CC BY
363
УДК 612. 017.1
ОСОБЕННОСТИ ДЫХАНИЯ МИТОХОНДРИЙ ПРИ гипоксии И АЦИДОЗЕ
К.А. Рямова, А. С. Розенфельд
Российский государственный профессионально-педагогический университет г. Екатеринбург
Выявлены особенности ответной реакции дыхательной цепи митохондрий различных органов крыс, на физическую нагрузку, гипоксическую гипоксию и метаболический ацидоз. Показано, что экзогенный сукцинат способен повышать работоспособность, уменьшая симптомы рабочей гипоксии и после-нагрузочного ацидоза.
Ключевые слова: гипоксическое состояние, активация дыхания митохондрий, гормональное воздействие.
Оценка и разработка эффективных средств, способствующих поддержанию и сохранению фосфорилирующего дыхания митохондрий в условиях рабочей гипоксии и метаболического ацидоза, требуют понимания тех реакций, которые формируются в дыхательной цепи на моделируемые воздействия. Следует отметить, что в создавшихся условиях, митохондрии функционируют как открытая система, с интенсивным массообменом ограниченным притоком кислорода, в окружении цитозоля с более кислым pH и повышенной концентрацией лактат, фосфата и ионов кальция [23, 18].
В настоящее время установлено, что гипокси-ческие состояния сопровождаются обратимыми нарушениями структуры и функции митохондрий. Причем, после острой гипоксии, независимо от ее генеза, как правило, наблюдается активация фосфорилирующего дыхания изолированных митохондрий [6, 8, 12, 21]. Постгипоксическую активацию митохондрий печени, сердца и коркового слоя почек мы отмечали после острой гипоксической гипоксии (нахождение животных в течение 15-60 минут в барокамере на «высоте» 8000 метром), после массивной кровопотери, возмещенной аутокровью или эмульсией перфторорганических соединений, после острой этаноловой интоксикации. Для примера приведем данные по изменению дыхания митохондрий печени крыс перенесших 30 минутную гипоксическую гипоксию. Как показано на рис. 1, скорость дыхания митохондрий в третьем состоянии возрастала более чем на 45 % (р < 0,05) и в меньшей степени в четвертом состоянии, соответственно увеличивалась величина дыхательного контроля. При этом отношение АДФ/О оставалось неизмененным. В более поздние сроки - через 2 часа пребывания животных «на высоте» 8000 метров, также как и при адаптации животных к хронической гипоксической гипоксии - активации дыхания митохондрий не наблюдалось [12].
На основании анализа, ряда выполненных экспериментов in vivo и in vitro, мы выявили следую-
щие факторы, ответственные за активацию дыхания митохондрий после острой гипоксии.
1. Гормональное воздействие на уровне ткани, возможно, связанное с гипоксическим стрессом. Подобная гипоксии активация дыхания наблюдалась после подкожного введения малых доз адреналина (0,1 мг на кг веса) [20] и в случае спонтанно увеличенной продукции глюкокортикоидов в коре надпочечников [5, 6, 11].
2. Уменьшение щавелевоуксусного торможения сукцинат-дегидрогеназы, очевидно, обусловленное повышением степени восстановленное™ пиридиннуклеотидов после гипоксии. Обычно, в условиях нормоксии внесение в инкубационную среду 3 мМ глутамата или изоцитрата стимулирует окисление сукцината даже в митохондриях ин-тактных животных и тем более в случае деэнерги-зации, вызванной какими-либо нагрузками in vivo или in vitro [4, 9]. Оказалось, что после острой гипоксии ни глутамат, ни изоцитрат не вызывали дополнительной активации дыхания выделенных митохондрий [8, 19].
3. Мобилизация ионов кальция и свободных жирных кислот. Добавление в среду выделения и инкубации комплексообразователей 1 мМ ЭГТА или ЭДТА, или обезжиренного бычьего альбумина (1 мг на мл среды) существенно уменьшало постгипоксическую активацию дыхания, также как и у животных, перенесших холодовой стресс [3, 16, 17]. Как ясно из работ последних лет постгипоксическое увеличение содержания в цитозоле клетки и матриксе митохондрий ионов кальция может существенно увеличивать проток через цикл Кребса даже на фоне повышенного уровня восстановленное™ NA,5H, за счет активирующего воздействия ионов кальция на а-кетоглутарат-дегидрогеназу [18,23].
