CC BY
15
УДК 577.352.332
Ш. Р. Исмайлова1, К. А. Мотовилов1,2, Л. С. Ягужинский1,2, К. И. Агладзе1,3
1 Московский физико-технический институт (государственный университет), Научно-образовательный центр «Вионанофизика»
2Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University, Киото, Япония
Взаимодействие цепи окислительного фосфорилирования митохондрий с катионным производным азобензола, обладающим фотоконтролируемой структурой
АзоТАБ представляет собой производное азобензола, содержащее катион тетраал-киламмония. Это соединение можно использовать в качестве агента для фотоконтроля возбудимости кардиомиоцитов. В связи с перспективностью использования веществ этого типа для широкого класса задач, связанных с возбудимыми клеточными культурами, требовалось исследовать, как АзоТАБ влияет на работу дыхательной цепи митохондрий, поскольку поддержание нормального гомеостаза активных возбудимых клеточных систем напрямую связано с состоянием их энергетики. В результате проведенной работы выяснилось, что транс-АзоТАБ является ингибитором дыхательной цепи митохондрий, подавляющим оба дегидрогеназных звена — комплексы I и II. Сродство транс-АзоТАБа к NADH-дегидрогеназе значительно превышает его же сродство к сук-цинатдегидрогеназе, что согласуется с теоретическими предпосылками, сделанными на основании предыдущих исследований. Степень ингибирования дыхательной активности митохондрий под действием транс-АзоТАБа зависит от того, какая из дегидрогеназ является основным донором электронов в цепь окислительного фосфорилирования, а не от того, является дыхание разобщенным или фосфорилирующим. Это свидетельствует в пользу того, что транс-АзоТАБ в тех концентрациях, которые использовались в эксперименте (до 500 мкМ), не влияет на работу АТР-синтетазы. Цис-АзоТАБ не является ингибитором дыхательной цепи митохондрий. Он ускоряет фосфорилирующее (но не разобщенное) дыхание митохондрий на обоих субстратах. Интерпретировать последний факт можно двояко. Во-первых, возможно ускорение латерального переноса примембранных протонов, непосредственно участвующих в синтезе АТР пятым комплексом. Во-вторых, присутствие цис-АзоТАБа может ускорять процесс набухания митохондрий, что также ведет к ускорению дыхания в третьем состоянии.
Ключевые слова: АзоТАБ, дыхательная цепь митохондрий, НАДН-
дегидрогеназа, сукцинат дегидрогеназа, митохондрии.
1. Введение
АзоТАБ является относительно недавно синтезированным соединением, обладающим широким спектром активностей в отношении мембран, мембранных ферментов [1], нуклеиновых кислот [2, 3] и других высокомолекулярных структур, представленных в биологических системах. Особый интерес к АзоТАБу связан с тем, что структура и, соответственно, активность этого вещества может контролироваться с помощью света. Химическое название АзоТАБа согласно номенклатуре ИЮПАК — (2 - 4 - [(E) - (4 - этоксифенил ) диази-нил } фенокси-N,N,N- триметиламмоний), то есть он представляет собой поверхностно активное вещество, содержащее в структуре полярный аммониевый катион и гидрофобную этокси-азобензольную группу (рис. 1). Под действием ближнего УФ (365 нм) относительно гидрофобный транс-изомер переходит в относительно гидрофильный цис-изомер. Цис-изомер, менее стабильный, чем транс-изомер, при облучении видимым светом примерно через минуту переходит в транс-форму. В темноте процесс обратной трансформации до
установления равновееноі'о соотношения концентраций цис- и транс-форм занимает около 40 часов.
В ряде работ, проведенных в нашей лаборатории, было показано, что транс-изомер АзоТАБа ингибирует возбуждение в сердечных клетках, в то время как цис-АзоТАБ не ингибирует [4|. Таким образом, АзоТАБ позволяет обратимо и динамично контролировать возбуждение волн кардиомиоцитов.
