CC BY
10УДК 636.2.082.22
М.Е. Михайлова1, Н.М. Волчок1, Норис Роа2, Карин Дрешер2
ВЗАИМОСВЯЗЬ ПРИЗНАКОВ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С (-1689) ПОЛИМОРФИЗМОМ ГЕНА АЛЬФА-ЛАКТАЛЬБУМИНА (a-LA)
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2Институт сельскохозяйственных исследований Боливарианская республика Венесуэла
Введение
Известно, что количество белков в молоке и их структура имеют большое экономическое значение для перерабатывающей промышленности и в значительной степени определяют количество и технологические свойства молока. Одним из таких биологически значимых протеинов является многофункциональный белок - а-лактальбумин (а-ЬЛ), входящий в состав молочной сыворотки, наличие которого является важным признаком качества молока, характеризующим его полезные свойства.
Этот небольшой глобулярный протеин, состоящий из 123 аминокислот и имеющий молекулярную массу 14кД, играет важную роль в биосинтезе лактозы. При участии эпителиальных клеток молочной железы, а-ЬЛ в комплексе с галактозилтрансферазой участвует в формировании фермента лактозсин-тазы, который, в свою очередь, синтезирует лактозу в аппарате Гольджи, а лактоза, затем, в комплексе с а-ЬЛ секретируется в молоко. Содержание а-ЬЛ и лактозы в коровьем молоке составляет около 1,5 г/л, что соответствует 5%. Лактоза, содержащаяся в секреторных везикулах эпителиальных клеток молочных желез, создает внутри клетки повышенное осмотическое давление, благодаря которому внутрь везикул поступает вода. Таким образом, повышение концентрации а-ЬЛ, являющегося ключевым регулятором синтеза лактозы, вызывает пропорциональное увеличение выхода молока [1].
Ген, кодирующий бычий а-лактальбумин (а-ЬЛ), локализован у КРС в 5 хромосоме и
состоит из 2023 п.н., включая 4 экзона и 3 интрона. Ген а-ЬЛ характеризуется наличием нескольких полиморфных вариантов: в позициях +15, +21, +54 [2] и -1689 [3], относительно точки старта транскрипции 5' фланкирующего региона. Вариабельность в этом регионе может приводить к различной способности связывания РНК-полимеразы и факторов транскрипции, участвующих в регуляции экспрессии гена. Теоретически, замены в последовательности генетических регуляторных элементов в данном участке могут изменять степень экспрессии мРНК, кодируемой этим геном [1].
Данные полиморфизмы являются следствием точковых мутаций, в частности в позиции -1689, замена аденина на гуанин приводит к образованию двух аллельных вариантов гена. Аде-нин в этой позиции был обозначен как А-аллель, а гуанин - как В-аллель [2,3]. Ьипёеп Л. с соавторами была показана взаимосвязь между (-1689) полиморфизмом и концентрацией лактозы в молоке. Так у коров с АА-генотипом с 1 кг молока выделяется лактозы больше на 0,08 %, чем у особей с другими генотипами [4].
Таким образом, учитывая роль а-лакталь-бумина в биосинтезе лактозы и продукции молока в целом, ген а-ЬЛ может быть использован как потенциальный генетический маркер молочной продуктивности КРС, в частности, удойности и белковомолочности.
Целью данного исследования было изучить (-1689) полиморфизм 5' фланкирующего региона гена а-лактальбумина, провести анализ генетической структуры популяций
КРС некоторых животноводческих комплек- чить взаимосвязь данного полиморфизма с сов Беларуси по локусу а-ЬЛ, а также изу- признаками молочной продуктивности.
Материалы и методы
Исследования проводились на коровах и быках черно-пестрой породы, принадлежащих животноводческим комплексам Минской области. Для анализа были использованы образцы свежезамороженной спермы и крови. Выделение ДНК проводилось методом солевой экстракции по стандартной методике [5]. Выделенную ДНК ресуспензировали и измеряли ее концентрацию с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле, используя маркер молекулярного веса GeneRulerTM1kb DNA Ladder.
