CC BY
17© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
А.Е.Платонов1, J.Koetsveld2, О.А.Стуколова', А.С.Долгова1, Н.М.Колясникова1'3, М.Г.Топоркова4, Д.С.Сарксян5
БАКТЕРИЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА BORRELIA MIYAMOTOI, ВОЗБУДИТЕЛЯ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОР-РЕЛИОЗА (ИКБ-БМ)
'Центральный НИИ эпидемиологии, Москва; 2Academic Medical Centre, University of Amsterdam, the Netherlands; 3Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П.Чумакова, Москва; 4000 МО «Новая больница», Екатеринбург; 5Ижевская государственная медицинская академия
Цель. Целью данной работы было изучение бактерицидного действия сыворотки крови человека на Borrelia miyamotoi in vitro. Материалы и методы. Спирохеты В. miyamotoi, штаммы НТ31 и LB-2001, инкубировали в неиммунной сыворотке здоровых доноров (СЗД), в СЗД с инактивированной нагреванием системой комплемента, а также в образцах сыворотки крови переболевших ИКБ-БМ. Жизнеспособность (подвижность) борре-лий после инкубации контролировали путем темнопольной микроскопии. Уровень сывороточных антител к специфическим белкам В. miyamotoi (ферменту GlpQ и поверхностным белкам Vlpl 5/16, Vlpl 8, Vspl, Vlp5) измеряли с помощью специально разработанного планарного белкового иммуночипа. Результаты. Боррелии полностью сохраняют жизнеспособность в неиммунной СЗД, но их подвижность частично или полностью подавляется при добавлении сыворотки крови переболевших ИКБ-БМ или кроличьих антител к В. miyamotoi. Иммобил изирующее действие иммунной сыворотки в существенной степени ингибируется при ее инактивации нагреванием, что указывает на опосредо-ванность этого эффекта системой комплемента. Заключение. Антитело-зависимое комплемент-опосредованное бактерицидное действие сыворотки крови человека, вероятно, не является единственным, 100% эффективным механизмом защиты человека от инфекции В. miyamotoi, но требует поддержки со стороны клеточного иммунитета.
Журн. микробиол., 2018, № 1, С. 58-67
Ключевые слова: иксодовый клещевой боррелиоз, Borrelia miyamotoi, бактерицидное действие сыворотки, in vitro, антитела, система комплемента
A.E.Platonov1, J.Koetsveld2, O.A.Stukolova1, A.S.Dolgova1, N.M.Kolyasnikova1-3, M.G.Toporkova4, D.S.Sarksyan5
BACTERICIDAL EFFECT OF HUMAN SERUM ON BORRELIA MIYAMOTOI, CAUSATIVE AGENT OF IXODES TICK-BORNE BORRELIOSIS (ITBB-BM)
'Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, Russia; 2Academic Medical Centre, University of Amsterdam, Netherlands; 3Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immunobiological Preparatios, Moscow, 4Medical Association «New Hospital», Ekaterinburg, 5Izhevsk State Medical Academy, Russia
Aim. Our aim was to study the bactericidal effect of human serum on Borrelia miyamotoi in vitro. Materials and methods. B. miyamotoi spirochetes (strains HT31 and LB-2001) were incubated in non-immune serum of healthy donors (SHD) and in heat inactivated complement-depleted SHD, as well as in serum samples of the patients recovered from ITBB-BM. The viability, that is motility, of borrelia after incubation was investigated by dark-field microscopy. The levels of serum antibody to fi.m/yamofoi'-specificprotems (GlpQ enzyme and four variable majorproteins Vlpl5/16, Vlpl8, Vspl, and Vlp5) were measured by specially designed plane protein microarray. Results. Borrelia fully retain their viability in non-immune SHD, but their motility is partially or completely suppressed by the addition of serum from ITBB-BM convalescents or rabbit antibodies to B. miyamotoi. The immobilizing effect of the immune serum is substantially inhibited by its heat-inactivation, which indicates that immobilizing effect is mediated by the complement system.
Conclusion. Antibody-dependent complement-mediated bactericidal action of human blood serum is probably not the only and 100% effective mechanism for human defense against B. miyamotoi infection, but requires support from cellular immunity.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 1, P. 58—67
Key words: ixodes tick-borne borreliosis, Borrelia miyamotoi, serum bactericidal activity, in vitro, antibodies, complement system
ВВЕДЕНИЕ
Иксодовый клещевой боррелиоз, вызванный Borrelia miyamotoi (ИКБ-БМ) — ранее неизвестное инфекционное заболевание, открытое в России [2, 18]. В отличие от «классического» иксодового боррелиоза — болезни Лайма (БЛ), вызываемой В. burgdorferi sensu lato, ИКБ-БМ представляет собой генерализованную инфекцию с преобладанием лихорадочного синдрома и возможностью преходящих нарушений функций печени, почек, сердца и других органов [1,5,6,8]. Уиммунокомпрометированных пациентов инфекция В. miyamotoi может становиться хронической и сопровождаться таким угрожающим жизни осложнением как менингоэнцефалит [13, 14].