4. Активация фосфолипазы А2. Ингибитор фосфолипазы А2 бромфенацилбромид, добавленный в инкубационную среду в концентрации 1 мМ, также уменьшал постгипоксическую активацию дыхания митохондрий [2].
Интегративная физиология
5. Набухание митохондрий после острой гипоксии отмечалось во множестве морфологических исследований [13]. В лаборатории В.П. Ску-лачева было установлено, что набухание митохондрий сопровождается ускорением переноса восстановительных эквивалентов на уровне цитохро-мов Ь-с [10]. Повышение тоничности среды в таких условиях приводит к сжатию митохондрий и подавлению дыхания [2]. Причем ответ на повышение тоничности среды зависит от исходной степени набухания митохондрий. Оказалось, что для полного подавления ответа митохондрий печени на АДФ у интактных животных достаточно повысить тоничность среды добавкой сахарозы до 500 мОсм, тогда как после острой гипоксии для подавления У3 необходимо повысить тоничность до 700 мОсм.
Активация фосфолипазы А2 и набухание митохондрий после гипоксии могут быть следствием воздействия повышенных концентраций свободных жирных кислот и ионов кальция [7], увеличением внутримитохондриальной концентрации кальций фосфата и недоокисленных субстратов.
Относительно влияния сдвига pH и повышения концетрации лактата как факторов, вносящих свой вклад в постгипоксическую активацию фос-форилирующего дыхания, далеко не все ясно. С одной стороны, известно, [24] что значительное, в несколько раз по сравнению с физиологическим уровнем, увеличение концентрации лактата, независимо от величины pH, может вызывать набухание митохондрий, сопровождающееся активацией дыхания и разобщением окислительного фосфори-лирования. С другой стороны, при вышеперечисленных состояниях, и в частности при гипоксиче-ской гипоксии содержание лактата возрастает всего в 1,5-2 раза. И величина сдвига pH не превышает 0,1-0,15 ед.
В экспериментах in vitro мы обнаружили, что для активирования дыхания необходимо снизить pH инкубационной среды, по крайней мере с 7,4 до 6,9. Особенно заметна такая активация на уровне гомогената (табл. 1). Однако по данным К. Sahlin [22] сдвиг внутриклеточного pH на 0,5-0,6 ед. при мышечной работе сопровождается снижением pH
riAt 02
min mg pr. "90
80
70
60
50
40
30
20
10
ADP
ADP
i
® 1min Сукцикат
t
MX
t
УСЛОВИЯ
НОРМОКСИЯ
---ОСТРАЯ ГИПОКСИЯ
----ОСТРАЯ гипоксия
+МОДИФИКАТОР СРЕДЫ
Сукцинат + Глутамат
Рис. 1. Скорости дыхания митохондрий печени крыс при окислении сукцината после 60 мин гипоксической гипоксии.
Добавки: 200 мкм АДФ, 5 мМ сукцината; «модификаторы среды»: ЭГТА 1мМ или обезжиренный бычий альбумин 1 мг на мл. Каждая кривая построена по средним данным из 7-10 полярограмм регистрации дыхания митохондрий. Ошибка средней г 7% от абсолютной величины средних значений
Таблица 1
Влияние снижения pH инкубационной среды на скорости дыхания при окислении сукцината (5 мМ) гомогенатом сердца крысы (130 °С, п - 4) в 4 состоянии и при активации эндогенных АТФ-аз (3 состояние)
pH инкубационной Скорость дыхания Скорость дыхания в 3 состоянии,
среды в 4 состоянии, нг-атом О в мин нг-атом О в мин на мг белка
на мг белка (в присутствии 2,5 мМ 1^+2, 2,5 шМ АТР)
7,4 16,2 ± 1,2 67,0 ± 2,7
6,9 25,4 + 2,1 81,1 ±3,2
Р< 0,001 Р < 0,05
условиях, сукцинат выигрывает конкуренцию за дыхательную цепь у КАД-зависимых субстратов (об этом мы судили по изменению дыхательного коэффициента).
При снижении рС>2 в инкубационной среде изменение сродства митохондрий к сукцинату становится еще более выраженным. Возможно, это происходит ввиду нарушения окисления NAfl-зависимых субстратов, в то время как флавин-зависимые субстраты, и в частности сукцинат, могут еще окисляться [12].
