CC BY
338
DOI: 10.23868/202011004
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ГРАФЕНА С КЛЕТКАМИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
П.В. Храмцов, М.Б. Раев, В.П. Тимганова, М.С. Бочкова, С.А. Заморина
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН — филиал Пермского федерального исследовательского центра УрО РАН, Пермь, Россия
INTERACTION OF GRAPHENE OXIDE NANOPARTICLES WITH CELLS OF THE IMMUNE SYSTEM
P.V. Khramtsov, M.B. Rayev, V.P. Timganova, M.S. Bochkova, S.A. Zamorina
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, UB of the RAS — Branch of the Perm State Research Cente, UB of the RAS, Perm, Russia
e-mail: mantissa7@mail.ru
Поступила: 26.12.2019 Принята к печати: 05.09.2020 Опубликована on-line: 15.12.2020
Препараты на основе графена являются одними из перспективных материалов в биомедицине. Целью обзора являлся анализ данных о взаимодействии наночастиц оксида графена с разными типами клеток иммунной системы: нейтро-филами, моноцитами, макрофагами, дендритными клетками, Т- и B-лимфоцитами, NK- и iNKT-клетками. Поиск информации осуществляли в базе данных Scopus за период с 2011 по май 2020 гг. Основной вектор эффектов наночастиц оксида графена связан с активацией клеток и формированием провоспалитель-ного типа иммунных реакций. В то же время, функционализация поверхности оксида графена при помощи биосовместимых полимеров ведет к снижению цитотоксичности, а в ряде случаев и к подавлению активации клеток. Взаимодействие наночастиц оксида графена с клеточными мембранами зависит от многочисленных факторов, таких как прямые и боковые размеры, степень окисления, функционализация, количество слоев, 3D-конфигурация, а также микробиологическая чистота и пи-рогенность графена. В совокупности, эти характеристики определяют, будут ли наночастицы оксида графена стимулировать или подавлять иммунные реакции. очевидно, что эти разнонаправленные возможности наночастиц оксида графена могут быть полезны при разработке адъювантов, новых механизмов доставки лекарств и современных биосенсоров.
Ключевые слова: иммунная система, оксид графена, наночастицы, функционализация, нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, NK-клетки, iNKT-клетки.
Graphene-based preparations are the most promising materials in biomedicine. This review is aimed at analyzing data on the interaction of graphene oxide nanoparticles with different types of cells of the immune system: neutrophils, monocytes, macrophages, dendritic cells, T- and B-lymphocytes, NK and iNKT cells. Scopus publications from 2011 to May 2020 were analyzed. The primary vector of the graphene oxide nanoparticles' effects is associated with cell activation and the formation of a proinflamma-tory profile of the immune response. At the same time, the func-tionalization of the graphene oxide surface with the biocompatible polymers leads to a decrease in its cytotoxicity, and in some cases, to suppression of cell activation. The interaction of graphene oxide nanoparticles with cells depends on numerous factors, such as direct and lateral sizes, oxidation state, functionalization, number of layers, 3D configuration, as well as the microbiological purity and pyrogenicity of graphene. Together, these characteristics determine whether graphene oxide nanoparticles must stimulate or suppress the immune system. These multidirectional possibilities of graphene oxide can be useful in the development of adjuvants, new drug delivery mechanisms, and modern biosensors.
Keywords: immune system, graphene oxide, nanoparticles, functionalization, neutrophils, macrophages, dendritic cells, T lymphocytes, B lymphocytes, NK cells, iNKT cells.
Введение
Графен — легкий двумерный материал из одноатомного слоя углерода. Это самый тонкий и прочный материал, известный человеку; кроме того, он биологически разлагаемый и не представляет угрозы для окружающей среды. В 2010 г. за его открытие А. Гейм и К. Новоселов получили Нобелевскую премию. Благодаря своим уникальным свойствам его начали применять во многих отраслях науки, в том числе и в биомедицине [1, 2]. В биологических и медицинских исследованиях используют преимущественно окисленные формы графена, а именно оксид графена (ОГ). ОГ обладает практически теми же физико-химическими свойствами, как и графен, но у него есть ряд преимуществ. Так, ОГ гидрофилен имеет хорошую коллоидную стабильность, на его поверхности присутствуют карбоксильные группы, облегчающие модификацию его поверхности биосовместимыми полимерами. Помимо этого, наличие эпокси- и гидрок-сильных групп, а также гидрофобных участков позволяет производить сорбцию полимеров, белков, лекарственных средств за счет гидрофобных и водородных связей [3, 4].
