CC BY
34
© Насиров М. Я., Джамалов Ф. Г., Джамалова Т. П., Захидов З. Т., Гараев Г. Ш., Алекберова С. А. УДК 616.12 008
Насиров М. Я., Джамалов Ф. Г., Джамалова Т. П., Захидов З. Т., Гараев Г. Ш., Алекберова С. А.
ВЗАИМОСВЯЗЬ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА И ЦИТОКИНОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХЕ
Азербайджанский медицинский университет (г. Баку, Азербайджан)
nauchnayastatya@yandex.ru
Данная работа является фрагментом выполняемой диссертации на соискание ученой степени доктора философии по медицине: «Изучение процессов повреждения и апоптоза гепатоцитов при механической желтухе и роль их коррекции в улучшении результатов хирургического лечения».
Вступление. Механическая желтуха (МЖ) - тяжелый симптомокомплекс, развивающийся как осложнение ряда заболеваний гепатопанкреатобили-арной системы, которые сопровождаются стойкой непроходимостью магистральных желчных протоков. При этом отток желчи в кишечник значительно затрудняется или становится полностью невозможным [6]. Накопление желчных кислот с поверхност-ноактивными свойствами вызывает повреждение гепатоцитов и усиление холестаза [7]. Развивающиеся холестаз, желчная гипертензия, ахолия вызывают серьезные функциональные и морфологические изменения печени, которые приводят к сравнительно быстрому развитию печеночно-клеточной недостаточности [4].
Основным пусковым фактором в развитии пе-ченочно-клеточной недостаточности (ПКН) до недавнего времени считалась гипоксия печеночных клеток в результате холестаза, угнетение процессов тканевого дыхания и окислительного фосфорили-рования, снижение биоэнергетических процессов в митохондриях гепатоцитов [1,10]. В свою очередь, ключевым звеном в развитии некрозов гепатоцитов считают повреждение под влиянием желчных кислот (хенодезоксихолевой, хенохолевой и литохолевой) мембран митохондрий, уменьшение синтеза АТФ в клетке, повышение внутриклеточной концентрации Са2+, стимуляцию кальцийзависимых гидролаз [5]. Развившийся энергетический дефицит и митохон-дриальная дисфункция приводят к нарушению баланса между прооксидантными и антиоксидантны-ми системами клетки и, тем самым, провоцируют развитие оксидативного стресса [7].
На сегодняшний день все больше внимания уделяется изменению иммунного статуса у пациентов с ПКН [2]. Уже в первых работах по иммунопатологии печени, был сделан вывод о возможной центральной роли иммунных механизмов в возникновении и поддержании воспалительно-деструктивных процессов в паренхиме органа [9].
Иммунные клетки секретируют многочисленные растворимые медиаторы, часть которых является высокоспецифическими [3]. Вне воспалительной реакции и иммунного ответа цитокины в крови со-
держатся в чрезвычайно малом количестве. Усиленный синтез цитокинов начинается в ответ на проникновение в организм микроорганизмов или повреждение тканей. По данным некоторых исследователей, оксидативный стресс (ОС) может быть активатором системы провоспалительных цитокинов. Продукты перекисного окисления липидов клеточных мембран, кроме прямого цитотоксического действия, обладают также и медиаторной активностью, являясь связующим звеном между иммунными и нейрогуморальными сдвигами в условиях измененного кровообращения. С другой стороны, в ряде работ описывают механизмы стимуляции и индукции активности провоспалительных цитокинов реактивными формами кислорода [8].
Согласно мнению многих клиницистов, ОС и им-муновоспалительные изменения, являясь звеньями патогенеза заболеваний, взаимосвязаны и могут индуцировать друг друга по принципу порочного круга. Определение степени иммунодефицита, а также факторов и механизмов, приводящих к развитию местных и системных осложнений, является чрезвычайно важным для правильного ведения больных в послеоперационном периоде.
Цель исследования — изучить взаимосвязь показателей некоторых цитокинов и биохимических маркеров оксидативного стресса при экспериментальной механической желтухе.