На уровне целостного организма противоаци-дотическое действие сукцината проверяли в условиях рабочей гипоксии, создаваемой как и в предыдущем эксперименте, физической нагрузкой (плавание крыс в течение 15 минут при температуре воды 30 °С, с грузом 6% от массы тела). Поскольку в экспериментах in vitro сукцинат аммония был более эффективным, чем раннее исследуемые субстратные смеси, мы исследовали его действие, вводя животным в желудок в дозе 15 мг на кг массы тела за 20 минут до плавания.
В случае введения животным перед плаванием сукцината аммония pH крови снижалось в меньшей степени - до 7,28 ± 0,14 (рис. 2), отношение лактат/пируват не превышало 28,0 ± 1,4. Причем противоацидотическое действие сукцината аммония на уровне крови сопровождалось нор-мальзацией параметров фосфорилирующего дыхания митохондрий, выделенных из скелетных
Таблица 2
Дыхание митохондрий скелетных мышц крыс после плавания с предварительным приемом сукцината аммония
Группы животных. Во всех случаях п = 8 Субстраты окисления: Сукцината 5 мМ + Глутамата 8мМ
v4 v3 ДК АДФ/О Уф
Покой 73,0 ±7,1 324,0 ± 30,0 4,5 ± 0,4 1,0 ±0,1 331,0 ±31,3
Нагрузка 123,0 ± 17,4 р < 0,05 440,0 ± 34,6 р < 0,05 3,7 ± 0,4 1,1 ±0,1 457,0 ± 45,5 р < 0,05
Нагрузка с предварительным приемом сукцината 75,0 ± 7,2 318,0 ±48,0 4,1 ±0,4 1,2 ±0,1 413,0 ±69,5
Пи Субстраты окисления: эуват 10 мМ + Малат 5 мМ
Покой 34,0 ± 4,7 206,0 ± 20,8 5,6 ± 0,27 1,3 ±0,1 220,0 ± 22,8
Нагрузка 62,0 ± 9,0 р < 0,05 290,0 ± 18,0 р < 0,05 5,1 ± 0,6 1,2 ±0,2 278,0 ±25,1
Нагрузка с предварительным приемом сукцината 42,0 ± 5,5 156,0 ± 16,7 3,9 ± 0,3 р < 0,02 1,1 ±0,1 151,0 ± 17,3
Примечание: У4иУ3 - скорости дыхания митохондрий в 4 и 3 состояниях по Чансу и Вилямсу, выраженные в нг-ат О в мин на мг белка митохондрий. Уф - скорость фосфорилирования добавленного АДФ в нмолях в мин на мг белка. Р < при сравнении с показателями покоя. Среда выделения для митохондрий скелетных мышц: 0,25 М маннит, 10 мМ трис-НС1 буфер (pH 7,4), 1 мМ ЭГТА, 1 мМ АТФ. Инкубационная среда: 0,25 М маннит, 10 мМ трис-НС1 буфер (pH 7,4), 1 мМ ЭГТА, 3 мМ КН2Р04, 1 мМ М§804; добавки субстратов по 5 мМ, АДФ - 150 мкМ.
в смешанной крови всего на 0,2 ед. Учитывая эти результаты, мы моделировали подобный сдвиг pH в условиях целостного организма при помощи физической нагрузки.
Оказалось, что такой сдвиг pH крови с 7,41 ± 0,01 до 7,12 ± 0,02 происходит у крыс во время плавания в течение 15 минут с грузом 6 % от массы тела. Одновременно при этом возрастает концентрация лактата в крови и увеличивается отношение лактат/пируват с 13,1 ± 0,7 до 54,4 ± 2,2. В митохондриях скелетных мышц, выделенных из бедренных мышц крыс, после такой нагрузки наблюдалась гипоксииподобная активация фосфорилирующего дыхания (табл. 2). Естественно, в условиях целостного организма активирующее действие рабочей гипоксии на дыхание митохондрий скелетных мышц является результатом влияния всех указанных выше факторов, а не только сдвига pH и накопления лактата. Тем более было интересно проверить, в какой мере идеология использования сукцината, основанная на митохондриальных подходах, может работать на уровне целостного организма.