1.0
200 300 400 500 600 700 800
Длина волны / нм
Рис. 1. Спектры поглощения транс- и цис-АзоТАБа. а также структура двух изомеров АзоТАБа [4]. переходящих друг в друга под действием электромагнитного излучения разной частоты
В настоящее время активно идет работа но созданию производных азобензола со стабилизированным цис-изомером, а также изучение того, как именно может влиять азобензоль-ная 1'рунна на связывание АзоТАБа и его аналогов в ионных каналах (рис. 1). Поскольку в нашей лаборатории АзоТАБ в первую очередь рассматривается и используется как агент, позволяющий проводить фотоконтроль возбудимости сердечной ткани и культуры кардиомиоцитов, нас заинтересовало то, как он может влиять на энергетику этих клеток. Предпосылки к тому, чтобы рассматривать АзоТАБ как возможный ингибитор цени окислительного фосфорилирования митохондрий, в первую очередь ее КАОН-дегидрогеназного звена, имелись. Дело в том, что в период активного изучения свойств N(^01 (КАОН-хинон-оксидоредуктазы 1) и их связи с функционированием электрон-транспортной цени митохондрий были проведены исследования [5 10], в том числе и в нашей лаборатории [11], показавшие, что КАОН-дегидрогеназный участок дыхательной цени неснецифически блокируется гидрофобными веществами, относящимися к разным классам органических соединений. Только бифильные вещества, которые обладают отрицательным зарядом при физиологических pH, не подавляют комплекса I. При этом удалось обнаружить несколько интересных корреляций физико-химических свойств у различных но строению органических веществ и ингибирующей их активности но отношению к КАБЫ-дегидрогеназе. В частности, выяснилось, что эффективность ингибирующего действия соединения не за-
висит от конкретной структуры входящих в него функциональных групп, но связана с интегральным сродством к липидам, поскольку есть линейная корреляция между эффективностью ингибиторов и логарифмом коэффициента их распределения (log р) в системе октанол^вода [14-
Вторым важнейшим фактором, определяющим способность конкретного соединения связываться с комплексом I, является наличие у него поверхностной активности. В той же работе [И] было показано, что концентрации веществ, которые на 50% блокируют дыхание митохондрий в комплексе I, вдвое снижают поверхностное натяжение на границе октан—вода. Таким образом, было доказано, что сродство сайта связывания неспецифических ингибиторов количественно равно сродству этих ингибиторов к межфазной границе октан—вода.
С учетом всего выше сказанного АзоТАБ, особенно в транс-форме, потенциально представляет собой ингибитор NADH-дегидрогеназы. В настоящей работе мы решили проверить, так ли это, в четырех функциональных состояниях дыхательной цепи.
1. Фосфорилирующее дыхание, основной субстрат — NADH.
2. Фосфорилирующее дыхание, основной субстрат — сукцинат.
3. Разобщенное дыхание, основной субстрат — NADH.
4. Разобщенное дыхание, основной субстрат — сукцинат.
2. Материалы и методы
Основным методом исследования, который использовался в работе, был ингибиторный анализ мультиферментной системы дыхательной цепи митохондрий как в условиях отсутствия потенциала на мембранах митохондрий, так и в его присутствии. В настоящее время хорошо известны специфические ингибиторы всех активных центров ферментов, входящих в электрон-транспортную цепь митохондрий. В данной работе мы использовали ро-тенон (ингибитор Q-связывающего центра NADH: убихинон оксидоредуктазы - комплекса I) и циклоспорин А (ингибитор открывания неспецифической митохондриальной поры). Иптегральпым параметром, характеризующим состояние мультиферментной дыхательной системы, на основании которого строилась логика эксперимента, была скорость поглощения кислорода митохондриями, измеряемая с помощью метода полярографии.
2.1. Выделение митохондрий печени
Взрослых белых беспородных крыс (150-180 г) декапитировали, ткань печени извлекали и быстро переносили в раствор буфера, содержащего: 220 мМ маннитола, 1 мМ EDTA,
10 мМ HEPES-KOH (pH 7.4) при 0 °С. После этого ткань печени разрушалась дезинтегратором путем продавливания через отверстия диаметром 1 мм. Полученную кашицу гомоге-
°С
среде, содержащей 220 мМ маннитола, 1 mMEDTA, 10 мМ HEPES-KOH, 0.5 мг/мл БСА (pH 7.4). После этого выделяли фракции митохондрий методом дифференциального центрифугирования. Ядерную фракцию осаждали при 500 g, из надосадочной жидкости осаждали митохондрии при 10 000 g. Центрифугирование проводили в центрифуге BECKMAN J2-21 °С
вали с 1 мл среды промывки (220 мМ маннитола, 10 мМ HEPES-KOH, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ КС1), затем разбавляли этой же средой до объема 20 мл и переосаждали при 10 000 g два раза.
