apoptosis leads to the loss of retinal ganglion cells in animal model of glaucoma // Mol. Immunol. — 2011. — Vol. 48 (15-16). — Р. 2151-2158.
12. Howell G. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma // J. Clin. Invest. — 2011. — Vol. 121, №4. — Р. 1429-1444.
ОФТАЛЬМОЛОГИЯ |