Постоянно растущий спектр потенциально возможных показаний для применения препаратов и изделий на основе графена в диагностике и лечении требует
всесторонней оценки его биосовместимости. Известно, что взаимодействие препаратов на основе графена с клетками живых организмов зачастую приводит к изменению их активности, либо гибели [5, 6]. На сегодняшний день показано, что графен и его производные, в том числе ОГ, инициируют клеточную гибель посредством апоптоза, некроза или аутофагии [7]. В то же время, именно клетки иммунной системы являются первой линией контакта с наноматериалами, и они ответственны за возникновение возможных побочных реакций. Учитывая тот факт, что применение препаратов на основе ОГ (адъювантов, антибактериальных и противоопухолевых препаратов) предполагает модулирование функциональной активности клеток иммунной системы, необходим анализ текущей информации о взаимодействии ОГ с клетками иммунной системы.
Графен и иммунная система
Цитотоксичность и провоспалительные эффекты ОГ являются факторами, которые ограничивают применение препаратов на его основе в биомедицине и сдерживают трансляцию научных разработок в практику. Цитотоксические эффекты ОГ продемонстрированы
в отношении клеток иммунной системы, в частности, макрофагов и лимфоцитов [8, 9]. Направленность взаимодействия наноматериалов с клетками иммунной системы определяется такими параметрами, как прямой и латеральный размер наночастиц ОГ, их 30-конфигурация и концентрация [10], следовательно, манипулируя этими характеристиками, можно существенно снизить цитотоксичность наночастиц ОГ.
Поверхностная модификация (функционализация) наночастиц ОГ при помощи адсорбции полимера на частицах также является одним из способов снижения негативных эффектов графена на клетки. Это объясняется экранирующим действием сорбированного полимера, снижающим или полностью нейтрализующим способность интактных частиц графена к неспецифическому взаимодействию с клеточными мембранами. При этом полимерное покрытие поверхности частиц позволяет ковалентно присоединить широкий спектр биологических молекул, способных к специфическим реакциям (антитела, ферменты и др.), тем самым придавая частицам ОГ новые функции — направленное взаимодействие с соответствующими мишенями.
В качестве покрытий для наночастиц используют поли-этиленгликоль (ПЭГ), полилактат, полиакрилат, хитозан, желатин, полиэтиленамин (ПЭА), полиакриловую кислоту (ПАК) и др. [11, 12]. В многочисленных исследованиях было показано достоверное снижение цитотоксических и провоспалительных эффектов графена и его производных на клетки, в том числе иммунные, при функционали-зации их биосовместимыми полимерами [6, 13, 14].
Однако, даже функционализация полностью не снимает проблем цитотоксичности ОГ: известно о способности ПЭГ-модифицированного ОГ стимулировать выработку макрофагами провоспалительных цитоки-нов [15] и синтез антител класса М (1дМ) против ПЭГ-модифицированного ОГ [1 6]. В целом, это свидетельствует о том, что поверхность ПЭГ-модифицированного ОГ, возможно, не инертна. Тем не менее, именно ПЭГ является самым популярным материалом для функцио-нализации наночастиц ОГ.
Нами обобщены имеющиеся данные о воздействии ОГ на различные типы иммунокомпетентных клеток. В таблице представлена структурированная информация о взаимодействии ОГ с клетками иммунной системы и дана характеристика используемых наночастиц. В подавляющем большинстве случаев исследованы эффекты не модифицированного ОГ, поэтому, если не указана поверхностная модификация, то речь идет именно о нем.