2.2. Измерение скорости дыхания митохондрий
Скорость дыхания митохондрий измеряли полярографическим методом с помощью кислородного электрода Кларка (рабочее напряжение U = 380 мВ) на полярографе Record 4.
Аналш'овый сигнал электродов преобразовывался с помощью АЦП Record 4 в цифровой и передавался на ЭВМ, снабженную требуемым программным обеспечением (программа Record 4, поставляемая совместно с прибором). Объем полярографической ячейки 2 мл.
Время снятия одной полярографической пробы варьировалось от 15 до 30 минут в зависимости от требований эксперимента. Соответственно подбиралась концентрация белка так, чтобы кислорода в ячейке хватало для проведения изучения всех намеченных в пробе измерений.
2.3. Использовавшиеся реактивы
В работе использовались следующие реактивы: КС1, КН2РО4 (MPBiomedicals, США); маннитол, HEPES (Amresco, США), ЭДТА («Helicon», Россия); НО (ЗАО «Каустик», Россия); бычий сывороточный альбумин без жирных кислот пятая фракция, роте-нон, сукцинат, пентахлорфенол, циклоспорин (Sigma-Aldrich, США); АДФ (Calbioehem, Германия).
2.4. Среда инкубации митохондрий
Использовалась среда с низкой ионной силой, содержащая 220 мМ маннитола, 5 мМ КС1, 10 мМ HEPES, 3 мМ MgC12, 2 мМ КН2Р02, 1 мМ ЭДТА (pH 7.4).
2.5. Синтез АзоТАБа
Для синтеза использовались химически чистые реактивы производства SigmaAdrich, Fisher, Merck. АзоТАБ синтезировался путем азо-синтеза пара-алкиланилина или пара-этоксианилина с фенолом с последующим выщелачиванием 1,2-дибромэтаном и триметиламином соответственно (см. рис. 2).
Перечень реагентов: этанол, этил ацетат, тетрагидрофуран, фенол, 4-этоксианилин, 1,2-дибромэтан, триметиламин, нитрит натрия, соляная кислота, гидроксид натрия, магния сульфат.
......... /=\ ШЖ)2-НС1 /=\ +
СНзСН2~О—(\ Ъ—N142 ---------------*■ СНзСН2~0—\\ Ъ—N2
СН3СН2-0—<( /)—N , /=\ Вг(СН2)пВг сн 0н2-О—/)—N, /=\ _
3 2 'м^^0_(Сн2)п Вг
(сн3)3к сн3сн2-о^ /=\ +
------- -* ^ О-(СН2)П-М(СН3)3
Рис. 2. Схема синтеза АзоТАБа
Описание синтеза: к водно-сниртовому раствору (1:1, 50 мл), содержащему алкил анилин (25.0 мМ) и нитрит натрия (25.0 мМ), в ледяной ванне добавляется концентрированная НС1 (5 мл) и лед (25 I’). Затем к раствору осторожно добавляется холодная вода, содержащая фенол (25 мМ) и \ а ОII (50 мМ), и смесь перемешивается в течение 90 минут. pH раствора поддерживается около значения 1.0 помощью соляной кислоты. После этого раствор выдерживается 30 минут для осаждения осадка. Осадок отфильтровывается, промывается чистой деионизованной водой и высушивается иод вакуумом. Высушенный продукт
(10 мМ) растворяется в этаноле (50 мл), содержащем ^ОН (25 мМ). К этому раствору добавляется 20 мл этанола, содержащего 1,2-дибромэтан (30 мМ), и раствор перемешивается в течение 8 часов. Осажденный бромид натрия удаляется фильтрацией, а отфильтрованный раствор отстаивается при комнатной температуре 24 часа. Получившийся осадок собирается, промывается холодным этанолом, холодной водой и затем высушивается под вакуумом. Высушенный продукт растворяется в 100 мл сухого тетрагидрофурана. Через раствор в течение 30 минут пробулькивается триметиламин. Затем раствор выдерживается два дня, образовавшийся осадок собирается, промывается тетрагидрофураном и высушивается под вакуумом. Продукт дважды перекристаллизовывается в этаноле.
