CC BY
53
УДК 616.36-002.2:612.351.11
взаимосвязь экспрессии гемоксигеназы-1 и активности апоптотических
процессов в печени крыс при неалкогольном стеатогепатите
Н.В. Бивалькевич, Ю.К. Караман
Владивостокский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения (690105, г. Владивосток, ул. Русская, 73г)
Ключевые слова: экспериментальный гепатит, апоптоз, фактор некроза опухоли-а, гемоксигеназы.
На экспериментальной модели установлено, что формирование неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) сопровождается увеличением экспрессии гемоксигеназы-1, количества апоп-тотических гепатоцитов и концентрации фактора некроза опухоли-а (ТОТ-а) в печени крыс. Повышение уровня апоп-тоза положительно коррелирует с концентрацией ТОТ-а (что свидетельствует о цитокинзависимом пути его активации) и отрицательно - с активностью гемоксигеназы-1. Возможно, что активация гемоксигеназы-1 при НАСГ компенсирует ТОТ-а-опосредованный апоптоз гепатоцитов.
Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является хроническим прогрессирующим заболеванием печени, характеризующимся жировой инфильтрацией гепатоцитов, воспалением и фиброзом. По разным оценкам, распространенность НАСГ составляет от 3 до 8 % в общей популяции [2]. До сих пор не установлены точные механизмы патогенеза неалкогольного стеатогепатита и причины, ведущие к формированию прогрессирующих форм данного заболевания. Принято считать, что гибель гепатоцитов в ответ на окислительный стресс становится ключевым патогенетическим фактором неалкогольного стеатогепатита. Увеличение при этом числа клеток, подвергшихся некрозу и апоптозу, приводит к прогрессированию НАСГ [12].
В последнее время интерес ученых направлен на исследование особых микросомальных ферментов -гемоксигеназ, основная функция которых заключается в катаболизме гема с образованием биливердина, свободного железа (Fe2+) и монооксида углерода [6]. В печени обнаружено три изоформы гемоксигеназ: индуцибельная гемоксигеназа-1, конститутивная ге-моксигеназа-2 (основная форма существования фермента в физиологических условиях) и каталитически неактивная гемоксигеназа-3 [6, 13, 14]. В условиях стресса активность гемоксигеназы-1 может возрастать более чем в 10 раз, при этом интенсивность экспрессии конститутивной формы фермента остается без изменения [11]. Известно, что гемоксигеназа и продукты гем-деградации проявляют сильные цитопротективные свойства [3, 5]. Индукция клетками гемоксигеназы-1 способствует снижению интенсивности окислительных процессов, ингибирует синтез провоспалительных (в частности фактор некроза опухоли-а - TNF-а) и стимулирует выработку противовоспалительных ци-токинов [5, 9, 14]. Известна способность гемоксигеназы
Бивалькевич Наталия Владимировна - м.н.с. лаборатории биомедицинских исследований Владивостокского филиала ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ МКВЛ; тел.: +7 (423) 232-58-36, e-mail: lbmi@yandex.ru
ингибировать апоптоз клеток печени [15]. Отсюда следует, что изменение активности гемоксигеназы-1 в печени может рассматриваться в качестве одного из главных патогенетических факторов НАСГ.
Цель исследования: проанализировать взаимосвязь активности гемоксигеназы-1 с уровнем апоптоза гепатоцитов и провоспалительного цитокина (TNF-а) в печени крыс при неалкогольном стеатогепатите.
Материал и методы. Исследования выполнены на 20 половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 173,0±5,6 г. Модель НАСГ формировали содержанием животных на высокожировой диете, состоящей из топленого говяжьего сала и холестерина (19 и 2 % от общей массы рациона соответственно) в течение 90 суток [4]. Контрольную группу составили 10 крыс, находившихся на стандартном рационе вивария. Эвтаназию животных осуществляли путем декапитации под эфирным наркозом в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 ЕЕС.
Образцы центральной части левой доли печени фиксировали в 10 %-ном растворе нейтрального формалина, приготовленного на 0,07М фосфатном буфере (рН 6,98). Для гистологических исследований кусочки тканей подвергали дегидратации в этиловом спирте возрастающей концентрации и заливали в парапласт [8]. Готовили срезы толщиной 7 мкм.