Боррелии вида В. miyamotoi обнаруживаются повсеместно в иксодовых клещах, распространенных в зонах умеренного климата Евразии и Северной Америки, и генетически принадлежат к группе боррелий — возбудителей клещевых возвратных лихорадок (КВЛ) [17, 26]. При условии адекватной антибиотикотерапии рецидивов ИКБ-БМ не возникает; в естественных условиях, без антибиотикотерапии возможны, как и при КВЛ, новые приступы лихорадки через 1 — 2 недели [9]. Для понимания динамики инфекционного процесса при ИКБ и КВЛ необходимо, в первую очередь, ответить на ряд вопросов: что позволяет возбудителям в течение инкубационного периода успешно размножаться в крови и тканях организма человека, несмотря на сопротивление иммунной системы? Что происходит на стадии естественной, без антибиотикотерапии элиминации возбудителя в ходе выздоровления? Какие эффекторные звенья иммунитета критически необходимы для выздоровления? Почему выздоровление не всегда бывает полным и возможны рецидивы или хронизация боррелиозов? История изучения БЛ насчитывает более 30 лет, а КВЛ — даже более 100 лет, тем не менее, убедительных и полных ответов на сформулированные выше вопросы не получено. Предполагается, что вирулентные штаммы возбудителей КВЛ и БЛ защищены от бактериоли-тического действия системы комплемента (CK) млекопитающих, поскольку экспрессируют на своей поверхности ряд фактор Н-связывающих белков (Fhbp). Такие белки-липопротеины выявлены у В. burgdorferi s.l. (OspE, BbCRASPs, BaCRASPs), В. hermsii (BhCRASPs или FhbA) и других боррелий [4, 20, 21, 23]. В свою очередь, фактор Н и фактор Н-похожие белки хозяина способствуют инактивации фактора СЗЬ, распаду СЗ-конвертазы и, тем самым, ингибируют сборку мембраноатакующих комплексов (МАК) комплемента на поверхности бактерий. Защищенные в результате этой «молекулярной мимикрии», по крайней мере, от активации CK по альтернативному пути, боррелии размножаются и накапливаются в кровотоке, при КВЛ до таких высоких концентраций как 108 боррелий на мл крови [4]. Ряд экспериментов показывает, что Т-независимая продукция специфических IgM необходима и достаточна для защиты мышей от КВЛ [12]. При этом важными антигенами возбудителей
КВЛ являются вариабельные основные липопротеины наружной мембраны — variable major lipoproteins (VMPs), разделяемые на два семейства: variable small lipoproteins (Vsp) и variable large lipoproteins (Vlp). Vlp, в свою очередь, разделяются на подсемейства alpha, beta, gamma и delta. Антитела к VMPs потенциально могут быть протективными. Однако у возбудителей КВЛ от 26 до 80 вариантов генов Vsp и Vlp, хотя в каждый отдельный момент активен только ген, находящийся в специальном месте экспрессии на линейной плазмиде. Остальные варианты находятся на молчащих архивных плазмидах, но в процессе рекомбинации могут заместить работающий ген [11, 24]. По мере того, как вырабатываются антитела к первому серотипу, количество боррелий в крови уменьшается, при возникновении нового удачного сероварианта боррелии вновь накапливаются в крови.
Сведения о взаимодействии нового возбудителя В. miyamotoi с иммунной системой человека практически отсутствуют. В заголовках двух публикаций сообщается, что боррелии вида В. miyamotoi являются комплемент-резистентными [22, 25], в третьей статье уточняется, что резистентность обеспечивается фактор Н-связывающим белком CbiA [19]. Это весьма неточное утверждение, поскольку реально в этих исследованиях показано только, что бактерицидное действие сыворотки крови человека не реализуется в условиях отсутствия анти-боррелиозных антител, то есть по механизму активации альтернативного и/или лектинового пути CK. В нашей работе рассматривается взаимодействие В. miyamotoi с сывороткой крови в более физиологических условиях, в первую очередь, при добавлении сыворотки переболевших ИКБ-БМ, богатой специфическими антителами к VMPs.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа проведена на базе ООО МО «Новая больница» Екатеринбурга и Республиканской клинической инфекционной больницы Удмуртской Республики в эпидемический сезон (июнь—июль) 2015 и 2016 гг. Критерием включения пациента было подозрение на клещевую инфекцию. Применялись как стандартные диагностические методы (определение IgM и IgG кборрели-ям и вирусу клещевого энцефалита), так и оригинальные методики специфических ПЦР, выявляющих ДНК В. miyamotoi или В. burgdorferi s.l., описанные в деталях ранее [2, 18]. ИКБ-БМ диагностировался на основании детекции ДНК В . miyamotoi в крови больного при отсутствии лабораторных признаков иных инфекций. Образцы сыворотки крови больных ИКБ-БМ собирались во время лечения и на стадии реконвалесценции — через 1 и 3 месяца после начала заболевания и затем хранились и транспортировались в условиях глубокой заморозки до момента использования в эксперименте.