В более ранних наших работах было показано, что из всех митохондриальных субстратов при фиксированной АТФ-азной нагрузке in vitro наиболее эффективно предотвращали развитие ацидоза сукцинат калия, смесь сукцината калия с глута-матом калия или сукцинат аммония. Это объясняется тем, что даже в обычных нормоксических
Интегративная физиология
pH крови 7,4
СБО мМ
7,3
7,2
7,1
7,0
m
-6
-9
-12
-15
-18
-*1 И 50
: :Н 40
Щ 30
20
10
А 0
Лактат
Пируват
контроль
плавание
плавание
+сукцинат аммония
Рис. 2. Влияние предварительного введения сукцината аммония (15 мг на кг массы тела) на pH крови, величину сдвига буферных оснований (СБО) и отношение лактата/пируват в крови крыс после 15-минутного плавания
мышц: практически нацело ликвидировалась по-сленагрузочная активация дыхания (табл. 2).
Данные по влиянию сукцината аммония на работоспособность детально изложены А.С. Розен-фельдом [14], а так же в сборнике «Терапевтическое действие янтарной кислоты». В последние годы эти результаты были подтверждены А.В. Сучковым и соавторами [15], которые показали, что ведение сукцината аммония в дозе 0,25-1,0 г на кг веса существенно повышало физическую работоспособность мышей. При этом активность препаратов в ряду возрастала также, как и в наших исследованиях: фармокопейная янтарная кислота < сукцинат натрия < сукцинат аммония. Полученные нами данные и результаты исследования А.В. Сучкова [15], М.Ю. Алексеева [1], позволяют сделать вывод о том, что в условиях целостного организма экзогенный сукцинат способен уменьшать симптомы рабочей гипоксии, что проявляется на уровне изолированных тканевых препаратов. При этом повышается и работоспособность за счет коррекции метаболического ацидоза путем поддержания функций митохондрий.
Литература
1. Алексеев, М.Ю. Влияние тренинга, характера физических нагрузок и биологически активных веществ на динамику процессов восстановления после мышечной работы у лошадей: дис. ... канд. биол. наук/М.Ю. Алексеев. — Бобровск, 1977. -140 с.
2. Брустовецкий, Н.Н. Влияние тоничности среды на скорость дыхания и окислительное фос-форилирование в митохондриях печени активных и гибернирующих сусликов / Н.Н. Брустовецкий, З.Г. Амерханов, Е.В. Гришина, Е.И. Маевский // Биохимия. - 1990. - Т. 55. - Вып. 2. - С. 201-209.
3. Брустовецкий, Н.Н. Изменения эффективности окислительного фосфорилирования, скорости дыхания и транспорта ионов Са++ в митохондриях печени крыс и сусликов при различных уровнях термогенеза / Н.Н. Брустовецкий, Е.И. Ма-
евский, JI.C. Данилова, С.Г. Колаева, Г.Р. Иваницкий //Докл. АН СССР. - 1984. - Т. 276. - № 5. -С. 1260-1263.
4. Виноградов, АД. Колебательный характер установления стационарной концентрации пири-диннуклеотидов в митохондриях при переходе от активного дыхания к состоянию покоя // Колебательные процессы в биологических и химических системах / АД. Виноградов, М.Н. Кондрашова. -М.: Наука, 1967. - С. 122-127.
5. Вольский, Г.Г. О характере и особенностях регуляции сукцинатдегидрогеназы глюкокорти-коидами / Г.Г. Вольский, Л.М. Осадчая // Митохондрии: Транспорт электронов и преобразование энергии. - М.: Наука, 1976. - С. 164-168.
6. Генкин, А.М. Влияние острой гипоксии и введения глутамата натрия на реакции дыхательной цепи митохондрий некоторых органов / А.М. Генкин, НА. Глотов, Е.И. Маевский // Митохондрии: Биохимия и ультраструктура. - М., 1973. -С. 82-84.
7. Евтодиенко, Ю.В. Механизмы и регуляция транспорта ионов в митохондриях: дис. ...д-ра биол. наук /Ю.В. Евтодиенко. — Пущино, 1979. - 298 с.
8. Кондрашова М.Н. Адаптация к гипоксии посредством переключения метаболизма на превращении янтарной кислоты / М.Н. Кондрашова, Е.И. Маевский, Г.В. Бабаян // Митохондрии: Биохимия и ультраструктура. - М., 1973. - С. 112-129.