С целью типирования аллельных вариантов гена a-LA использовали метод ПЦР с последующим анализом ПДРФ. На основе данных о сиквенсе участка гена, в котором был обнаружен (-1689) полиморфизм [3], было синтезировано два олигонуклеотидных праймера, которые амплифицируют участок, размером 430 п.н., расположенный в пределах от - 1803 до -1373, относительно точки старта транскрипции:
ALF-LAC1: 5'-aag agt tgg atg gaa tca cc-3' ALF-LAC2: 5'-ttc aaa ttg ctg gca tca agc-3' ПЦР проводили на программируемом тер-моциклере «Biometra» (Германия) в объеме
20 мкл, содержащем:2 мкл10 х ПЦР-буфера, 2 мкл MgCI2 (25 мМ), 0,5 мкл dNTP(10мМ), по 1 мкл каждого из праймеров (10 пМ/мкл), 0,3 мкл Tag-полимеразы (5еа / мкл), 2 мкл ДНК (20 нг/мкл). Вариант программы реакции амплификации состоял из следующих этапов: первичное плавление матрицы - 5 мин - 94°С; 30 циклов (30с - 95°С; 30с - 63°С; 30с - 72°С); синтез - 10 мин при 72°С. Полученный таким образом амплификат подвергался гидролизу рестрицирующей эндонуклеазой Sdu 1 в соответствующем буфере [6]. Продукты рестрикции разделяли в 2% агарозном геле в течение часа при напряжении 40 (в качестве маркера использовали 50 br DNA Lader (Fermentas)), визуализировали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм и регистрировали с помощью цифровой фотокамеры Canon. Ал-лельные варианты гена a-LA определяли по количественным и качественным признакам ПДРФ. Наличие двух полос размером 328 и 102 пн. соответствовало генотипу АА; четырех полос размером 328, 211, 117 и 102 пн. — генотипу АВ, трех полос размером 211, 117 и 102 пн. - генотипу ВВ.
Результаты и обсуждение
Как отмечено в работах других исследователей наиболее предпочтительным генотипом, ассоциированным с повышенным содержанием лактозы в молоке, а, следовательно, с повышенным удоем, является генотип АА [2, 4]. Проведенный нами анализ генетической структуры популяций КРС по локусу а-ЬЛ выявил следующее распределение частот генотипов: АА- 45,9%; АВ - 43,3% и ВВ -
10,8%. Частота встречаемости аллелей А и В в среднем составила 0,68 и 0,32 соответственно (табл.1), что согласуется с данными, полученными зарубежными коллегами [2,3]. Наибольшая частота предпочтительного А-аллеля была зарегистрирована в популяции РСУП «Минскплемпредрприятие», где она составила 0,73, а наименьшая в РУСПП «1-я Минская птицефабрика» - 0,54.
Таблица 1
Генетическая структура популяций быков и коров белорусской черно-пестрой породы
по локусу а-лактальбумина
Принадлежность Количество особей (п) Частота встречаемости
генотипов, % аллелей
АА АВ ВВ А В
РСУП «Минск племпредрприятие» 148 56,1 33,8 10,1 0,73±0,036 0,27±0,036
РУСП «Племенной завод Красная звезда» 50 40,0 46,0 14,0 0,63±0,068 0,37±0,068
СПК «Агрокомбинат «Снов» 290 47,6 45,5 6,9 0,70±0,027 0,30±0,027
РУСПП «1-я Минская птицефабрика» 98 28,6 50,0 21,4 0,54±0,050 0,46±0,050
Всего 586 45,9 43,3 10,8 0,68±0,019 0,32±0,019
Для выяснения ассоциации аллельных вариантов гена а-ЬЛ с молочной продуктивностью КРС, а именно, общим удоем за 305 суток, процентным содержанием жира и белка в молоке, нами была проведена теоретическая оценка коров по данным признакам на основании информации, содержащейся в племенных
картах. Полученные результаты были проанализированы и сопоставлены, с целью чего для каждого животного рассчитывались средние значения показателей вышеперечисленных признаков. Затем среднее значение каждого из показателей было рассчитано для отдельной группы генотипов (табл. 2).