Иммуногистохимическое исследование активности гемоксигеназы-1 проводилось на парафиновых срезах с применением стрептовидин-биотинового метода (Millipore). Демаскировку антигена осуществляли в цитратном буфере (рН 6.0) под действием микроволнового излучения (СВЧ-печь). В целях устранения неспецифического связывания иммуноглобулина срезы инкубировали с неиммунной сывороткой козла на 0,01M раствора PBS при комнатной температуре в течение 30 мин. Срезы обрабатывали поликлональными кроличьими антителами к гемоксигеназе-1 (Millipore, Франция) в разведении 1:500. Для ингибирования активности эндогенной пероксидазы срезы в течение 10 мин. при комнатной температуре инкубировали с 3 %-ным раствором перекиси водорода на 0,01М PBS в течение 1 часа. Для иммуномечения гемокси-геназы-1 проводилась обработка срезов вторичными биотинилизированными антителами козла против иммуноглобулинов кролика (Millipore, Франция) при комнатной температуре в течение 30 мин. Для визуализации иммуногистохимического маркирования
гемоксигеназы-1 применяли стрептовидин-перок-сидазный комплекс (Millipore, Франция). В качестве хромогена использовался 3,3-диаминобензидина тет-рохлорид DAB (Диа-М). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера.
Детекцию гепатоцитов, находящихся в состоянии апоптоза, проводили на парафиновых срезах с использованием набора реактивов ApopTag Peroxidase In Situ Oligo Ligation - ISOL (Chemicon). Принцип метода основан на избирательном закреплении маркированной биоти-ном «шпильки» олигонуклеотидов к свободным концам геномной ДНК. Срезы ткани депарафинировались и обезвоживались спиртами. Эндогенную пероксидазу ингибировали 3 %-ной перекисью водорода в течение 5 мин. Проводилась предварительная обработка ткани протеиназой K при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем на срезы наносился рабочий раствор ДНК-лигазы (концентрат ДНК-лигазы + Oligo A) и инкубировали во влажной камере при температуре 20 °C в течение 16 часов. Срезы обрабатывали конъюгатом стрептовидин-пероксидазы в течение 30 мин. при комнатной температуре и визуализировали окрашивание при помощи хромогена DAB под контролем микроскопа. Контрастное окрашивание тканевых структур проводили при помощи метилового зеленого.
Для оценки специфичности иммуногистохимичес-ких реакций на выявление гемоксигеназы-1 и апоп-тотических клеток использовали метод негативного и позитивного контроля. Для дальнейшей оценки иммуногистохимического окрашивания готовились микрофотографии образцов ткани с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Axio Imager A (Carl Zeiss) и цифровой камеры Canon G-6. При фотосъемке исключали поля зрения, содержащие дефекты ткани, дефекты окрашивания, а также периферийные участки срезов.
С каждого препарата при 400-кратном увеличении в 5 случайно выбранных полях зрения для расчета содержания гемоксигеназы-1 в ткани печени измеряли площадь иммунопозитивных структур в процентном отношении к общей исследуемой площади и среднюю оптическую плотность иммуноокрашенных объектов в единицах яркости с использованием системы компьютерного анализа «ВидеоТест-Морфология 5.2» [7].
Количественные данные по апоптозу гепатоцитов представляли в виде апоптического индекса (АИ), который рассчитывали по формуле:
АИ = Nm : N х 100 %,
где Nm - количество апоптических клеток, N - общее количество клеток в исследуемой совокупности [1].
Определение уровня TNF-a в гомогенате печени крыс проводили иммуноферментным методом (Genzyme diagnostics, США).
Статистическую значимость различий средних величин вычисляли по t-критерию Стьюдента после проверки нормальности распределения изучаемых параметров. Определяли коэффициент корреляции между
показателями экспрессии гемоксигеназы-1 (площадь и интенсивность экспрессии фермента), количеством апоптотических клеток и уровнем ТОТ-а.
