CC BY
193. Beres S.B., Musser J.M. Contribution of exogenous genetic elements to the group A Streptococcus metagenome. PLoS One. 2007, 2 (8): e800.
4. Carapetis J.R., Steer A.C., Mulholland E.K. et al. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infectious Diseases. 2005, 5 (11): 685-694.
5. Elliot J.A., Farmer K.D., Facklam R.R. Sudden increase in isolation of group B streptococci, serotype V, is not due to emergence of a new pulsed-field gel electrophoresis type. J. Clin. Microbiol. 1998, 36: 2115-2116.
6. Feng L.J., Lin H.R., Ma Y.L. et al. Macrolide-resistant Streptococcus pyogenes from Chinese pediatric patients in association with Tn916 transposons family over a 16-year period. Diagnostic Microbiology Infectious Disease. 2010, 67 (4): 369-375.
7. Guy R., Williams C., Irvine N. et al. Increase in scarlet fever notifications in the United Kingdom, 2013/14. Eurosurveillance. 2014, 19 (12): 20749.
8. Ip M., Lyon D.J., Leung T. et al. Macrolide resistance and distribution of erm and mef genes among beta-haemolytic streptococci in Hong Kong. European J. Clinical Microbiology Infectious Diseases. 2002, 21 (3): 238-240.
9. Kataja J., Huovinen P., Seppala H. Macrolide resistance study G. Erythromycin resistance genes in group A streptococci of different geographical origins. J. Antimicrobial Chemotherapy. 2000, 46 (5): 789-792.
10. Luk E.Y., Lo J.Y, Li A.Z. et al. Scarlet fever epidemic, Hong Kong, 2011. Emerging Infectious Diseases. 2012, 18 (10): 1658-1661.
11. Olivieri R., Morandi M., Zanchi A. et al. Evolution of macrolide resistance in Streptococcus pyogenes over 14 years in an area of central Italy. J. Medical Microbiology. 2015, 64: 11861195.
12. ProMED-Mail (2009, June 20). Streptococcus, group A, scarlet fever — Vietnam. Retrieved December 06, 2015.
13. Tse H., Bao J.Y.J., Davies M.R. et al. Molecular сharacterization of the 2011 Hong Kong Scarlet Fever Outbreak. J. Infectious Diseases. 2012, 206 (3): 341-351.
14. Varaldo P.E., Montanari M.P., Giovanetti E. Genetic elements responsible for erythromycin resistance in streptococci, Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2009, 53: 343-353.
15. Yan J.J., Wu H.M., Huang A.H. et al. Prevalence of polyclonal mefA-containing isolates among erythromycin-resistant group A streptococci in southern Taiwan. J. Clinical Microbiology. 2000, 38 (7): 2475-2479.
Поступила 05.11.17.
Контактная информация: Киреева Александра Геннадьевна,
197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12, р.т. (812)234-05-42
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
А.Е.Платонов1, J.Koetsveld2, Н.М.Колясникова1'3, О.А.Стуколова1, А.С.Долгова1, М.Г.Топоркова4, Д.С.Сарксян5
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА С BORRELIA MIYAMOTOI, ВОЗБУДИТЕЛЕМ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА
Центральный НИИ эпидемиологии, Москва; 2Academic Medical Centre, University of Amsterdam, Netherlands; 3Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П.Чумакова, Москва; 4ООО МО Новая больница, Екатеринбург; 5Ижевская государственная медицинская академия
Цель. Исследованы последствия инкубации Borrelia miyamotoi с нейтрофилами. Материалы и методы. Спирохеты B. miyamotoi штамма HT31 инкубировали 3 часа при 37оС с нейтрофилами здоровых доноров (5*106 клеток/мл) в пропорции 1:1. Среда инкубации содержала также неиммунную сыворотку крови здоровых доноров (СЗД) и в ряде экспериментов высокоиммунную сыворотку крови переболевших ИКБ-БМ (С-ИКБ-БМ). Методом темнопольной микроскопии оценивали долю нейтрофилов, связавших боррелии, а также количество и жизнеспособность (подвижность) свободных боррелий. Результаты.