3. Результаты и обсуждения
Основным методом, использовавшимся в эксперименте, был ингибиторный анализ по-лиферментной системы дыхательной цепи митохондрий с помощью полярографии. Всю экспериментальную работу можно условно разделить на две части: первая посвящена изучению действия на работу дыхательной цепи в фосфорилирующем и разобщенном состоянии транс-АзоТАБа, вторая — действию в том же наборе условий цис-АзоТАБа. Отдельно стоит исследование, посвященное возможному связыванию аниона, использовавшегося в работе разобщителя пентахлорофенола с катионом транс-АзоТАБа, выполненное с использованием метода спектрофотометрии.
3.1. Действие транс-АзоТАБа на дыхательную цепь митохондрий
Как уже указывалось во введении, транс-изомер АзоТАБа проявляет более гидрофобные свойства, чем г^с-изомер. Это должно приводить к тому, что транс-АзоТАБ при прочих равных условиях будет проявлять большее сродство к липидной мембране, чем цис-АзоТАБ. На рис. 3-6 приведены характерные полярограммы, получаемые при исследовании действия транс-АзоТАБа на дыхание митохондрий, активированное под действием сукцината (рис. 3, 4) в условиях фосфорилирования (рис. 3) и разобщения (рис. 4), а также дыхание, активированное под действием малата-глутамата (рис. 5, 6), в условиях фосфорилирования (рис. 5) и разобщения (рис. 6).
цеп
20 мкл митохондрий
1
100 нМ 02
I-----------1
100 с
0.83
Рис. 3. Действие транс-АзоТАБа на фосфорилирующее сукцинатное дыхание
Из представленных полярограмм хорошо видно, что ингибирующее действие транс-АзоТАБа в первую очередь связано не с тем, есть ли потенциал на мембране и идет ли фосфорилирование, а тем, какая из дегидрогеназ является основным поставщиком электронов в цепь. Этот результат полностью согласуется с данными [11], полученными ранее в
рот
Рис. 4. Действие транс-АзоТАБа на разобщенное сукцинатное дыхание
Рис. 5. Действие транс-АзоТАБа на фосфорилирующее дыхание в условиях окисления малата и глутамата
Рис. 6. Действие транс-АзоТАБа на разобщенное дыхание в условиях окисления малата и глута-
нашей лаборатории, которые показали, что комплекс I способен связываться практически с любыми нейтральными и положительно заряженными соединениями, обладающими значительным гидрофобным фрагментом. Сродство к подобного рода соединениям у комплекса
II значительно ниже. Полученные нами в настоящей работе данные по транс-АзоТАБу
органично вписываются в эту картину.
Кроме того, приведенные полярограммы косвенно указывают на то, что транс-АзоТАБ не является ингибитором АТР-синтетазы, фосфатного антипортера и ATP/ADP-переносчика во внутренней мембране, по крайней мере в концентрациях до 500 мкМ. Во всяком случае, эти стадии работы цепи окислительного фосфорилирования в рассматриваемых условиях не становились лимитирующими.
3.2. Действие цис-АзоТАБа на дыхательную цепь митохондрий
Как указывалось во введении, цис-АзоТАБ не подавляет возбудимость кардиомиоци-тов. Согласно расчетам, выполненным с использованием программного пакета Chemsoft, а также пакета Dragon Moriguchi, десятичный логарифм коэффициента разделения транс-
-
АзоТАБа гидрофильность многократно возрастает из-за возникновения большого напряжения в сопряженной ^-системе и поляризации молекулы.