Результаты исследования. Моделирование неалкогольного стеатогепатита сопровождалось значительными изменениями гистоструктуры печени экспериментальных животных относительно группы контроля. При воздействии высокожирового рациона в течение 90 суток в печени обнаруживались фокусы некробиоза гепатоцитов с лимфомакрофагальной инфильтрацией. В перипортальной и центральной зонах долек синусо-идные капилляры были расширены, центральные вены полнокровны. Вокруг желчных протоков отмечалась незначительная мононуклеарная инфильтрация. Жировая дистрофия гепатоцитов имела вид мелкокапельной и крупнокапельной вакуолизации. Выявлялась умеренная внутридольковая инфильтрация паренхимы печени и гипертрофия гепатоцитов (рис. 1). Следовательно, моделирование НАСГ характеризовалось явлениями мембранодеструкции, некроза паренхимы, нарушением гистологической архитектоники морфо-функциональных единиц печени.
Рис. 1. Гистологическое строение печени крыс при моделировании НАСГ: а - контроль, б - жировая дистрофия с дезорганизацией структуры органа и признаками некробиоза гепатоцитов при НАСГ. Окр. гематоксилином и эозином, х150.
«
б $
К. ■
А
&
0
*—^— * »
Ж
« 3 ' *9 • : <
ч% »»-
* » *
У * $: •«•
9
, ё
ш
® <
я '" ' г ©
> *!,
& & '
в . « ¿ус >
*
- ' Тк
\ г ■? """ • ■ V - -
V« : * ,
•а ' л л ®
■Л* Т./*
о :„» ' V ®в »> » , № » ®о ©
^_»• -У
Таблица
Активность гемоксигеназы-1, уровень апоптоза и ТИ¥-а в печени крыс при НАСГ (М±т)
Показатель Контроль НАСГ
Площадь экспрессии гемоксигеназы-1, % 2,18±0,39 5,25±1,99*
Интенсивность экспрессии гемоксигеназы-1, ед. 0,408±0,005 0,425±0,007
АИ, % 1,2±0,1 3,8±0,2*
Уровень ТОТ-а, пг/мл 194,02±10,72 4863,37±472,95*
Рис. 2. Распределение гемоксигеназы-1 в печени крыс:
а - экспрессия фермента (стрелки) в клетках Купфера и желчных протоков (контроль), б - экспрессия фермента в гепатоцитах при НАСГ. Иммуногистохимия, х150.
Иммуногистохимическое исследование ткани печени крыс контрольной группы выявило умеренную активность гемоксигеназы-1. Экспрессия фермента определялась в клетках Купфера и желчных протоков, а также в незначительном количестве в гепатоцитах (рис. 2, а). Относительная площадь экспрессирующих фермент структур составляла 1,83±0,08 % к общей исследуемой площади печени. Оптическая плотность иммунного окрашивания в контроле соответствовала 0,406±0,004 ед. При НАСГ экспрессия гемоксигеназы-1 увеличивалась. Иммунные метки выявлялись в большом количестве в паринхематозных клетках. Наибольшую интенсивность иммунного окрашивания имели гепатоциты перипортальной зоны (рис. 2, б). Площадь иммунопозитивных структур в печени крыс с НАСГ увеличивалась в 2,4 раза в сравнении с контролем при сохранении уровня экспрессии фермента (табл).
У крыс контрольной группы зарегистрирована незначительная активность апоптоза в ткани органа: единичные апоптотические клетки встречались преимущественно в центральных зонах долек. Количество гепатоцитов, находившихся в состоянии апоптоза, у крыс с НАСГ увеличилось более чем в 3 раза. Развитие гепатита сопровождалось повышением содержания
* Разница с контролем статистически значима.
ТОТ-а в ткани печени в 20 раз по сравнению с контролем, что подтверждало наличие воспаления (табл.).
Корреляционный анализ выявил значимую прямую связь между количеством апоптотических клеток и уровнем ТОТ-а (г=0,39). Обнаруженный факт указывал на ТОТ-а-опосредованный путь реализации программируемой клеточной гибели при развитии НАСГ. Установлена отрицательная корреляционная связь между интенсивностью экспрессии гемоксигена-зы-1 и апоптозом гепатоцитов (г=-0,67), что косвенно свидетельствовало об ингибирующем действии этого фермента на апоптоз при НАСГ. Полученные данные согласуются с исследованиями, проведенными на моделях различных поражений печени, в которых также было показано, что экзогенное введение гемоксигена-зы-1 способствует снижению количества апоптотичес-ких гепатоцитов [14].