В СЗД или С-ИКБ-БМ, инактивированной нагреванием, свободно плавающие боррелии остаются жизнеспособными, но около 10% боррелий оказывается связанными с нейтро-филами. В С-ИКБ-БМ с нейтрофилами доля свободных жизнеспособных боррелий снижается приблизительно на 10% по сравнению с С-ИКБ-БМ без нейтрофилов, еще около 15% связывается нейтрофилами. При добавлении хемоаттрактанта fMLP доля нейтрофилов, связавших боррелии, возрастает до 25%, а доля иммобилизированных не связанных боррелий достигает 40%. Заключение. Хотя нейтрофилы способны уничтожать боррелии при контакте или без контакта с ними, в модельных условиях совместное действие высокоиммунной сыворотки крови и нейтрофилов человека не обеспечивает 100% элиминации B. miyamotoi.
Журн. микробиол., 2018, № 2, С. 30-38
Ключевые слова: иксодовый клещевой боррелиоз, Borrelia miyamotoi, нейтрофилы, in vitro, антитела, система комплемента
A.E.Platonov1, J.Koetsveld2, N.M.Kolyasnikova1'3, O.A.Stukolova1, A.S.Dolgova1, M.G.Toporkova4, D.S.Sarksyan5
BACTERICIDAL EFFECT OF HUMAN SERUM ON BORRELIA MIYAMOTOI, CAUSATIVE AGENT OF IXODES TICK-BORNE BORRELIOSIS
1Central Research Institute of Epidemiology, Moscow; 2Academic Medical Centre, University of Amsterdam, Netherlands; 3Chumakov Federal Scientific Centre for Research and Development of Immunobiological Products, Moscow; 4Medical Association «New Hospital», Ekaterinburg; 5Izhevsk State Medical Academy, Russia
Aim. In this paper we investigate the impacts of co-incubation of Borrelia miyamotoi with neutrophils. Materials and methods. Spirochetes B. miyamotoi, strain HT31, were incubated 3 hours at 37°C with neutrophils of healthy donors (5*106 cells/ml) in a 1:1 ratio. The incubation medium contained also non-immune serum of healthy blood donors (SHD) and, in some experiments, high-immune serum of patients recovered from ITBB-BM (S-ITBB-BM). The proportion of neutrophils that bound borrelia, as well as the number and viability (mobility) of free borrelia, was estimated by dark-field microscopy. Results. Free-swimming borrelia remain viable in SHD or heat-inactivated S-ITBB-BM, but about 10% of borrelia are associated with neutrophils. In S-ITBB-BM with neutrophils, the proportion of viable borrelia among free ones decreases by approximately 10% compared to S-ITBB-BM without neutrophils; in addition about 15% ofbor-relia become bound by neutrophils. If chemoattractant fMLP was added, the proportion of neutrophils binding borrelia increases to 25%, and the proportion of immobilized non-bound borrelia reaches 40%. Conclusion. Although neutrophils are able to destroy borrelia with or without direct contact, under model conditions the combined effect ofblood neutrophils and high-immune human serum does not provide 100% elimination of B. miyamotoi.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No.2, P. 30-38
Key words: Ixodes tick-borne borreliosis, Borrelia miyamotoi, neutrophils, in vitro, antibodies, complement system
ВВЕДЕНИ Е
Классический иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) — это болезнь Лайма (БЛ), вызываемая спирохетами Borrelia burgdorferi sensu lato, переносимыми «твердыми» клещами рода Ixodes. «Мягкие» клещи рода Ornithodoros, встречающиеся преимущественно в зонах теплого и жаркого климата, переносят иные виды боррелий (B. hermsii, B. duttonii и др.), вызывающих клещевые возвратные лихорадки (КВЛ) [4]. Несмотря на широкое распространение БЛ
и КВЛ, поражающих миллионы людей ежегодно, взаимодействие нейтрофилов, моноцитов/макрофагов и других клеток иммунной системы с патогенными боррелиями изучено недостаточно. Известно, что боррелии могут быть фагоцитированы, в той или иной степени они вызывают дегрануляцию ней-трофилов, выделение активных форм кислорода, продукцию цитокинов и иных биологически активных соединений [14, 20]. Истощение фагоцитирующих макрофагов, дендритных клеток, нейтрофилов приводит к развитию высокой спирохетемии после подкожной инъекции B. hermsii или B. duttonii мышам, возможна гибель животных [4, 22]. С другой стороны, утверждается, что T-независимая продукция специфических IgM необходима и достаточна для защиты мышей от КВЛ [11]. Роль фагоцитов в защите от локализованной и генерализованной форм БЛ также неясна. Возможно, нейтрофилы и макрофаги не способны в полной мере реализовать свои протективные функции, поскольку многие патогенные боррелии экспрессируют белки, угнетающие фагоцитоз, например OspB и OcpC [10, 12].