Взаимодействие ОГ с нейтрофилами
Нейтрофилы в ходе воспалительной реакции первыми мигрируют из кровотока в очаг воспаления и продуцируют ряд веществ с антимикробной активностью, в том числе активные формы кислорода (АФК). В ряде исследований было продемонстрировано, что АФК, продуцируемые ней-трофилами, могут способствовать разрушению оксида графена, попавшего в организм [17, 18]. Нейтрофилы — наиболее многочисленные лейкоциты кровотока, поэтому важно понимать, как ОГ воздействует на них. Тем не менее, такой информации крайне мало. В частности, известно, что не модифицированный ОГ оказывает цитотоксиче-ское действие и способствует инициации кислородного взрыва в нейтрофилах человека [19]. Продукция АФК в итоге приводит к апоптозу нейтрофилов, что является одним из проявлений цитотоксичности графена [19]. В своей работе Б.Р. МикИепее с соавт. (2018) показали
нарушение целостности мембраны нейтрофилов и связанную с этим усиленную продукцию АФК, а также образование внеклеточных нейтрофильных ловушек (ВНЛ), причем интенсивность этих процессов напрямую зависела от размера пластин графена [20].
Во всех перечисленных работах был исследован эффект ОГ с не модифицированной поверхностью. Однако очевидно, что весьма важным является изучение поглощения нейтрофилами модифицированного полимерами ОГ, поскольку темпы биодеградации покрытого полимером ОГ могут быть существенно ниже по сравнению с не модифицированным ОГ [21]. Меньшая интенсивность продукции АФК и ВНЛ под воздействием покрытого полимерами ОГ может снизить темпы его деградации в организме и увеличить длительность клиренса. Таким образом, активирующее влияние ОГ на нейтрофилы in vivo может отрицательно сказаться на врожденном иммунитете. С другой стороны, стимуляция защитного потенциала этих клеток наноматериалами весьма перспективна в терапии ряда патологических состояний, связанных со сниженным фагоцитозом.
Взаимодействие ОГ с моноцитами
Моноциты — предшественники макрофагов и дендритных клеток, они играют важную роль в регуляции как врожденного, так и приобретенного иммунитета. На данный момент сведений о роли графена в регуляции их функций крайне мало. В 2017 г. было показано, что ОГ снижал жизнеспособность клеток линии острого моноцитарного лейкоза человека THP-1 , при этом функционализация частиц ОГ аминогруппой (ОГ-1\1Н2) существенно уменьшала цитотоксичность графена [22]. Наночастицы ОГ индуцировали синтез антиоксидант-ных ферментов и воспалительных факторов, тогда как скорость поглощения клетками наночастиц восстановленного ОГ была более высокой и способствовала повышению уровня провоспалительного транскрипционного фактора NF-kB. Различия в механизмах токсичности авторы объясняют степенью окисления ОГ, которая, в свою очередь, определяет различия в сродстве нано-частиц к клеточной мембране [22]. Помимо этого, было продемонстрировано повышение уровня внутриклеточных цитокинов (TNF-a, MIP-1 р, IL-6), ассоциированных с воспалением и Th1-ответом, под воздействием как не модифицированного ОГ, так и функционализирован-ного аминогруппой ОГ (ОГ-\Н2) [10]. В 2020 г. появились данные о том, что ОГ с нанесенными кристаллами AgInS2 (ОГ-In) повышал уровень TNF-a и MIP-1 р в канонических моноцитах периферической крови человека [23].
Взаимодействие ОГ с макрофагами
Макрофаги являются наиболее востребованной моделью при исследовании взаимодействия графена и его производных с иммунной системой млекопитающих. Наночастицы графена и ОГ взаимодействуют с макрофагами различными путями. В частности, доказана роль TLR-рецепторов (TLR 4, 9) в распознавании графена этими клетками и связанная с этим продукция провоспалительных цитокинов [24, 25]. ОГ способен также вызывать некроз макрофагов, который был идентифицирован как TLR4-зависимый [7]. Помимо некроза, было продемонстрировано, что ОГ способствовал аутофагии макрофагов линии RAW 264.7, причем аналогичный эффект оказывали и его производные: додециламин-ОГ, восстановленный ОГ и додецилсуль-фат натрия-восстановленный ОГ [6].