Объект и методы исследования. Экспериментальные исследования были проведены на 30 белых крысах линии Винстар обоего пола массой 180-220 г. Метки и индивидуальные номера животных регистрировали в протоколах лабораторных испытаний. Животных содержали в условиях вивария на неограниченном потреблении корма и воды. Ограничение потребление корма было только в день операции. Лапаротомия и забор крови выполнялись после вывода животных из эксперимента методом декапита-ции под анестезией. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (ЕТБ N 123, Страсбург, 18 марта 1986 г.).
Механическую желтуху вызывали у крыс путем наложения лигатуры на общий желчный проток под наркозом. Крысам под общей анестезией проводилась срединная лапаротомия, органы брюшной полости сдвигались и выделялся общий желчный проток. Общий желчный проток перевязывали двумя лигатурами 4-0, после чего органы брюшной поло-
сти крысы аккуратно возвращались на прежнее положение, и проводили послойное ушивание операционной раны.
Животных делили на 2 группы. 1 Группа (п=5) являлась контрольной. Животным 2 группы (опытной) (п=25) перевязывали желчный проток для создания модели механической желтухи. Животных опытной группы в свою очередь делили на 5 подгрупп, в каждой по 5 голов соответственно. Такое деление производилось с учетом того, что у крыс производили забор крови для биохимических исследований на 1, 3, 7, 10 и 15 сутки после моделирования у них механической желтухи.
Активность процессов ПОЛ (перекисного окисления липидов) оценивали по динамике некоторых показателей ПОЛ-АОС (антиоксидантной системы): активность МДА (малонового диальдегида), ДК (диенового коньюгата) как маркеров ПОЛ, и активность каталазы, СОД (супероксиддисмутазы), Ре (железа) в качестве показателей АОС.
Показатель МДА оценивали в реакции с 2-тио-барбитуровой кислотой (ТБК) с помощью набора фирмы «Агат». Содержание ДК определяли по методу Гаврилова В.Б. (1988). Активность СОД определяли в гемолизате эритроцитов по методу Сирота ТВ. (1999 г.) Активность каталазы плазмы определяли по методу М.А. Королюк (1988). Определение 11_-6 проводили иммуноферментным методом с помощью набора ЗАО «Вектор - Бест» в диапазоне концентраций 1_-5,6-300 пг/мл, ТЫР@-0-250 пг/мл, аппарат Вюзкгееп-М8-2000.
Полученные цифровые данные обрабатывали методом вариационной статистики, с использованием критерия Ван-дер-Вардена.
Результаты исследований и их обсуждение. Результаты, полученные при исследовании, представлены в таблице. Анализ активности изучаемых провоспалительных
мере увеличения продолжительности созданной механической желтухи и достигла максимальной концентрации в случае с IL-6 к 7 суткам, составляя 13,5801±3,364, что в 18,2 раза выше нормы, а уровень TNF@ уже к 3 суткам приравнивался к 21,30±1,13, что в 4,6 раз превышал норму. Данный факт, во-первых, подтверждает существующее мнение о том, что при воспалительном процессе происходит активация выработки провоспалительных цитокинов, а во-вторых то, что такое осложнение как механическая желтуха ещё больше способствует повышению их уровня. Как видно из таблицы, после достижения максимальной концентрации, в дальнейшем происходит некоторое снижение их уровня. К 15 суткам от начала эксперимента величина IL-6 превышала аналогичную контрольной группы в 5.4 раза (р<0,001), a TNF@ уже на 45,9% (р<0.05). Наблюдающееся относительное снижение изучаемых показателей соответствует представлениям о том, что выработка цитокинов может снижаться при длительном течении заболевания, что, по мнению многих клиницистов, объясняется с одной стороны истощением иммунной системы, с другой — патологической их потерей вследствие некроза или апоптоза.
Итак, установлено, что при моделировании механической желтухи у крыс наблюдается двухфазный характер изменений величин цитокинов — вначале повышение, а по мере увеличения длительности заболевания — снижение.