Для серологаческой дифференциации ИКБ, вызываемых В. burgdorferi s.l. и В. miyamotoi, предложено использовать антитела к ферменту глицеро-фосфодиэстер-фосфодиэстеразе (GlpQ), который не синтезируется видами В. burgdorferi s.l., но встречается у В. miyamotoi [17, 24, 26]. Разработанный в ЦНИИ эпидемиологии планарный белковый биочип включает белки-антигены как В. burgdorferi s.l., так и В. miyamotoi (GlpQ, Vlpl5/16, Vlpl8, Vspl, Vlp5), для которых были получены генноинженерные конструкции, кодирующие антигенную область, фрагмент белка или полную последовательность белка. Антигены были экспрессированы в Escherichia coli, очищены методами аффинной и ионообменной хроматографии и нанесены на иммуночип/слайд с альдегидным покрытием 3D-Aldehyde Glass Slides (PolyAn, Германия). Учет результатов анализа после нанесения на иммуночип сыворотки крови больных
и вторичных антител к иммуноглобулинам человека проводили с помощью многоканального флуоресцентного сканера MarS (Ditabis, Германия), а обсчет, стандартизацию и интерпретацию результатов — с использованием специально разработанного программного обеспечения StarSky. Уровень специфических IgM и IgG характеризовали полуколичественным способом по величине стандартизованного оптического сигнала [10].
В работе использованы два штамма В. miyamotoi НТ31 и LB-2001, из коллекции Академического медицинского центра, Амстердам. Штамм НТ31 принадлежит к азиатскому генотипу и изолирован от клеща Ixodes persulcatus в Японии, получен из хранилища Центров по контролю заболеваемости, США. Штамм LB-2001, принадлежащий к американскому генотипу, получен из Йельского университета, ранее изолирован от клеща Ixodes scapularis. Штаммы первых пассажей (до десятого) хранились в условиях глубокой заморозки, для целей данной работы они подращивались в ранее разработанной специализированной среде MKP-FS [16, 25] при 33°С до окончания логарифмической фазы роста приблизительно через неделю при концентрации около 107 бор-релий/мл. После центрифугирования и отмывки свежей средой MKP-FS приготовляли суспензию боррелий, содержащую точно 107 живых подвижных спирохет на мл (компонент 1 экспериментальной среды). Подсчет клеток и контроль их жизнеспособности проводили методом темнопольной микроскопии.
Экспериментальная среда состояла из двух-трех компонентов (табл.). В лунки с U-образным дном полипропиленового 96-луночного планшета до-
Подвижность и иммобилизация В. miyamotoi при инкубации в различных условиях
Номер п/п Состав экспериментальной среды, в которой проводится инкубация боррелий Доля подвижных боррелий (%), среднее ¿стандартное отклонение
Компонент 1 (сыворотка крови) Компонент 2 Компонент 3 (штамм В. miyamotoi) В начале инкубации Через час инкубации Через 3 часа инкубации
1 СЗД50 нет LB-2001 95.1±2.4 91.6+1.9 90.1+1.5
2 ИН-СЗД50 нет LB-2001 95.4±1.4 91.8+2.2 91.9±2.9
3 СЗД50 нет НТ31 90.7±1.9 86.7±3.2 85.3+3.5
4 ИН-СЗД50 нет НТ31 95.0+1.0 95.0±1.0 95.9±1.4
5 СЗД50 Анти-\£р1 ^С, 100 мкг/мл LB-2001 92.1+1.7 0.3±0.5 0.0
6 ИН-СЗД50 Анти-\£р1 100 мкг/мл LB-2001 91.1+1.3 49.8±3.1 6.5±4.8
7 СЗД50 Анти-\%р1 20 мкг/мл LB-2001 95.3+1.1 39.2±6.3 1.7±3.2
8 ИН-СЗД50 Анти-\%р1 Тяв, 20 мкг/мл LB-2001 96.6+0.6 83.9±6.3 33.9±8.8
9 СЗД50 активированный зимозан, 0.05% LB-2001 94.8±1.7 88.9+1.8 90.5+1.6
10 СЗД50 активированный зимозан, 0.05% HT31 90.3+2.1 84.8 ±6.7 90.4±4.2
11 СЗД25 С-ИКБ-БМ, код М1Я-4672-02 HT31 96.7±0.8 68.6±4.3 58.0±4.9
12 СЗД25 С-ИКБ-БМ5, код МЖ-4672-02 HT31 96.7±0.8 92.9±2.9 71.7±1.7
13 ИН-СЗД25 ИН-С-ИКБ-БМ, код МЖ-4672-02 HT31 96.7±0.8 95.1+1.7 95.3+1.1
14 СЗД25 С-ИКБ-БМ, код 5Ни-7-ЗМ HT31 96.7+0.8 69.0±3.0 59.5±3.5
15 ИН-СЗД25 ИН-С-ИКБ-БМ, код 5Ни-7-ЗМ HT31 96.7+0.8 88.9+2.6 94.9±1.6