9. Кондрашова, М.Н. Янтарная кислота в скелетных мышцах при интенсивной деятельности и в период отдыха / М.Н. Кондрашова, Н.Р. Ча-говец //Докл. АН СССР. - 1971. - Т. 198. - Ж 1. -С. 243-246.
10. Красинская, И. П. Два качественно различных структурно-функциональных состояния митохондрий / И.П. Красинская, И. С. Литвинов, С.Д. Захаров, Л.Е. Бакеева, Л. С. Ягужинский // Биохимия. -1989. -Т. 5.- Вып. 9. - С. 1550-1556.
11. Кулинский, В. И. Влияние катехоломинов на дыхание и ИАД-зависимую изоцитратдегидрогеназу
Рямова К.А., Розенфельд А.С.
митохондрий печени / В.Н Кулинский, В. М. Воробьева, Л.В. Труфанова // Митохондрии: Аккумуляция энергии и регуляция ферментативных процессов.-М., 1977.-С. 12-18.
12. Маевский, Е.И. Влияние гипоксии и глута-мата на реакции дыхательной цепи митохондрий некоторых органов: дис. ... канд. мед. наук / Е.И. Маевский. - Свердловск, 1971. -244 с.
13. Митин, КС. Структура митохондрий в норме и патологии / КС. Митин // Митохондрии: Биохимия и морфология. - М., 1967. — С. 98—106.
14. Розенфельд, А.С. Регуляция сукцинатом вклада митохондрий в поддержание pH при АТФ-азныхнагрузках: дис. ... канд. биол. наук/А.С. Розенфельд. - Пущине, 1983. -145 с.
15. Сучков, А.В. Влияние янтарной кислоты и ее солей на физическую работоспособность мышей BALB/C /А.В. Сучков, В.В. Панюшкин, С.Н. Порту галов // Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. - Пущино, 1998. - С. 195-200.
16. Brustovetsky, N.N. Role of the Ca cycle in uncoupling of oxidative phosphorylation in livermito-chondriaof cold-acclimated rats / N.N. Brustovetsky, E.I. Maevsky, S.G. Kolaeva, L.S. Danilova et. al. // Comp, biochem. physiol. - 1985. — 82B. - № 3. -P. 545-547.
17. Brustovetsky, N.N. Regulation of the degree of coupling of oxidation with phosphorylation in rat liver mitochondria: relation to thermogenesis / N.N. Brustovetsky, E.I. Mayevsky //IV Europ. Bio-energ. conf. short reports. — V. 4. —1986. — P. 381.
18. Drewnowska, K. Stimulatory effect of calcium on metabolism and its sensitivity to pH in kidney mitochondria / K. Drewnowska, A.C. Schoolwerth // Am J Physiol 1994 Jul. - 267 (1 Pt 2). - P. 153-159.
19. Maevsky, E.I. The origin of the hypoxic activation of the mitochondrial respiration / E.I. Maevsky, N.N. Brustovetsky // 9-th Colloquium on bioenergetics and mitochondria. Abstracts. Elbingerode, GDR, 1981.-P. 1-12.
20. Kondrashova, M.N. Participation of endogenous succinate in the action of physiological doses of adrenaline / MN. Kondrashova, I.B. Gusar, E.I. Maevsky, E.A. Wulfius, A.L. Andreev // Abstracts. 6th Joint Symposium of the Biochemical Societies of the GDR and USSR «Regulation in metabolism and bioenergetics». -Tallinn, 1981. -P. 167.
21. Mela, L. Mitochondrial function in cerebral ischemia and hypoxia comparison of inhibitory and adaptive responses / L. Mela. - Neurol. Res. — 1979. -P. 51-63.
22. Sahlin, K. Intracellular pH and Energy Metabolism in skeletal Muscle in Man / K. Sahlin // Stockholm, 1978. - Acta Physiolog. Scandinav., 1978. -Suppl. - P. 455.
23. Schoolwerth, A.C. Regulation of rat kidney mitochondrial metabolism in acute acidosis / A.C. Schoolwerth, T. Strzelecki, FA. Gesek // Am J Kidney Dis 1989 Oct. -14 (4). - P. 303-306.
24. Senger, H. Changes of the oxidative phosphorylation in mitochondria of rat skeletal muscle following strenuous exercise / H. Senger // Acta biol. med. Germ., 1975. - Band 34. - P. 181-188.