Обсуждение полученных данных. Многочисленные исследования последних десятилетий убедительно показали, что гемоксигеназа-1 является одним из наиболее важных регуляторов различных физиологических и патофизиологических процессов [3, 5, 9, 11, 14]. В первую очередь фермент рассматривается как адаптационный белок, способный регулировать механизмы защиты от прооксидантного действия гема в условиях стресса. В то же время в большом количестве экспериментальных и клинических работ доказано, что цитопротекторное действие гемоксигеназы-1 главным образом обусловлено ее антиоксидантными и противовоспалительными свойствами, способностью модулировать клеточный цикл, регулировать апоптотические процессы, а также поддерживать микроциркуляцию. В связи с этим регуляция гемоксигеназной системы рассматривается как агент, с помощью которого возможно лечение различных патологических состояний. В то же время имеются данные о негативном действии гемоксигеназной активности. Так, гиперэкспрессия в печени индуцибельной формы гемок-сигеназы при различных стрессах через действие окиси углерода может являться холестатическим фактором и способствовать осложнению гипербилирубинемии и холестазу [11]. В связи с этим патофизиологическое значение индуцибельной формы гемоксигеназы требует рассмотрения при различных патологиях.
Большой интерес представляют работы, посвященные роли гемоксигеназы-1 в патогенезе НАСГ, где
а
она рассматривается как соединение, способное воздействовать на основные патогенетические механизмы данного заболевания: уменьшить окислительный стресс, снизить апоптотическую активность и подавить воспалительную реакцию [5, 9, 10].
В наших исследованиях было показано, что формирование НАСГ сопровождается увеличением экспрессии гемоксигеназы-1 в основном за счет усиления синтеза фермента гепатоцитами. Ориентация клеток, синтезирующих гемоксигеназу-1, вокруг портальных трактов обусловлена спецификой строения и особенностями кровообращения печени. На гепатоциты пограничной зоны приходится наибольшая функциональная нагрузка. Здесь по междольковым сосудам поступает в печеночные ацинусы кровь с повышенным содержанием гема, что и способствует индукции гемоксигеназы-1. При этом регистрируется увеличение количества апоптотических гепатоцитов в центральной зоне печеночных ацинусов. Корреляционный анализ показал, что активность гемок-сигеназы обратно связана с уровнем апоптоза. Известно, что антиапоптотическое действие этого фермента обусловлено образованием продуктов реакции, главным образом монооксида углерода. Последний проявляет антиапоптотическое действие через подавление p38-митоген-активированной протеинкиназы (МАРК p38) пути. Также антиапоптотический эффект монооксида углерода связан с подавлением экспрессии рецепторов смерти (Fas), угнетением активности каспаз (особенно каспазы-3) и снижением выхода митохондриального цитохрома-С [10]. Билирубин и свободное железо также косвенно влияют на антиапоптотический эффект гемоксигеназы-1 через подавление образования активных форм кислорода [9]. Следовательно, увеличение активности гемоксигеназы-1 и выявленная обратная ее корреляция с уровнем апоптоза гепатоцитов могут свидетельствовать об антиапоптотической активности гемоксигеназной системы в условиях НАСГ.
Моделирование НАСГ сопровождалось увеличением уровня TNF-a в печени, прямо коррелирующего с интенсивностью апоптоза. Полученные данные свидетельствуют о цитокин-опосредованных механизмах индукции апоптоза при НАСГ. Как известно, TNF-a способен запускать одновременно несколько путей программированной клеточной гибели, приводящих к активации каскада каспаз, а также накоплению активных форм кислорода в клетке. Эти процессы обуславливают нарушение целостности мембран митохондрий и как следствие выброс из них апоптогенных факторов [10].
Таким образом, формирование НАСГ сопровождается увеличением экспрессии гемоксигеназы-1, количества апоптотических гепатоцитов и концентрации TNF-a в печени крыс. Индукция апоптоза при НАСГ может происходить вследствие увеличения выработки провоспалительного цитокина TNF-a, о чем свидетельствует корреляция между количеством апоптотичес-ких клеток и уровнем TNF-a. По-видимому, компенсаторным механизмом, противостоящим программируемой клеточной гибели, является интенсификация
экспрессии гепатоцитами гемоксигеназы-1, которая участвует в угнетении апоптотических процессов и сохранении клеточного гомеостаза органа. Литература
1. Автандилов Г.Г. Основы количественной патологической анатомии. М.: Медицина, 2002. 240 с.