Иксодовый клещевой боррелиоз, вызванный Borrelia miyamotoi (ИКБ-БМ)
— новое инфекционное заболевание, открытое в 2003 — 2009 гг. и клинически более близкое к КВЛ, чем к БЛ [1, 8, 15]. На стадии реконвалесценции ИКБ-БМ (7 — 21 день заболевания) наблюдается продукция специфических IgM к вариабельным основным липопротеинам наружной мембраны B. miyamotoi
— variable major lipoproteins (VMPs), разделяемым на два семейства: variable small lipoproteins (Vsp) и variable large lipoproteins (Vlp); Vlp, в свою очередь, разделяются на подсемейства Alpha, Gamma и Delta [9, 21]. Антитела к VMPs, как было показано в работе [7], обладают комплемент-зависимым бактерицидным действием на B. miyamotoi, но не обеспечивают, по крайней мере in vitro, гибели 100% спирохет. Об участии фагоцитов в борьбе с инфекцией B. miyamotoi на ранней стадии заболевания и во время реконвалесценции ничего не известно. В данной работе рассматриваются последствия взаимодействия B. miyamotoi с нейтрофилами при инкубации в сыворотке крови здоровых неиммунных доноров или сыворотке переболевших ИКБ-БМ, богатой специфическими антителами к VMPs.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Источник сывороток крови лиц, переболевших ИКБ-БМ, методы выявления специфических антител к B. miyamotoi и подготовки штамма боррелий к исследованию описаны ранее [7]. Вкратце, сыворотки собраны в ходе систематического исследования клиники ИКБ-БМ [8, 15]; уровень антител к четырем антигенным вариантам VMPs, называемым Vlp15/16, Vlp18, Vsp1 и Vlp5, измеряли с помощью разработанного в ЦНИИ эпидемиологии планарного белкового биочипа; штамм B. miyamotoi HT31 подращивали в специализированной жидкой среде MKP-FS [6, 13] до концентрации около 107 боррелий/ мл. Подсчет числа боррелий, а также контроль их жизнеспособности проводили методом темнопольной микроскопии.
Экспериментальная среда состояла из трех-пяти компонентов (табл.). В лунки с U-образным дном полипропиленового 96-луночного планшета добавляли компонент 1, сыворотку крови здорового донора (СЗД) без IgM и IgG к боррелиям. В отсутствии второго компонента объем компонента 1 составлял 50% от общего объема экспериментальной среды, то есть 50 мкл. В некоторых опытах вместо СЗД использовали инактивированную нагреванием СЗД (ИН-СЗД), в которой литическая активность системы комплемента (СК) равнялась
нулю. В качестве 2 компонента как источник специфических антител использовали смесь, в равных долях, сывороток крови 6 переболевших ИКБ-БМ (MIX6) в объеме 25 мкл. При этом для стандартизации условий эксперимента (активности СК, биохимического состава сыворотки и т.п.) в экспериментальной среде присутствовал и компонент 1 — СЗД — в объеме 25 мкл. Третьим компонентом, также в объеме 50% от общего объема, или 50 мкл, была суспензия 107/мл боррелий в среде MKP-FS. Таким образом, во всех экспериментальных условиях в начале эксперимента в лунке находилось 5*106/мл спирохет, 90 — 95% из которых были подвижными.
Нейтрофилы здорового донора выделяли из цельной крови с EDTA с помощью центрифугирования на среде Mono-Poly Resolving Medium согласно инструкции производителя (MP Biomedicals, США). После двукратной отмывки фосфатным буфером нейтрофилы пересуспензировали в компоненте 1 или смеси 1 и 2 компонентов до концентрации 107клеток/мл. Соответственно, в начале эксперимента с нейтрофилами в лунке находилось 5*106/мл нейтрофилов (компонент 4). Таким образом, концентрация фагоцитов и отношение числа фагоцитов к числу боррелий (1 к 1) имитировали нормальный состав крови в условиях высокой для ИКБ-БМ спиро-хетемии. В ряде экспериментов для активации нейтрофилов добавляли компонент 5: пептидный хемоаттрактант fMLP до финальной концентрации 1 мкМ/л.