M.C. Duch с соавт. (2011) показали, что ОГ индуцировал продукцию АФК в мышиных альвеолярных макрофагах [26]. Была продемонстрирована стимуляция наночастицами графена продукции иммуноком-петентными клетками цитокинов, ассоциированных с Th^-поляризацией иммунного ответа (IL-5, IL-13), в экспериментальной модели у мышей [27]. Также было обнаружено цитотоксическое влияние наночастиц графена на макрофаги, которое зависело от размера частиц: у частиц меньшего размера (в пределах от 200 нм и менее) цитотоксичность была выше, по сравнению с более крупными частицами (сотни нм — несколько микрометров) [28]. В то же время, согласно данным, опубликованным в обзоре I. Dudek с соавт. (2016), крупные наночастицы (нанопластины) графена в большей степени индуцировали провос-палительный ответ в макрофагах, по сравнению с более мелкими, которые вызывали апоптоз [9]. Это согласуется с исследованием M. Feito с соавт. (2014), где было показано, что продукция TNF-a повышалась под влиянием ОГ-ПЭГ размером 300 нм, в то время как более мелкие (100 нм) ОГ-ПЭГ не изменяли уровень этого цитокина. В этой же работе было выявлено, что жизнеспособность макрофагов после 24 ч. экспозиции с ОГ-ПЭГ составляла 80-90% [29]. В статье R. Diez-Orejas с соавт. (2018) приведены данные, демонстрирующие, что ОГ-ПЭГ усиливал фагоцитоз убитых Candida albicans макрофагами [30], при этом важно помнить, что одновременно клетки интернализируют собственно наночастицы ОГ, и это может затруднять интерпретацию полученных данных в отношении фагоцитоза.
Как уже было сказано, различная функционализация наночастиц может привести к минимизации цитотоксиче-ских эффектов графена. Функционализированный поли-винилпирролидоном (ПВП) ОГ имел менее выраженную цитотоксичность по сравнению с нативным графеном и хуже фагоцитировался макрофагами [31].
Следует отметить, что при очевидной взаимосвязи между размерами наночастиц ОГ и его цитотоксичностью, боковой (латеральный) размер не влияет на интернализа-цию наночастиц ОГ. При изучении поглощения ОГ с двумя разными размерами (89 нм и 277 нм) макрофагами клеточной линии J774.2 и клетками HeLa было установлено, что оба варианта ОГ были одинаково интернализованы, независимо от времени инкубации. тем не менее, нано-частицы большего размера (277 нм) были более токсичными для обеих клеточных линий [32]. Группа H. Yue с соавт. (2012) оценивала интернализацию и токсичность наночастиц ОГ с размерами 2 мкм и 350 нм на клеточных линиях мышиных макрофагов J774.1A1 и перитонеаль-ных макрофагах PM0. Было установлено, что наночастицы ОГ обоих размеров интернализировались одинаково, однако, частицы размером 2 мкм индуцировали выраженные реакции воспаления [33]. Позже было выявлено, что меньшие боковые размеры ОГ способствовали более активной интернализации и вызывали более сильное изменение физиологических функций первичных макрофагов человека и мыши [34].
Известно, что макрофаги способны дифференцироваться в провоспалительный фенотип М1, и в так называемый «репаративный» фенотип М2. При изучении влияния функционализированных наночастиц ОГ (ПЭГ+ФИТЦ) на поляризацию перитонеальных макрофагов мышей было показано, что ОГ не индуцировал поляризацию макрофагов в фенотип M1 , но стабилизировал баланс соотношения M1/M2 с небольшим сдвигом в сторону M2-макрофагов, участвующих в восстановлении тканей [35].
В 2018 г. K. Lategan с соавт. исследовали влияние наночастиц ОГ (не модифицированных] на клетки иммунной системы человека и на клеточную линию мышиных макрофагов RAW 264.7 [36]. Особенностью работы было изучение влияния ОГ на клеточные культуры цельной крови. Был проведен мониторинг ряда параметров, таких как цитотоксичность, воспалительные биомаркеры, цитокины и анализ протеомного профиля. В результате было показано, что наночастицы ОГ были цитотоксичны как для культур цельной крови, так и для макрофагов RAW 264.7 в концентрации 500 мкг/мл. Наночастицы ОГ дозозависимо ингибировали LPS-индуцированный синтез IL-6 и PHA-индуцированный синтез IFN-y в клетках культур цельной крови, однако в отсутствии митогенов наночастицы ОГ стимулировали синтез IL-10 в клетках культур цельной крови [36]. Можно предполагать, что в данном случае под воздействием наночастиц ОГ происходит смещение баланса в сторону М2-макрофагов. В этой же работе было обнаружено, что наночастицы ОГ в отсутствии LPS способствовали формированию воспалительного профиля на уровне протеома в клетках мышиных макрофагов, клеточной линии RAW 264.7 и культур цельной крови человека [36].