16 СЗД25 С-ИКБ-БМ, код БН1-3-1М HT31 96.7±0.8 56.1+5.1 47.2±3.7
17 ИН-СЗД25 ИН-С-ИКБ-БМ, код БШ-З-Ш HT31 96.7±0.8 89.3±2.2 88.5+1.9
Примечание. СЗД50 — сыворотка крови здорового донора, 50%; СЗД25 - СЗД, 25%; ИН-СЗД50
- инакгивированная нагреванием СЗД, 50%; ИН-СЗД25 - ИН-СЗД, 25%. С-ИКБ-БМ - сыворотка крови переболевшего ИКБ-БМ, взятая на стадии реконвалесценции, 25%. Код соответствует пациенту и времени взятия образца сыворотки. С-ИКБ-БМ5 —С-ИКБ-БМ, разведенная МКР-РБ, 5%. ИН-С-ИКБ-БМ — инактивированная нагреванием С-ИКБ-БМ, 25%. Компонент 3 — суспензия боррелий в среде МКР-РБ, 5х106намл. Указаны финальные концентрации сыворотки, антител, зимозана и боррелий после их смешивания в составе экспериментальной среды инкубации. Жирным шрифтом выделены условия, в которых число подвижных боррелий ниже 70%.
бавляли компонент 1, сыворотку крови здорового донора (СЗД) без IgM и IgG к боррелиям. В отсутствии второго компонента объем компонента 1 составлял 50% от общего объема экспериментальной среды, то есть обычно 50 мкл. В некоторых опытах вместо СЗД использовали инактивированную нагреванием СЗД (ИН-СЗД). Известно, что после инактивации сыворотки нагреванием (56°С, 1 час) литическая активность СК равна нулю, в то время как большинство других белков, включая антитела, остаются интактными. В качестве 2 компонента мог быть использован раствор поликлональных кроличьих IgG к Vspl [24] в различных концентрациях в фосфатном буфере (ФБ) в объеме 5 мкл или для контроля эффекта этих антител просто ФБ 5 мкл. При этом объем компонента 1 уменьшали до 45 мкл. Еще в одном эксперименте компонентом 2 служила взвесь активированного зимозана в ФБ. Чаще всего в качестве компонента 2 как источник специфических антител использовали сыворотку крови переболевших ИКБ-БМ в объеме 25 мкл. При этом для стандартизации условий эксперимента (активности СК, биохимического состава сыворотки и т.п.) в экспериментальной среде присутствовал и компонент 1 — СЗД — в объеме 25 мкл. Третьим компонентом, также в объеме 50% от общего объема или 50 мкл, была суспензия боррелий. Таким образом, во всех экспериментальных условиях в начале эксперимента в лунке находилось 5х106/мл спирохет, 90 — 97% из которых были подвижными.
После окончательного заполнения лунок планшет немедленно заклеивали и помещали в термостат для инкубации в микроаэробных условиях. Через 1 час и 3 часа инкубации из каждой лунки отбирали по 4 капли экспериментальной среды с боррелиями объемом 5 мкл и наносили по отдельности на предметное стекло под покровное стекло. Оценка доли подвижных и неподвижных боррелий проводилась немедленно методом темнопольной микроскопии независимым исследователем, не оповещенным о статусе изучаемого образца (контроль или опыт и т.п.). В каждой капле определяли состояние не менее 100 боррелий, как правило, в 5 — 6 полях зрения. Ранее было показано, что оценка числа подвижных боррелий в остром эксперименте, длящемся 1 — 3 часа, практически равноценна оценке способности боррелий к росту в аналогичных условиях в эксперименте, длящемся трое суток: иммобилизация 100% боррелий соответствует 100% ингибированию роста, иммобилизация 50% боррелий соответствует окончательной гибели 50% боррелий на более поздних стадиях инкубации и т.п. [15, 19]. Визуально первая стадия лизиса боррелий, следующая за иммобилизацией, выражается в нарушении строгой штопоро-образной формы спирохет, их скрючивании, появлении многочисленных выпячиваний (blebs) наружной мембраны.
Все статистические расчеты и оценки проведены с помощью лицензионной программы IBM SPSS Statistics 19. Для оценки значимости различий распределений количественных и качественных переменных использовали стандартные непараметрические методы [3].