После окончательного заполнения лунок планшет немедленно заклеивали и помещали в термостат для инкубации в условиях постоянного активного встряхивания-перемешивания. Через 1 час и через 3 часа инкубации из каждой лунки отбирали по 5 мкл и наносили на предметное стекло под покровное стекло. Оценка доли подвижных и неподвижных боррелий, а также доли нейтрофилов, связавших боррелии, проводилась немедленно методом темнополь-ной микроскопии независимым исследователем, не оповещенным о статусе изучаемого образца (контроль или опыт и т.п.). В каждой капле определяли состояние не менее 100 боррелий и 100 нейтрофилов, как правило, в 5 — 6 полях зрения (подробнее см. в [7]).
Все статистические расчеты и оценки проведены с помощью лицензионной программы IBM SPSS Statistics 19. Для оценки значимости различий распределений количественных переменных использовали стандартные непараметрические методы [2].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Результаты исследования жизнеспособности (подвижности) B. miyamotoi при инкубации в различных условиях представлены в табл., на основании которой возможны многочисленные сравнения проявлений эффекта иммобилизации. Для краткости величины уровня значимости всех подобных сравнений не приводятся. При рассмотрении таблицы читатель может воспользоваться правилом двух сигм: если диапазоны M1 — 2*SD1 и M2 + 2*SD2 не пересекаются, то величины M1 и M2 заведомо различны (p<0.05), где M — среднее арифметическое, а SD — выборочное стандартное отклонение. Строки 1 — 3 демонстрируют базовые, без добавления нейтрофилов, эффекты сыворотки: боррелии полностью сохраняют подвижность при инкубации в среде, содержащей 50% неиммунной СЗД (строка 1); их жизнеспособность статистически значимо уменьшается после часа или 3 часов инкубации в высокоиммунной С-ИКБ-БМ, содержащей IgM к каждому из VMPs (строка 2);
Подвижность и иммобилизация B. miyamotoi при инкубации в различных условиях
Номер п/п
1* СЗД50 нет нет нет 93.9±2.9 94.3±2.0 92.5±3.3
2 СЗД25 С-ИКБ-БМ, код MIX6 нет нет 92.0±1.3 82.2±3.6 80.0±1.5
3 ИН-СЗД25 ИН-С-ИКБ-БМ, код MIX6 нет нет 92.9±2.7 91.3±1.5 89.6±1.6
4 СЗД50 нет НФ, 5*106/мл нет 93.1±1.3 89.9±2.2 91.1±1.8
5 СЗД25 С-ИКБ-БМ, код MIX6 НФ, 5*106/мл нет 92.1±1.7 69.7±7.6 68.4±6.5
6 ИН-СЗД25 ИН-С-ИКБ-БМ, код MIX6 НФ, 5*106/мл нет 94.6±0.9 88.9±3.3 88.1±3.8
7 СЗД50 нет НФ, 5*106/мл fMLP, 1 мкМ/л 92.0±2.2 79.6±4.8 87.9±3.6
8 СЗД25 С-ИКБ-БМ, код MIX6 НФ, 5*106/мл fMLP, 1 мкМ/л 89.7±3.1 60.5±3.5 65.2±2.2
9 ИН-СЗД25 ИН-С-ИКБ-БМ, код MIX6 НФ, 5*106/мл fMLP, 1 мкМ/л 92.7±2.8 92.2±3.3 94.6±3.9
Примечание. * Во всех экспериментальных средах инкубации (строки 1—9) присутствует 3 компонент: боррелии штамма HT31 в среде MKP-FS, 5*106 на мл. СЗД50 — сыворотка крови здорового донора, 50%; СЗД25 — СЗД, 25%. С-ИКБ-БМ, код MIX6 — смесь взятых на стадии реконвалесценции сывороток крови 6 переболевших ИКБ-БМ, 25%. ИН-С-ИКБ-БМ — инактивированная нагреванием С-ИКБ-БМ, 25%. НФ — нейтрофилы. Указаны финальные концентрации сыворотки, боррелий, нейтрофилов и fMLP после их смешивания в составе экспериментальной среды инкубации.
инактивация СК нагреванием практически отменяет бактерицидное действие С-ИКБ-БМ (строка 3).