Таблица 2
Средние показатели продуктивности коров по аллельным вариантам гена а-ЬЛ
Удой (л) Жир (%) Белок(%)
а-ЬЛАА 9517,4±106,8 3,78±0,03 3,17±0,01
а-ЬЛАВ 9269,0±101,8 3,79±0,02 3,18±0,01
а-ЬЛВВ 9006,2±179,8 3,88±0,02 3,17±0,01
10000
9500
9000
8500
АА
АВ
ВВ
8000
Генотип
□ АА ■ АВ
□ ВВ
Рис. 1. Средний показатель удоя за 305 сут. лактации у коров разных генотипов.
Из представленной диаграммы, очевидно, что наибольший уровень продуктивности по показателям общего удоя характерен для ко -ров с генотипом а-ЬЛАА. Особи с генотипом а-ЬЛВВ имеют по удою наименьшие показатели. В частности, рассчитано, что животные с генотипом а-ЬЛАА имеют в среднем, на 5,4% больший показатель по этому признаку по сравнению с особями , обладающими а -ЬЛ ВВ генотипом (рис.1).
Относительно показателей процентного содержания в молоке белка и жира не было выявлено статистически достоверных различий между обладателями а-ЬЛАА и а-ЬЛВВ генотипов.
Таким образом, проведение генотипирова-ния крупного рогатого скота по (-1689) полиморфизму гена а-ЬЛ, с целью выявления ценных аллельных вариантов, можно использовать в маркер-зависимой селекции, направленной на увеличение удоя.
Заключение
Проведено ДНК-типирование аллельного варианта А гена а-лактальбумина в популяциях КРС, определены частоты данного аллеля в различных хозяйствах. Экспериментально доказана ассоциация (-1689) полиморфизма гена а-ЬЛ с признаками молочной продуктивности, в част-
ности - положительная корреляция А аллеля с общим удоем. Показана возможность практического использования метода ПЦР-типирования крупного рогатого скота по гену а-ЬЛ в маркер-зависимой селекции, направленной на увеличение продукции молока.
Список использованных источников
1. Bleck, G.T., Bremel, R.D. Correlation of the a-lactalbumin (+15) polymorphism to milk production and milk composition of holsteins // J. Dairy Sci. - 1993. - Vol. 76. -P. 2292-2298.
2. Bojarojc-nosowicz, B., Kaczmarczyk, E., Bongarc, E., Malolepszy, J. Natural BLV infection and polymorphism within the 5' flanking region of the a-lactalbumin gene in black-and-white breed cattle // Bull Vet. Inst. Pulawy.-2005. - Vol. 49. - P. 439-442.
3. Voelker, G.R., Bleck, G.T., Wheeler, M B. Single-base polymorphisms within the 5' flanking region of the bovine a-lactalbumin gene //
J. Dairy Sci. - 1997. - Vol. 80. - P. 194-197.
4. Lunden, A., Lindersson, M. a-Lactalbu-min polymorphism in relation to milk lactose // "Proc. Vlth World Congr. on Gen. Appl. to Livestock Prod., Armidale, NSW, Australia, 11-16 January". - 1998. - Vol. 25. - P. 47-50.
5. Зиновьева, Н.А., Гладырь, Е.А., Эрнст, Л.К., Брем, Г. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных. - Дубровицы. - 2002. - 112 с.
6. Kaminski, S. Identification of Sdu I polymorphism within 5' flanking region of bovine alpha-lactalbumin gene // Anim. Sci. Pap. Rep-1999. - Vol. 17. - P. 23-27.
Дата поступления статьи 16 июня 2011 г.