Подобная же тенденция наблюдалась и относительно продуктов ПОЛ, т. е. процесс и в этом случае носил двухфазный характер. Содержание МДА и ДК повышалось до 7-х суток, достигая максимальной концентрации, что превышало нормальный уровень в 5,1 и 3,5 раз (р<0,01), затем несколько снижалось, хотя показатели все равно оставались выше, чем у
цитокинов-интер-лейкина-6 (IL6) и фактора некроти-зирующего опухоль (TNF@) в сыворотке крови экспериментальных животных показал значительное повышение их уровня по сравнению с контрольной группой. Так, например, уже через сутки после моделирования механической желтухи, величины показателей IL6 и TNF@ увеличились в 8,7 и 3,8 раз соответственно по отношению к норме (р<0,001). Концентрация этих цитокинов в крови возрастала по
Таблица.
Показатели перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и цитокинов в крови на модели механической желтухи
Показатели Контрольная группа Основная группа
1 сутки 3 сутки 7 сутки 10 сутки 15 сутки
МДА mkm/l 2,4±0,13 2,08-2,88 3,43±0,15 2,99-3,78 ** 9,55±1,67 6,77-16,1 ** 12,32±1,03 9,77-14,6 ** 10,03±0,71 7,87-12,2 ** 5,69±0,33 4,69-6,71
ДК Д232/т1 0,544±0,034 0,48-0,67 1,66±0,0081 1,44-1,92 ** 1,714±0,049 1,56-1,87 ** 1,92±0,068 1,69-2,1 ** 1,338±0,129 0,98-1,77 ** 1,134±0,0087 0,81-1,33
Каталаза mkat/l 12,4±0,5 1,66-13,84 15,0±0,6 13,65-16,89 ** 20,6±1,0 17,87-23,88 ** 21,9±2,0 14,2-24,82 ** 19,5±1,0 16,42-22,46 ** 16,3±0,7 14,21-18,42
Fe mkmol/l 44,1±3,6 36,8-54,9 50,8±2,6 42,7-59,2 60,4±2,8 51,5-69,2 * 107,3±8,2 85,6-130,6 ** 84,9±4,8 71,7-98,4 ** 58,5±2,0 52,6-63,9 *
TNF@ Pq/ml 4,66±0,23 4,09-5,23 17,48±1,39 14,7-22,4 ** 21,30±1,13 19,34-25,6 ** 18,88±2,43 11,2-26,5 ** 10,30±1,44 5,8-14,9 ** 6,80±0,65 4.8-8,9 *
IL-6 Pq/ml 0,746 0,149 0,46-1,2 6,474±0,425 5,15-7,51 ** 9,348±0,401 8,1-10,3 ** 13,580±3,364 3,4-24,5 ** 7.600±1,34 4,8-12,7 ** 4,060±0,635 2,2-6,1
Примечание: статистическая значимость различий с показателями контрольной группы х — р<0,05; хх — <0,01.
контрольной группы. Интенсификация процессов ПОЛ сопровождалось резким угнетением содержания СОД, несмотря на относительное повышение других показателей АОЗ.
Таким образом, концентрация продуктов пере-кисного окисления липидов возрастала параллельно увеличению уровня цитокинов. Незначительное снижение исследуемых показателей на длительных сроках заболевания может быть следствием большой продолжительности патологического процес-
Наблюдаемая динамика изменений вышеуказанных показателей свидетельствовала как об их взаимозависимости, так и о зависимости их от длительности заболевания. А взаимовлияние изучаемых параметров, в свою очередь, дает возможность рассматривать способы их взаимокоррекции посредством использования различных средств и методов, имеющихся на сегодняшний день в медицине.
Выводы
1. Повышение уровней цитокинов и продуктов перекисного окисления липидов при создании механической желтухи у экспериментальных животных свидетельствует о вовлечении оксидативного стресса и иммуновоспалительных процессов в патогенез данного заболевания.
2. При механической желтухе имеет место активация системы перекисного окисления липидов с незначительным усилением антиоксидантной защиты и индукция цитокинов.
3. Параллельное увеличение и снижение цитокинов с продуктами перекисного окисления липидов свидетельствует об их взаимовлиянии.
Перспективы дальнейших исследований. Планируется дальнейшее изучение факторов и механизмов, приводящих к развитию осложнений у больных в послеоперационном периоде.
Литература
1. Алтыев Б.К. Комплексное лечение гнойного холангита у больных неопухолевой обструкции внепеченочных желчных протоков / Б.К. Алтыев, Ф.Г. Назыров, М.Х. Ваккасов, Х.Т. Садыков // Анналы хирург гепатологии. - 2003. - Т. 3, № 3. - С. 30.