РЕЗУЛЬТАТЫ
При инкубации в течение 1 — 3 часов в среде MKP-FS боррелии сохраняют подвижность; то же самое наблюдается и при инкубации в среде, содержащей 50% СЗД (табл. строки 1 и 3) или же 50% ИН-СЗД (строки 2 и 4). Добавление 100 мкг/мл IgG к Vspl приводит к быстрой и необратимой иммобилизации и лизису боррелий штамма LB-2001, которые экспрессируют именно этот VMP (строка 5); использование ИН-СЗД вместо СЗД замедляет, но не прекращает этот процесс (строка 6). При использовании меньшей кон-
ЮОп
д:
80-:
60
А
т:
Д,
X *
ш Ч о
40
Л
центрации антител к Узр 1(20 мкг/мл) иммобилизация в СЗД также существенно замедляется (строка 7), а иммобилизация в ИН-СЗД незначительна (строка 8) — через 3 часа и даже через 24 часа инкубации (данные не приводятся) часть боррелий сохраняет жизнеспособность. На штамм НТ31, не экспресси-рующий белки семейства Увр, антитела к Узр1 не действуют (данные не приводятся).
Если в среду, содержащую СЗД и боррелии, добавляется активированный зимозан в количестве (0,05% по весу), достаточном для связывания и потребления присутствующих компонентов СК, значимой иммобилизации боррелий также не происходит (строки 9 и 10). Это значит, что отсутствует так называемый «эффект свидетеля», когда образующиеся в ходе активации СК растворимые МАК неспецифически связываются с соседними клетками, вызывая их повреждение.
Наибольшее число экспериментов поставлено в условиях, когда в среде инкубации присутствуют 25% СЗД, не содержащей антител к боррелиям (как стандартизованный источник компонентов СК), и 25% сыворотки крови переболевших ИКБ-БМ, взятой на стадии реконвалесценции, до 3 месяцев после начала заболевания (как источник специфических противоборрелиоз-ных антител). Сыворотку крови, взятую во время лечения, нельзя было использовать, так как она содержала антибиотик. Как и ожидалось, эффект различных образцов сыворотки переболевших варьировал в широком диапазоне: от 0 до 100% иммобилизованных спирохет. Всреднемчерез 1 час инкубации 70+15% (среднее±стандартное отклонение, М±50) спирохет штамма НТ31 были подвижными (изучено 20 образцов от 14 больных). Через 3 часа эта величина менялась незначительно — до 66+19%.
В табл. приведено несколько примеров иммобилизирующего действия сыворотки крови переболевших (строки 11,14,16), его ингибирования при предварительной инактивации СК нагреванием (строки 13, 15, 17) или при разбавлении сыворотки переболевших (строка 12).
На основании данных табл. возможны многочисленные сравнения проявлений эффекта иммобилизации в различных условиях. Для краткости величины уровня значимости всех подобных сравнений не приводятся. При рассмотрении табл. можно воспользоваться «правилом двух сигм»: если диапазоны М1-2х501 и М2+2х502 не пересекаются, то величины М1 и Мг заведомо различны (р<0,05).
Из 20 образцов сыворотки, исполь-
20
Группа А, 12 сывороток
□ Через 1 час
Группа Б, 8 сывороток
3 Через 2 часа
инкубации
Рис. 1. Влияние содержания ^М к УМРв на иммобилизацию В. пиуатоЫ.
Ось ординат — доля подвижных боррелий штамма НТЗ1 после 1 и 3 часов инкубации в смеси образцов сыворотки крови переболевших ИКБ-БМ (компонент 2) и сыворотки крови здорового донора (компонент 1). Группа А — образцы сыворотки крови переболевших ИКБ-БМ, не содержащие ^М к УМР или содержащие антитела только к одному из 4 УМРб; Б — образцы сыворотки крови переболевших ИКБ-БМ, содержащие ^М к двум или более из 4 УМРб. Достоверность различия между группами А и Б по критерию Манна-Уитни р=0,0007 и 0,00002 для 1 и 3 часов инкубации соответственно.
зованных в опытах со штаммом НТЗ1, 15 содержали ^М к С1р(3 и 14 — 1§С; только в двух образцах отсутствовали и 1ёМ, и Однако ни наличие, ни уровень антител к этому внутриклеточному ферменту не коррелировали с иммобилизующим действием сыворотки. Также эффект сыворотки переболевших не коррелировал и с уровнем ^М или к каждому из 4 УМРэ по отдельности. Влияние ^М (но не ^в) к УМРв проявлялось следующим образом: 14 образцов сыворотки содержали 1§М кУ1р15/16,9 к У1р5, по 4 образца — антитела к У1р18 или УврЬ При этом 6 использованных образцов не содержало антител ни к одному из 4УМР5,6 — только антитела к У1р 15/16, и 2, 4 и 2 образца содержали ^М к двум, трем или 4 УМРз соответственно. Иммобилизующий эффект был значимо выше у образцов, содержащих антитела к 2 и более УМРв (рис. 1) и коррелировал с суммарной концентрацией 1§М кУМРв (рис. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
Концентрация IgM к VMPs, усл. ед./мл
Рис. 2. Влияние содержания к УМРв на иммобилизацию В. пнуатоЫ.