Добавление нейтрофилов к СЗД лишь незначительно, на 1 — 4%, снижает долю свободно плавающих боррелий (строка 4), при активации нейтрофилов хемоаттрактантом fMLP через час инкубации доля подвижных боррелий падает с 90 — 95% до 80% (строка 7). Визуально активация нейтрофилов в суспензии подтверждалась известным эффектом: большинство из них переходили из приблизительно сферической формы в поляризованную, ближе к овалу с отношением осей 1 к 2. При инкубации в С-ИКБ-БМ с нейтрофилами доля свободных подвижных боррелий дополнительно снижается приблизительно на 10% (строка 5), но это изменение не достигает уровня статистической значимости. При добавлении fMLP только 60 — 65% свободных боррелий остаются подвижными (строка 8), степень иммобилизации значимо отлична от иммобилизации только за счет бактерицидного действия С-ИКБ-БМ (строка 2), p<0.05, критерий Манна-Уитни. При инактивации нагреванием С-ИКБ-БМ не отмечается не только бактерицидного действия собственно ИН-С-ИКБ-БМ, но и иммобилизирующего эффекта добавления нейтрофилов, не активированных или активированных (между данными в строках 1, 3, 6 и 9 нет значимых различий).
Уже через 10 — 30 мин совместной инкубации часть нейтрофилов оказывается связанными с B. miyamotoi. Первичный контакт является точечным, через один из концов спиралевидной боррелии. Это заставляет предположить, что плавающие спирохеты сами «натыкаются» на нейтрофил, а не «вылавливаются» филоподиями фагоцита, проплывая мимо. Такие столкновения действительно наблюдались при микроскопии. Первичный контакт не является абсолютно прочным: приблизительно в 10 — 20% случаев через несколько
Состав экспериментальной среды, в которой проводится инкубация боррелий
Доля подвижных боррелии, %, среднее ± стандартное отклонение
Компонент 1 (сыворотка крови здорового донора)
Компонент 2 (сыворотка переболевших ИКБ-БМ)
Компонент 4 (нейтрофилы)
Компонент 5
(хемо -аттрактант)
В начале инкубации
Через 1 час инкубации
Через 3 часа инкубации
минут контакта, в течение которых борре-лии продолжают двигаться, им удается вырваться и уплыть. В ином варианте ней-трофил захватывает и противоположный конец спирали, после чего боррелия сгибается петлей, полностью иммобилизуется и, вероятно, впоследствии фагоцитируется (время наблюдения каждого стекла было ограничено 5 минутами, за это время завершенного фагоцитоза наблюдать не удалось). В использованных экспериментальных условиях (свободно плавающие боррелии и нейтрофилы в невысоких, но физиологичных концентрациях, имитирующих ситуацию внутри кровеносных сосудов) большинству нейтрофилов удается связать только одну боррелию. Однако при наблюдении одной-двух сотен нейтрофилов среди них обнаруживались несколько клеток, являющихся центром клубка десятков адгезированных боррелий. Видимых причин для такого различия моделей связывания не выявлено. Отсутствовало и явление розеткообразования, определяемое как агрегация нескольких ней-трофилов вокруг одной или нескольких боррелий. Практически не наблюдалась адгезия нейтрофилов друг к другу.
Зависимость доли нейтрофилов, связавшихся с боррелиями, от условий инкубации, отражена на рис. В СЗД она невысока (10 - 13%); в С-ИКБ-БМ приблизительно на 4% выше; в ИН-С-ИКБ-БМ незначительно ниже, чем в СЗД, и значимо ниже, чем в С-ИКБ-БМ. При добавлении £МЬР доля нейтрофилов, связавшихся с боррелиями, значимо возрастает (р<0.05, критерий Манна-Уитни), достигая 25 — 27% в С-ИКБ-БМ и, что было несколько неожиданно, в ИН-С-ИКБ-БМ. Через 24 часа совместной инкубации доля нейтрофилов, связавшихся с боррелиями, в среднем на 10% ниже, чем через 3 часа.