2. Баширов А.Б. Иммунокоррекция при хирургическом лечении механической желтухи / А.Б. Баширов, А.Е. Алибеков // Сборник тез. докл. III конгр. ассоц. хирургов им. Н. И. Пирогова. - М., 2006. - С. 181-182.
3. Бельмер С.В. Значение цитокинов в патогенезе воспалительных заболеваний толстой кишки у детей / С.В. Бельмер, А.С. Симбирцев, О.В. Головенко [и др.] // РМЖ. — 2003. — Т. 11, № 3. — С. 17-22.
4. Визгалов С.А. Экспериментальная модель желтухи и профилактика возникающих нарушений в печеночной ткани [Электронный ресурс] / С.А. Визгалов, В.П. Юрченко, М.П. Левкович // Кжшчна анатомiя та оперативна хiрургiя. - 2004. - Т. 3, № 2. — С. 30-31.
5. Давыдов В.Г. Количественная оценка гибели гепатоцитов и динамика некоторых биохимических параметров крови и желчи при экспериментальной механической желтухе / В.Г. Давыдов, С.В. Бойчук, Р.Ш. Шаймарданов [и др.] // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2007. - Т. 18, № 1. - С. 25-31.
6. Пьянкова О.Б. Клинико-эпидемиологическая характеристика больных с синдромом механической желтухи доброкачественного генеза / О.Б. Пьянкова, Ю.Б. Бусырев, Т. И. Карпунина // Медицинский альманах. - 2009. - № 2 (7). - С. 173-176.
7. Рязанов Д.Ю. Лечение холедохолитиаза, осложненного механической желтухой, с использованием препарата эспалипон / Д.Ю. Рязанов, Ю.А. Михеев // Международный медицинский журнал. - 2006. - № 2. - С. 115-117.
8. Bozkurt B. Activation of cytokines as a mechanism of disease progression in heart failure / B. Bozkurt // Ann. Rheum. Dis. — 2000.
— Vol. 59. — P. 90-93.
9. Peng W.K. Role of liver function tests in predicting common bile duct stones in acute calculous cholecystitis / W.K. Peng, Z. Sheikh, S. Paterson-Brown, S.J. Nixon // British Journal of Surgery. - 2005. - Vol. 92, № 10. - P. 1241-1247.
10. Wagner M. New molecular insights into the mechanisms of cholestasis / M. Wagner, G. Zollner, M. Trauner // Journal of Hepatology.
- 2009. - Vol. 51, № 3. - P. 565-580.
УДК 616.12 008
ВЗАеМОЗВ'ЯЗОК ОКСИДАТИВНОГО СТРЕСУ I ЦИТОК1Н1В ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬН1Й МЕХАН1ЧН1Й ЖОВТЯНИЦ1
HacipoB М. Я., Джамалов Ф. Г., Джамалова Т. П., Захщов З. Т., Гараев Г. Ш., Алекберова С. А. Резюме. Стаття присвячена вивченню змш, що вщбуваються у кров1 щур1в пюля вщтворення у них механично! жовтяниц1. У проведеному досл1дженн1, пюля вщтворення у експериментальних тварин холестазу шляхом перев'язки загально! жовчно! протоки, оцшювалася динамка змш активност1 в кров1 циток1н1в, а також !х взаемозв'язок з показниками перекисного окислення лтщв. В результат! проведеного експери-менту було встановлено, що пюля виникнення холестазу у пщдослщних тварин, значне пщвищення р!вня цитоюыв та показниюв перекисного окислення лтщв спостеркаеться вже з першо! доби пюля моделюван-ня та процес в ц!пому носить двофазний характер. Така динамка змш вищевказаних показниюв свщчила як про !хню взаемозалежнють, так i про залежнють !х вщ тривалост! захворювання.
Ключовi слова: цитокши, оксидативний стрес, антиоксидантний захист, мехаычна жовтяниця.
УДК 616.12 008
ВЗАИМОСВЯЗЬ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА И ЦИТОКИНОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХЕ
Насиров М. Я., Джамалов Ф. Г., Джамалова Т. П., Захидов З. Т., Гараев Г. Ш., Алекберова С. А.