Ось ординат — доля подвижных боррелий штамма НТ31 после 3 часов инкубации в смеси образцов сыворотки крови переболевших ИКБ-БМ (компонент 2) и сыворотки крови здорового донора (компонент 1). Ось абсцисс — суммарный уровень антител к 4 УМРв (У1р15/1б, У1р5, У1р18 и УБр1). Кружки представляют результаты отдельных экспериментов с 20 образцами сыворотки крови переболевших ИКБ-БМ, линия — линейная аппроксимация взаимосвязи, коэффициент корреляции Спирмена 0,70, р=0,001.
Результаты позволяют прийти к некоторым выводам и гипотезам, пока предварительным, поскольку наша работа является первым исследованием такого типа. Как и некоторые другие, хотя и не все, патогенные боррелии [19, 22, 25] В. miyamotoi успешно выживают в неиммунной сыворотке крови человека. Это означает, что активация СК по альтернативному и лектиновому пути и последующая сборка МАК на поверхности боррелий ингибируются, вероятно, за счет присутствия специальных белков, отвечающих за «молекулярную мимикрию» [4, 21, 23]. При таких генерализованных инфекциях, как ИКБ-БМ, активация СК может идти не только на поверхности собственно бактерий, но и на поверхности эндотелия сосудов и клеток крови. Активированные компоненты СК гипотетически могли бы атаковать боррелии за счет «эффекта свидетеля» (bystander lysis), однако в опытах с активированным зимозаном нами подобного явления не обнаружено.
Специфические антитела способны инициировать иммобилизацию и гибель В. miyamotoi, судя по всему, двумя способами. Первый способ не требует активации СК и реализуется при очень высоких, практически не физиологических концентрациях антител, заключаясь, по-видимому, в нарушении структуры липидной наружной мембраны. Второй способ предполагает активацию С К по классическому пути и образование МАК, поскольку не функционирует при «декомплементации» сыворотки нагреванием. Эффект антител дозозависим и снижается при разбавлении сыворотки как источника антител. При анализе связи содержания IgM и IgG к специфическим белкам В. miyamotoi (VMPs и GlpQ) и иммобилизующего действия конкретного образца сыворотки на штамм НТ31 обращает на себя внимание несколько обстоя-
тельств. На фоне наличия IgM не удается выявить заметного влияния присутствия IgG в образце. В этой связи, планируется изучить эффект IgG с использованием «поздних» образцов, взятых спустя год и позже от начала заболевания. Антитела к GlpQ, хотя и являются хорошим диагностическим серомаркером инфекции ИКБ-БМ, вероятно, слабо участвуют в иммобилизующем действии сыворотки и не являются протективными. Эффект антител к VMPs максимален при их высокой концентрации и в большей степени выражен при синэргичном действии антител к нескольким VMPs, чем при воздействии только антител к наиболее распространенному в изученных условиях VMP, то есть к Vlpl5/16. Примечательно, что при анализе клинических проявлений ИКБ-БМ выясняется, что тяжесть заболевания в большей степени коррелирует также с суммарным количеством антител к VMPs, а не с уровнем антител к отдельным VMP [Платонов А.Е. и др., 2017].
Теоретически рассуждая, полное выздоровление, хотя бы и после нескольких приступов ИКБ, должно сопровождаться полной и окончательной элиминацией боррелий из организма. В наших экспериментах даже в самых «бактерицидных» образцах сыворотки переболевших сохраняется некоторое количество жизнеспособных, подвижных боррелий. Можно сформулировать ряд объяснений этому факту. Во-первых, у всех наших больных выздоровление было достигнуто путем ранней антибиотикотерапии. Возможно, при этом продукция достаточного количества антител не запускается. Во-вторых, «бактерицидное» действие сыворотки может быть крайне узкоспецифичным, то есть 100% эффект будет достигаться только против штамма, вызвавшего заболевание, или «очень похожих» изолятов, а не против лабораторных штаммов НТ31и LB-2001. Предварительные опыты с клиническими изолятами В. mi-yamotoi, которые удалось получить [7, 16], свидетельствуют в пользу этого предположения. В-третьих, следует ожидать синэргичного действия защитных сил организма против генерализованной инфекции ИКБ-БМ: в элиминации В. miyamotoi могут принимать участие не только антитела и СК, но и фагоциты крови, резидентные макрофаги, дендритные клетки. В любом случае, исследование взаимодействия различных компонентов иммунной системы с В. miyamotoi должно быть продолжено и расширено в контексте патогенеза этой новой, практически неизученной инфекции.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 1515-00072). Авторы признательны медицинскому персоналу ООО МО «Новая больница» Екатеринбурга и Республиканской клинической инфекционной больницы Удмуртской Республики за помощь в проведении исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. БагаутдиноваЛ.И., ПлатоновА.Е., СарксянД.С., СтуколоваО.В., Шипулин Г.А., Малеев В.В., Дударев М.В. Катамнез больных иксодовыми клещевыми боррелиозами, вызванными Borrelia miyamotoi или Borrelia burgdorferi sensu lato. Терапевтический архив. 2016, 88 (11): 43-54.