ОБСУЖДЕНИ Е
Согласно приведенным наблюдениям нейтрофилы способны частично ограничивать жизнеспособность В. ш1уашо1;о1. Один из механизмов, отраженный в табл., подразумевает дистанционное действие бактерицидных субстанций — активных форм кислорода и/или содержимого секреторных гранул [12, 20]. В наиболее благоприятных условиях (строка 9) это действие оказалось по мощности сопоставимо с бактерицидным действием собственно сыворотки/ плазмы крови и привело к дополнительной иммобилизации приблизительно 20% боррелий. Другой механизм основан на непосредственном изъятии боррелий из кровотока (при генерализованной инфекции ИКБ-БМ) путем фагоцитоза. Исходя из данных, представленных на рис., он может обеспечивать сокращение популяции боррелий на 20 — 30%. Однако те же результаты ука-
Время инкубации, часы
СЗД (4) СЗД-ИМ1_Р (7) -О С-ИКБ-БМ (5) -■- С-ИКБ-БМ-ИМ1_Р (8)
ИН-С-ИКБ-БМ (6) -♦•ИН-С-ИКБ-БМ-ИМЬР (9)
Связывание B. miyamotoi нейтрофилами при инкубации в различных условиях.
СЗД50 — сыворотка крови здорового донора; С-ИКБ-БМ — смесь взятых на стадии реконвалесценции сывороток крови 6 переболевших ИКБ-БМ; ИН-С-ИКБ-БМ — инактивированная нагреванием С-ИКБ-БМ; fMLP — пептидный хемоаттрактант. Номер в скобках соответствует номеру строки в табл., в которой дано более подробное описание соответствующих условий инкубации.
зывают, что нейтрофилы не являются ключевым элементом в защите от инфекции B. miyamotoi. Максимальный бактерицидный и опсонофагоцитарный эффект в отношении B. miyamotoi требует наличия интактной системы комплемента и специфических антител. Это не удивительно и характерно для иных боррелиозов [20, 22] и многих других генерализованных инфекций, например, менингококковой инфекции [16, 17], поскольку успешный опсонофагоцитоз предполагает синергичное действие рецепторов С3 компонента комплемента и Fc-рецепторов на поверхности нейтрофила и соответствующих мишеней на поверхности бактерии. Также и активация «дыхательного взрыва» и деграну-ляции нейтрофилов невозможна без стимулирующего контакта с мишенью или внешнего активатора, подобного fMLP, интерлейкину-8 или анафилаток-сину С5а. Важно для понимания механизма взаимодействия, но не критично в патофизиологическом смысле требование интактности СК, поскольку врожденные или приобретенные дефициты СК встречаются весьма редко [3]. Но требование наличия специфических антител отменяет значение нейтрофилов именно как эффекторов врожденного иммунитета против инфекции B. miya-motoi, то есть первой и наиболее быстро включающейся, даже по сравнению с макрофагами, линии защиты [20]. Возможно, с недостаточной эффективностью врожденного иммунитета связана относительно высокая, по сравнению с БЛ, контагиозность данной инфекции [19].
Наконец, обращает на себя внимание, что ни в работе [7], ни в данном исследовании не наблюдалось 100% уничтожение боррелий. Поскольку даже без антибиотикотерапии ИКБ-БМ рано или поздно заканчивается выздоровлением, то есть полной элиминацией боррелий, можно высказать несколько предположений, намечающих направление дальнейших исследований. Возможно, более плотное взаимодействие нейтрофилов с B. miyamotoi происходит не в свободном плавании, как в нашей модели, а в наиболее узких местах, таких как микрокапилляры, где может достигаться более высокая концентрация бактерицидных веществ. Поскольку и активированные нейтрофилы, и продукты их активации способны кроме бактерий поражать и сосудистый эндотелий, клиническим коррелятом событий в капиллярах может являться наблюдаемые при ИКБ-БМ микроциркуляторные нарушения [5]. Дополнительные затруднения в движении крови по капиллярам могут вызывать и выявляющиеся in vitro агрегаты нейтрофилов и десятков боррелий. Также in vivo боррелии могут преимущественно элиминироваться не нейтро-филами, а резидентными фагоцитами печени и селезенки. В опытах на крысах было показано, что Купфферовские клетки успешно связывают и убивают как различные штаммы группы B. burgdorferi sensu lato, так и боррелий-возбудителей КВЛ — B. hermsii, B. parkeri и B. turicatae [18]. Клиническим коррелятом взаимодействия клеток печени с B. miyamotoi могут быть проявления гепатита (повышение концентрации печеночных трансаминаз), наблюдающиеся приблизительно у половины больных ИКБ-БМ [8, 15]. В этой связи исследование патогенеза инфекции B. miyamotoi должно быть продолжено не только на клеточных моделях, но и в опытах на лабораторных животных.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №15-1500072). Авторы признательны медицинскому персоналу МО «Новая больница» Екатеринбурга и Республиканской клинической инфекционной больницы Удмуртской Республики за помощь в проведении исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Карань Л.С., Колясникова Н.М., Махнева Н.А. Топоркова М.Г., Надеждина М.В., Есаулкова А.Ю., Романенко В.В., Арумова Е.А., Платонов А.Е., Малеев В.В. Применение ПЦР в режиме реального времени для диагностики различных клещевых инфекций. Журн. микробиол. 2010, 3: 72-77.
2. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М., РАМН, 2000.
3. Платонов А.Е., Вершинина И.В. Менингококковая инфекция у лиц с дефицитами терминальных компонентов комплемента. Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999, 5: 38-43.
4. Платонов А.Е., Малеев В.В., Карань Л.С. Боррелиозные возвратные лихорадки: забытые и новые. Терапевтический архив. 2010, 82 (11): 74-80.
5. Платонов А.Е., Сарксян Д.С., Карань Л.С., Шипулин Г.А., Гордыгина Е.В., Малинин О.В., Малеев В.В. Состояние системы свертывания крови и микроциркуляторные нарушения при иксодовом клещевом боррелиозе, вызванном Borrelia miyamotoi. Терапевтический архив. 2015, 87 (11): 26-32.
6. Платонов А.Е., Koetsveld J., Колясникова Н.М., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., Шипулин Г.А., Hovius J.W Микробиологическое подтверждение этиологии «иксодового клещевого боррелиоза в безэритемной форме» — инфекции, вызываемой Borrelia miyamotoi. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2017, 92 (1): 29-35.
7. Платонов А.Е., Koetsveld J., Стуколова О.А., Долгова А.С., Колясникова Н.М., Топоркова М.Г., Сарксян Д.С. Бактерицидное действие сыворотки крови человека на Borrelia miyamotoi, возбудителя иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ-БМ). Журн. микро-биол. 2018, 1: 58—67.
8. Сарксян Д.С., Платонов А.Е., Карань Л.С, Малинин И.Е., Халитова Л.И., Шахов В.И., Дударев М.В., Малинин О.В., Малеев В.В. Клинические особенности «нового» клещевого боррелиоза, вызываемого Borrelia miyamotoi. Терапевтический архив. 2012, 84 (11): 34-41.
9. Стуколова О.А., Колясникова Н.М., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., Koetsveld J., Карань Л.С., Черкашина А.С., Маркелов М.Л., Долгова А.С., Hovius J.W., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. Разработка и использование планарного белкового биочипа для серологической диагностики клещевого боррелиоза, вызванного Borrelia miyamotoi. В: Молекулярная диагностика 2017. Под ред. Покровского В.И. Тамбов, ООО фирма «Юлис», 2017, 2: 151-152.
10. Carrasco S.E., Troxell B., Yang Y et al. Outer surface protein OspC is an antiphagocytic factor that protects Borrelia burgdorferi from phagocytosis by macrophages. Infect. Immun. 2015, 83(12): 4848-4860.
11. Colombo M.J., Alugupalli K.R. Complement factor H-binding protein, a putative virulence determinant of Borrelia hermsii, is an antigenic target for protective B1b lymphocytes. J. Immunol. 2008, 180 (7): 4858-4864.
12. Hartiala P., Hytonen J., Suhonen J. et al. Borrelia burgdorferi inhibits human neutrophil functions. Microbes Infect. 2008, 10 (1): 60-68.
13. Koetsveld J., Kolyasnikova N.M., Wagemakers A. et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clin. Microbiol. Infect. 2017, 23 (7): 480-484.
14. Oosting M., Buffen K., van der Meer J.W. et al. Innate immunity networks during infection with Borrelia burgdorferi. Crit. Rev. Microbiol. 2016, 42 (2): 233-244.
15. Platonov A.E., Karan L.S., Kolyasnikova N.M. et al. Humans infected with the relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi, Russia. Emerg. Infect. Dis. 2011, 17 (10): 1816-1822.