2. Буеверов А.О. Неалкогольная жировая болезнь печени и неалкогольный стеатогепатит // Врач. 2006. № 7. С. 33-37.
3. Караман Ю.К., Бивалькевич Н.В., Новгородцева Т.П. и др. Особенности экспрессии гемоксигеназы-1 в гепатоцитах крыс при формировании неалкогольной жировой болезни печени // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2012. Т. 154, № 10. С. 425-429.
4. Караман Ю.К., Новгородцева Т.П., Бивалькевич Н.В. и др. Способ моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс. Патент России № 2394281. 2010. Бюл. № 19.
5. Караман Ю.К., Новгородцева Т.П., Бивалькевич Н.В. и др. Регуляторная роль оксида азота и монооксида углерода при окислительном стрессе в условиях экспериментальной дислипидемии // Рос. физиол. журнал. 2010. № 5. С. 529-538.
6. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. М.: Слово, 2006. 556 с.
7. Смирнова М.Ю., Джемлиханова Л.Х., Костючек И.Н. и др. Количественная иммуногистохимия: оптимизация анализа экспрессии сигнальных молекул в миометрии // Архив патологии. 2010. № 1. С. 51-55.
8. Токмакова Н.П. Гистохимия: учебное пособие. Владивосток: Изд-во ДВГУ 2001. 31 с.
9. Abraham N., Kappas A. Pharmacological and clinical aspects of Heme Oxygenase // Pharm. reviews. 2008. Vol. 60 (1). P. 79-127.
10. Conde de la Rosa L., Vrenken T.E., Hannivoort R.A. et al. Carbon monoxide blocks oxidative stress-induced hepatocyte apoptosis via inhibition of the p54 JNK isoform // Free Radic. Biol. Med. 2008. Vol. 7, No. 44. P. 1323-1333.
11. Farombi E.O., Surh Y.J. Heme oxygenase-1 as a potential therapeutic target for hepatoprotection // J. Biochem Mol. Biol. 2006. Vol. 39, No. 5. P. 479-491.
12. Kaplowits N. Mechanism of liver cell injury // J. Hepatol. 2000. Vol. 32, No. 1. P. 39-47.
13. Li L., Grenard P., Nhieu J. et al. Heme oxygenase-1 is an antifibro-genic protein in human hepatic myofibroblasts // Gastroenterology. 2003. Vol. 125. P. 460-469.
14. Otterbein L., Zuckerbraun B. Heme oxygenase: the elegant orchestration of its products in medicine. N.Y.: Nova Science publishers, 2005. 417 p.
15. Petrache I., Otterbein L., Alam J. et al. Heme oxygenase-1 inhibits TNF-a-induced apoptosis in cultured fibroblasts // Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 2000. Vol. 278. P. 312-319.
Поступила в редакцию 24.05.2012.
CORRELATION OF HEME OxYGENAsE-1 ExPREssION AND ACTIVITY OF APOPTOTIC PROCEssEs IN RAT LIvER IN CAsE OF NON-ALCOHOLIC sTEATOHEPATITIs N.V. Bivalkevich, Yu.K. Karaman
Vladivostok Branch of the Far Eastern Research Centre of Physiology and Respiration Pathology, SO RAMN - Research Institute of Medical Climatology and Rehabilitation Treatment (73g Russkaya St. Vladivostok 690105 Russian Federation)
Summary - The experimental model has been used to detect that the non-alcoholic steato-hepatitis (NASH) is characterised by an increase of heme oxygenase-1 expression, number of apoptotic hepatocytes, and concentration of tumour necrosis factor beta in rat liver. The in-creas-ing apoptosis level positively correlates with TNF-p (that is indicative of cytokine-dependent activation) and negatively correlates with heme oxygenase-1 activity. In case of NASH the heme oxygenase-1 activity is likely to compensate TNF-p-mediated hepatocyte apoptosis. Key words: experimental hepatitis, apoptosis, tumour necrosis factor beta, heme oxygenase.
Pacific Medical Journal, 2013, No. 3, p. 25-28.