2. Карань JI.C., Колясникова Н.М., Махнева Н.А. Топоркова М.Г., Надеждина М.В., Есаулкова А.Ю., Романенко В.В., Арумова Е.А., Платонов А.Е., Малеев В.В. Применение ПЦР в режиме реального времени для диагностики различных клещевых инфекций. Журн. микробиол. 2010, 3: 72-77.
3. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М., Издательство РАМН, 2000.
4. Платонов А.Е., Малеев В.В., Карань JI.C. Боррелиозные возвратные лихорадки: забытые и новые. Терапевтический архив. 2010, 82 (11): 74-80.
5. Платонов А.Е., Сарксян Д.С., Малеев В.В. Применение метода «дерева решений» для
построения алгоритмадифференциальнойдиагностикиприродно-очаговых инфекций. Терапевтический архив. 2013, 85 (11): 21-26.
6. Платонов А.Е., Сарксян Д.С., Карань Л.С., Шипулин Г.А., Гордыгина Е.В., Малинин О.В., Малеев В.В. Состояние системы свертывания крови и микроциркуляторные нарушения при иксодовом клещевом боррелиозе, вызванном Borrelia miyamotoi. Терапевтический архив. 2015, 87 (11): 26-32.
7. ПлатоновА.Е., KoetsveldJ., КолясниковаН.М., СарксянД.С., ТопорковаМ.Г., Шипулин Г.А., Hovius J.W. Микробиологическое подтверждение этиологии «иксодового клещевого боррелиоза в безэритемной форме» — инфекции, вызываемой Borrelia miyamotoi. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2017, 92 (1): 29-35.
8. Сарксян Д.С., Платонов А.Е., КараньJI.C, Малинин И.Е., Халитова Л.И., Шахов В.И., Дударев М.В., Малинин О.В., Малеев В.В. Клинические особенности «нового» клещевого боррелиоза, вызываемого Borrelia miyamotoi. Терапевтический архив. 2012, 84 (11): 34-41.
9. Сарксян Д.С., Малеев В.В., Платонов А.Е., Платонова О.В., Карань JI.C. Рецидивирующее (возвратное) течение заболевания, вызванного Borrelia miyamotoi. Терапевтический архив. 2015, 87 (11): 18-25.
10. СтуколоваО.А., Колясникова Н.М., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., KoetsveldJ., Карань JI.C., Черкашина A.C., Маркелов M.JL, Долгова A.C., Hovius J.W., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. Разработка и использование планарного белкового биочипа для серологической диагностики клещевого боррелиоза, вызванного Borrelia miyamotoi. В: Молекулярная диагностика 2017. Под ред. Покровского В.И. Тамбов, ООО фирма «Юлис», 2017, 2:151-152.
11. Barbour A.G. Multiple and diverse vsp and vlp sequences in Borrelia miyamotoi, a hard tickborne zoonotic pathogen. PLoS One. 2016,11 (1): e0146283.
12. Colombo M.J., Alugupalli K.R. Complement factor H-binding protein, a putative virulence determinant of Borrelia hermsii, is an antigenic target for protective Bib lymphocytes. J. Immunol. 2008, 180 (7): 4858-4864.
13.Gugliotta J.L., Goethert H.K., Berardi V.P., Telford S.R. Meningoencephalitis from Bor, relia miyamotoi in an immunocompromised patient. New Engl. J. Med. 2013, 368 (3): 240245.
14. Hovius J.W., de Wever В., Sohne M. et al. A case of meningoencephalitis by the relapsing fever spirochaete Borrelia miyamotoi in Europe. Lancet. 2013, 382 (9892): 658.
15. Koetsveld J., Draga R.O.P., Wagemakers A. et al. In vitro susceptibility of the relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi to antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother. 2017, Jul 3. doi: 10.1128/AAC.00535-17.
16. Koetsveld J., Kolyasnikova N.M., Wagemakers A. et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clin. Microbiol. Infect. 2017, 23 (7): 480-484.