Рис. 7. Действие цис-АзоТАБа на фосфорилирующие дыхание митохондрий, окисляющих сукци-нат. Видно небольшое ускорение дыхания от добавки цис-АзоТАБа 350 мкМ
По этим причинам вполне естественно предположить, что цис-АзоТАБ будет проявлять существенно другие свойства по отношению к дыхательной цепи, чем транс-АзоТАБ. Для того чтобы удостовериться в этом, были поставлены соответствующие эксперименты. На рис. 7-10 представлены полярограммы, полученные в результате экспериментов, аналогичных тем, что до этого проводились с г^с-изомером. Для того чтобы предотвратить быструю трансформацию г^с-изомера в транс-изомер под воздействием дневного света, эксперименты проводились в темной комнате с использованием источника красного света (фонарь для фотолаборатории), а полярографическая ячейка была дополнительно укрыта светонепроницаемым колоколом из алюминиевой фольги.
Как видно из представленных данных, действие АзоТАБа в данном случае в корне отлично от представленных ранее. Никакого ингибирования не наблюдается, а в случае фос-форилирующего дыхания есть даже небольшой эффект ускорения. В рамках проведенных экспериментов строгого объяснения последнему эффекту дать нельзя. Однако, основываясь на общих соображениях и похожих эффектах из данных литературы, можно выдвинуть две основные гипотезы. Во-первых, этот эффект может быть связан с набуханием митохондрий под действием цис-АзоТАБа. Как известно, этот эффект особенно сильно сказывается на скорости дыхания, когда митохондрии находятся в истинном третьем состоянии [12-14]. Еще одна интерпретация рассматриваемого эффекта может быть связана с активацией под действием цис-АзоТАБа так называемого латерального переноса протонов вдоль мембра-
30 мкл митохондрі
Рис. 8. Действие цис-АзоТАБа на разобщенное дыхание митохондрий, окисляющих сукцинат. Видно, что цис-АзоТАБ практически никак не влияет на процесс восстановления кислорода в ячейке с митохондриями
Рис. 9. Действие цис-АзоТАБа на фосфорилирующее дыхание митохондрий, окисляющих малат и глутамат. Видно, что цис-АзоТАБ, как и в аналогичном случае на сукцинате (рис. 8), примерно на 20-30% ускоряет дыхание
ны [15], теория которого сейчас активно разрабатывается в лаборатории Л.С. Ягужинского в НИИ ФХБ МГУ им. Ломоносова. В результате ускорения переноса неравновесно связанных с мембраной ионов водорода от помп к АТР-синетазе ускоряется и сама работа помп, что в свою очередь ведет к увеличению скорости поглощения кислорода.
4. Выводы
В результате проведенной работы было показано, что транс-АзоТАБ является ингибитором дыхательной цепи митохондрий, подавляющим оба дегидрогеназных звена — NADH-дегидрогеназу и сукцинатдегидрогеназу. Кроме того, было показано, что сродство транс-АзоТАБа к NADH-дегидрогеназе значительно превышает его же сродство к сукцинатдегидрогеназе, что согласуется с теоретическими предпосылками, сделанными на основе литературных данных. Степень ингибирования дыхательной активности митохондрий под действием транс-АзоТАБа в первую очередь зависит от того, какая из дегидрогеназ является основным донором электронов в цепь окислительного фос-
Рис. 10. Действие цис-АзоТАБа на разобщенное дыхание митохондрий, окисляющих малат и глу-тамат. Видно, что цис-АзоТАБ практически никак не влияет на процесс восстановления кислорода в ячейке с митохондриями
форилирования, а не от того, является дыхание разобщенным или фосфорилирующим. Это говорит о том, что транс-АзоТАБ в тех концентрациях, которые использовались в эксперименте, не влияет на работу АТР-синтетазы. Цис-АзоТАБ не является ингибитором дыхательной цепи митохондрий в диапазоне концентраций 0-500 мкМ. На основании полученных данных можно заключить, что связывание транс-АзоТАБа с различными мембранными системами митохондрий носит неспецифический характер, что согласуется с данными, полученными для случая клеточной мембраны кардиомиоцитов.