16. Platonov A.E., Shipulin G.A., Vershinina I.V. et al. Association of human FcyRIIa (CD32) polymorphism with susceptibility and severity of meningococcal disease. Clin. Infect. Diseases.1998, 27: 746-750.
17. Platonov A.E., Vershinina I.V., Kayhty H. et al. Antibody-dependent killing of meningococci by human neutrophils in serum of late complement component deficient patients. Int. Archive Immunology Allergy. 2003, 130: 314-321.
18. Sambri V., Aldini R., Massaria F. et al. Uptake and killing of Lyme disease and relapsing fever borreliae in the perfused rat liver and by isolated Kupffer cells. Infect. Immun. 1996, 64 (5): 1858-1861.
19. Sarksyan D.S., Platonov A.E., Karan L.S. et al. Probability of spirochete Borrelia miyamotoi transmission from ticks to humans. Emerg. Infect. Dis. 2015, 21 (12): 2273-2274.
20. Suhonen J., Hartiala K., Tuominen-Gustafsson H., Viljanen M.K. Borrelia burgdorferi-induced oxidative burst, calcium mobilization, and phagocytosis of human neutrophils are complement dependent. J. Infect. Dis. 2000, 181 (1): 195-202.
21. Wagemakers A., Koetsveld J., Narasimhan S. et al. Variable major proteins as targets for specific antibodies against Borrelia miyamotoi. J. Immunol. 2016, 196 (10): 4185-4195.
22. Woodman M.E., Cooley A.E., Avdiushko R. et al. Roles for phagocytic cells and complement in controlling relapsing fever infection. J. Leukoc. Biol. 2009, 86 (3): 727-736.
Поступила 31.08.17
Контактная информация: Платонов Александр Евгеньевич, д.б.н., проф.,
111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а, р.т. (495) 974-96-46
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
Е.А.Прокопьева1'2, К.А.Шаршов1, А.А.Романовская3, И.А.Соболев1, О.Г.Курская1, Е.И.Соловьева1'2, Л.В.Шестопалова2, А.В.Зайковская4, А.Ю.Алексеев1, А.М.Шестопалов1
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПАТОГЕННОСТИ ВИРУСОВ ГРИППА А(ШШ) И A(H1N1)pdm09 У ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ
1НИИ экспериментальной и клинической медицины, Новосибирск; 2Новосибирский национальный исследовательский государственный университет; 3Университет Хельсинки, Финляндия; 4ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирск
Цель. Проведено экспериментальное инфицирование лабораторных мышей линии ВАЬВ/с высокопатогенным вирусом гриппа птиц А(Н5Ш) и пандемическим вирусом гриппа A(H1N1)pdm09, адаптированного к мышам, с целью сравнения степени патоген-ности вновь возникших штаммов вируса гриппа с пандемическим потенциалом. Материалы и методы. Первую группу мышей линии ВАЬВ/с (п=24) инфицировали высокопатогенным вирусом гриппа А(Н5№) в дозе 5 ЛД50, а вторую группу (п=24) инфицировали адаптированным вариантом пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 в дозе 5 ЛД50. Определение ЛД50 и ТСГО50 выполняли с помощью вирусологических методов. Морфологические изменения во внутренних органах (легкое, головной мозг, печень, почка, селезенка) исследовали методами световой и трансмиссионной электронной микроскопии. Результаты. Вирусологический анализ показал, что оба штамма являются высоко летальными для мышей. Микроскопическое исследование выявило развитие интерстициальной пневмонии в легких и генерализацию инфекции по внутренним органам. Заключение. Обнаружено развитие высоко летального заболевания в виде респираторной пневмонии у обеих групп экспериментально инфицированных мышей линии ВАЬВ/с как под воздействием высокопатогенного вируса гриппа птиц А(Н5№), так и адаптированного пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09. При этом отмечается различный механизм развития патологического процесса: под воздействием адаптированного варианта вируса гриппа A(H1N1)pdm09 сперва развивается бронхит, который быстро усугубляется развитием альвеолита, в то время как под воздействием высокопатогенного вируса гриппа птиц А(Н5Ш) сразу же развивается альвеолит. На 6 сутки после инфицирования регистрируется развитие генерализованной инфекции у мышей обеих экспериментальных групп.
Журн. микробиол., 2018, № 2, С. 38—44
Ключевые слова: адаптированный вирус гриппа А(H1N1)pdm09, А(Н5Ш), генерализованная инфекция