Резюме. Статья посвящена изучению происходящих в крови изменений у крыс, после воссоздания у них механической желтухи. В проведенном исследовании, после воссоздания у экспериментальных животных холестаза путем перевязки общего желчного протока, оценивалась динамика изменений активности в крови цитокинов, а также их взаимосвязь с показателями перекисного окисления липидов. В результате проведенного эксперимента было установлено, что после возникновения холестаза у подопытных животных, значительное повышение уровня цитокинов и показателей перекисного окисления липидов наблюдается уже с первых суток после моделирования и процесс в целом носит двухфазный характер. Наблюдаемая динамика изменений вышеуказанных показателей свидетельствовала как об их взаимозависимости, так и о зависимости их от длительности заболевания.
Ключевые слова: цитокины, оксидативный стресс, антиоксидантная защита, механическая желтуха.
UDC 616.12 008
THE RELATIONSHIP OF OXIDATIVE STRESS AND CYTOKINES IN EXPERIMENTAL OBSTRUCTIVE JAUNDICE
Nasirov M. Y., Djamalov F. G., Djamalova T. P., Zahidov Z. T., Garayev G. Sh., Alekberova S. A.
Abstract. The goal is to examine the relationship between the indicators of some cytokines and biochemical markers of oxidative stress in experimental obstructive jaundice.
Methods. The pilot study was conducted on 30 white rats of Vinstar line both sexes weighing 180-220 g. Mechanical jaundice caused in rats by ligating the common bile duct under General anesthesia. Rats under General anesthesia was performed median laparotomy, the abdominal organs shifted and stood out of the common bile duct. The common bile duct was ligated with two ligatures of 4-0, after which the abdominal cavity of the rat was gently returned to its former position, and carried out layer-by-layer suturing of the surgical wound. Animals were divided into 2 groups. Group 1 (n=5) was control. Animals of group 2 (experienced) (n=25) were bile duct ligated to create a model of obstructive jaundice. Animals of the experimental group in turn was divided into 5 subgroups, each with 5 goals respectively. In rats produced blood sampling for biochemical analysis at 1, 3, 7, 10 and 15 days after modeling they have obstructive jaundice. Activity of processes of lipid peroxidation (LPO) was evaluated by the dynamics of some indicators of LPO-AOS (antioxidant system): the activity of MDA (malondialdehyde), DK (diene conjugate) as markers of GENDER, and activity of catalase, SOD (superoxide dismutase), Fe (iron) as indicators of AOS.
Results. Analysis of the activity of the investigated proinflammatory cytokines interleukin-6 (IL6) and tumor necrotizing factor (TNF@) in the blood serum of the experimental animals showed a significant increase of their level compared to the control group. The concentration of these cytokines in the blood increased with increasing duration created of jaundice and reached maximum concentrations in the case of IL-6 to 7 days, making 13,5801±3,364, 18.2 times higher than normal, and the level of TNF@ is already for 3 days was equivalent to 21,30±1,13, 4.6 times higher than normal. To 15 days from the start of the experiment, the magnitude of IL-6 were higher than the control group, 5.4% (p<0.001), a TNF@ is already 45.9% (p<0.05). The observed relative decrease of the studied parameters consistent with the concept that cytokine production may decrease with prolonged duration of the disease, which, according to many clinicians, due on the one hand the depletion of the immune system, on the other — pathological their loss due to necrosis or apoptosis.
So, it is established that in modeling of obstructive jaundice in rats observed biphasic nature of the changes of the values of the cytokines — in the beginning, the increase, and with increasing duration of disease — reduced. A similar trend was observed relative to Pol products, i. e. the process in this case wore a two-phase character. The contents of MDA and DC increased to 7 days, reaching a maximum concentration that exceeded the normal level of 5.1 and 3.5 times (p<0.01), then decreased a little, although the rates still remained higher than in the control group.
Conclusion. The observed dynamics of changes of the above indicators showed as of their interdependence, and, depending on their disease duration.
Keywords: cytokines, oxidative stress, antioxidant protection, mechanical jaundice.
Рецензент — проф. Костенко В. О.
Стаття надшшла 04.10.2016 року