Данное исследование было выполнено в рамках работ по Государственному контракту № 11.519.11.2021 (мероприятие 1.9 Федеральной целевой программы «Исследования и разработки», Федеральной целевой программой «Кадры», мероприятие 1.4), а также поддержано грантом № 11.G34.31.0015 от 30 ноября 2010 г. Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, а также Министерством образования и науки Российской Федерации.
Литература
1. Мадоте N., Kanaporis GMoisan N., Tanaka КAgladze К. Photo-control of excitation waves in cardiomyocyte tissue culture // Tissue Eng. — Part A 17. — P. 2703-2711.
2. Estevez-Torres A., Crozatier C., Diguet AНага Т., Saito HYoshikawa КBaigl D. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder // Proc. Natl. Acad. Sci. — 2009. — V. 106. — P. 12219— 12223.
3. Rudiuk SSaito HНага Т., Inoue Т., Yoshikawa K., Baigl D. Light-regulated mRNA condensation by a photosensitive surfactant works as a series photoswitch of translation activity in the presence of small RNAs // Biomacromolecules. — V. 12. — P. 3945-3951.
4. Erofeev I. SMagome N., Agladze К. I. Digital photocontrol of the network of live excitable cells 11 JETP Letters. - 2011. - V. 94. - P. 513-516.
5. Hansch C., Anderson S. M. The structure-activity relationship in barbiturates and its
similarity to that in other narcotics // J. Med. Chem. — 1967. — V. 10. — P. 745-753.
6. Horgan D.J., Singer Т. P., Casida ,J.E. Studies on the respiratory chain-linked reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase. Binding sites of rotenone, piericidin A, and amvtal in the respiratory chain // J. Biol. Chem. - 1968. - V. 243. - P. 834-843.
7. Redfearn E.R., King T.E. Mitochondrial Nadh2 Dehydrogenase and Nadh2 Oxidase from Heart Muscle: Possible Existence of a Ferredoxin-Like Component in the Respiratory Chain // Nature. - 1964. - V. 202. - P. 1313-1316.
8. Stockdale М., Selwyn M. J. Influence of ring substituents on the action of phenols on some dehydrogenases, phospholinases and the soluble ATPase from mitochondria // Eur. J. Biochem. - 1971. - V. 21. - P. 416-423.
9. Stoppani A. O., De Brignone С. М., Brignone J.A. Structural requirements for the action of steroids as inhibitors of electron transfer // Arch. Biochem. Biophvs. — 1968. — V. 127.
- P. 463-475.
10. Wedding R. Т., Hansch C., Fukuto T.R. Inhibition of malate dehydrogenase by phenols and the influence of ring substituents on their inhibitory effectiveness // Arch. Biochem. Biophvs. - 1967. - V. 121. - P. 9-21.
11. Yaguzhinsky L. S., Smirnova E. G., Ratnikova L. A., Kolesova G. М., Krasinskaya I. P. Hydrophobic Sites of the Mitochondrial Electron Transfer System // J. Bioenergetics and Biomemebranes. — 1973. — V. 5. — P. 163-174.
12. Halestrap A. P. The regulation of the matrix volume of mammalian mitochondria in vivo and in vitro and its role in the control of mitochondrial metabolism // Biochim. Biophvs. Acta. —1989. - V. 973. - P. 355-382.
13. Yoshikawa S. [et. al.\. Proton pumping mechanism of bovine heart cytochrome с oxidase // Biochim. Biophvs. Acta. - 2006. - V. 1757. - P. 1110-1116.
14. Мотовилов K.A., Юркое В. И., Волков Е.М., Ягужлтский Л. С. Изучение свойств и поиск методов исследования неравновесных состояний ионов водорода на межфазных границах мембран митохондрий, возникающих в условиях работы протонных помп // Биологические мембраны. — 2009. — Т. 26. — С. 408-418.
15. Eroshenko L.V., Marakhovskaya A. S., Vangeli I. М., Semenyuk P. S., Orlov V.N., Yaguzhinsky L. S. Bronsted Acids on the Mitochondrial Membranes as a Substrate for ATP Svnthas // Dokladv Biochemistry and Biophysics. — 2012. — V. 444. — P. 158-161.
Поступим в редакцию 20.08.2012.