17. Krause P.J., Fish D., Narasimhan S., Barbour A.G. Borrelia miyamotoi infection in nature and in humans. Clin! Microbiol. Infect. 2015, 21 (7): 631-639.
18. Platonov A.E., Karan L.S., Kolyasnikova N.M. et al. Humans infected with the relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi, Russia. Emerg. Infect. Dis. 2011,17 (10): 1816-1822.
19. Rottgerding F., Wagemakers A., Koetsveld J. et al. Immune evasion of Borrelia miyamotoi: CbiA, a novel outer surface protein exhibiting complement binding and inactivating properties. Sei. Rep. 2017, 7 (1): 303.
20. Schott M., Grosskinsky S., Brenner C. et al. Molecular characterization of the interaction of Borrelia parken and Borrelia turicatae with human complement regulators. Infect. Immun. 2010,78 (5): 2199-2208.
21. Stone B.L., Brissette C.A. Host immune evasion by Lyme and relapsing fever Borreliae: findings to lead future studies for Borrelia miyamotoi. Front. Immunol. 2017,8:12.
22. Teegler A., Herzberger P., Margos G. et al The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi resists complement-mediated killing by human serum. Ticks Tick Borne Dis. 2014,5 (6): 898901.
23.Tsao J.I. Reviewing molecular adaptations of Lyme borreliosis spirochetes in the context of reproductive fitness in natural transmission cycles. Vet. Res. 2009,40 (2): 36.
24. Wagemakers A., Koetsveld J., Narasimhan S. et al. Variable major proteins as targets for specific antibodies against Borrelia miyamotoi. J. Immunol. 2016,196 (10): 4185-4195.
25. Wagemakers A., Oei A., Fikrig M.M. et al. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasit. Vectors 2014, 7:418.
26. Wagemakers A., StaarinkPJ., Sprang H., Hovius J. W. Borrelia miyamotoi: a widespread tickborne relapsing fever spirochete. Trends Parasitol. 2015, 31 (6): 260-269.
Поступила 21.08.17
Контактная информация: Платонов Александр Евгеньевич, д.б.н., проф.,
111123, Москва, ул. Новогиреевская, За, р.т. (495) 976-96-46
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
Г.Т.Урядова, Е.А.Горельникова, Н.А.Фокина, А.С.Долмашкина, Л.В.Карпунина
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ НА СИНТЕЗ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ МАКРОФАГАМИ МЫШЕЙ ПРИ ФАГОЦИТОЗЕ STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова
Цель. Изучение влияния экзополисахаридов (ЭПС) молочнокислых кокков на цито-киновую активность макрофагов мышей при фагоцитозе in vitro Staphylococcus aureus 209-P. Материалы и методы. В работе использовали ЭПС Streptococcus thermophilus и Lactococcus lactis В-1662. На 1, 3, 5 и 7 выделяли альвеолярные (АМФ) и перитонеальные (ПМФ) макрофаги и моделировали процесс фагоцитоза in vitro. Через 30 минут, 1,6 и 24 часа определяли содержание провоспалительных цитокинов ИЛ- 1а и ФНО-а. Результаты. ЭПС оказывали неоднозначное влияние на продукцию цитокинов. Наибольшее действие на синтез ИЛ-1 а и ФНО-а оказывал ЭПС S. thermophilus. Заключение. Результаты исследований позволяют говорить о возможности использования ЭПС S. thermophilus в качестве профилактического иммуностимулятора для коррекции цитокинового статуса животных.
Журн. микробиол., 2018, № 1, С. 67-71
Ключевые слова: экзополисахариды, цитокины, фагоцитоз, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis В-1662
G.Т.Utyadova, EA.Goreltiikova, N.A.Fokina, A.S.Dolmashkina, L.V.Karpunina
EFFECT OF EXOPOLISACCHARIDES OF LACTIC ACID BACTERIA ON THE SYNTHESIS OF PROINFLAMMATORY CYTOKINES BY MACROPHAGIC MICE IN PHAGOCYTOSIS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Vavilov State Agrarian University, Saratov, Russia
Aim. Study of the effect ofexopolysaccharides (EPS) of lactic acid cocci on cytokine activity of macrophages of mice with phagocytosis in vitro Staphylococcus aureus 209-P. Materials and methods. The EPS of Streptococcus thermophilus and Lactococcus lactis B-1662 was used in the work. At 1,3, 5 and 7, AMP and PMP were isolated and the phagocytosis process was modeled in vitro. After 30 minutes, 1, 6 and 24 hours, the content of pro-inflammatory cytokines IL-1 a and TNF-a was determined. Results. EPSs had an ambiguous effect on the production of cytokines. The greatest effect on the synthesis was provided by EPS of S. thermophilus. Conclusion. The results of the study allow us to talk about the possibility of using EPS of S. thermophilus as a preventive immunomodulator for correction of the cytokine status of animals.