При изучении влияния ОГ на цитокиновый профиль макрофагов человека, полученных из моноцитов, было выявлено, что немодифицированные наночастицы подавляли LPS-стимулированную продукцию хемокинов и цито-кинов, включая IL-10 [37]. В то же время, ОГ индуцировал каспаза-зависимый синтез IL-ip в LPS-стимулированных макрофагах. Для интерпретации полученных эффектов авторы использовали несколько типов клеток линии THP-1 (моноциты человека], нокаутных по внутриклеточному рецептору NLRP3, белку-адаптеру ASC и каспазе-1, и показали, что в ОГ-зависимую индукцию IL-1 в вовлекаются все вышеперечисленные белки. Результаты экспериментов позволили сделать вывод о способности ОГ инициировать активацию NLRP3-инфламмасом. Эти исследования в очередной раз продемонстрировали, что активация воспаления не зависит от латеральных размеров наночастиц ОГ [37]. При изучении влияния нано-частиц ОГ, функционализированных армированным ПЭГ, было доказано, что ОГ-6 arm-ПЭГ индуцировал продукцию TNF-a (но не IL-6 и IL-1 р] макрофагами клеточной линии RAW 264.7, при этом была обнаружена внутриклеточная локализация ОГ на F-актиновых филаментах [29].
На основании анализа имеющихся работ можно заключить, что в ряде исследований получены противоречивые данные о влиянии ОГ на функциональную активность и жизнеспособность макрофагов: самостоятельный эффект наночастиц ОГ заключается в активации воспалительного ответа, но в условиях предсуществующей активации ОГ может оказывать и супрессивные эффекты.
Взаимодействие ОГ с дендритными клетками
По данным обзора M. Oreccionni с соавт. (2014] из всех работ, в которых изучали взаимодействие гра-фена с клетками иммунной системой, всего 7% статей посвящено моноцитам и дендритным клеткам (ДК) [38].
Известно, что ДК моноцитарного происхождения, которые являются основным объектом исследования этих клеток in vitro, секретируют высокие уровни рецепторов TLR2 и TLR4, но не рецептора TLR9. Взаимодействие этих рецепторов с лигандами приводит к секреции ряда провоспалительных цитокинов: IFN-y, IL-1 р, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-a и др., а также к экспрессии поверхностных молекул, участвующих в презентации антигенов CD80, CD86, CD83 [39]. Наночастицы ОГ вызывают
усиление продукции IL-ip, IL-6, TNF-a, а также стимуляцию экспрессии молекул, необходимых для презентации антигенов (CD40 и CD86) ДК [31]. В той же статье было отмечено, что модификация поверхности графена ПВП приводила к снижению продукции вышеперечисленных цитокинов [31]. Инкубация ДК костного мозга мышей с конъюгатом ОГ-овальбумин вызывала активацию их антигенпрезентирующих функций, а также продукции IFN-y, цитокина, поляризующего иммунный ответ в сторону Thl-типа [33]. Использование наночастиц ОГ-овальбумин в качестве носителя антигена было эффективно за счет интернализации этого комплекса ДК и последующего высвобождения антигенов с дальнейшей их презентацией на поверхности клеток, что приводило к эффективной регрессии опухоли in vivo [33].
В тоже время, не функционализированные наноча-стицы графена (в виде квантовых графеновых точек, GQD), размером 23-66 нм, оказывали противоположное действие на ДК: подавляли экспрессию CD86, HLA-DR, стимулировали синтез цитокинов Th^-типа (IL-4 и IL-10), но подавляли синтез IFN-y. Одновременно GQD угнетал продукцию АФК и транслокацию NF-kB в ДК человека, а также индуцировал аутофагию в этих клетках [40]. Возможно, противоположные эффекты связаны с различными размерами наночастиц, использованными в этих работах, а также с наличием овальбумина на поверхности ОГ в первом случае [33].
При сравнении воздействия ОГ, С60-фуллерена и С60-Тпэ-фуллерена на антигенпрезентирующую функцию ДК выяснилось, что все три типа наночастиц эффективно поглощались клетками, однако только ОГ подавлял презентацию антигена Т-лимфоцитам [41]. Причина заключалась в том, что под действием ОГ снижался уровень белка LMP7, ответственного в составе иммунопротеасомы за обработку антигенов в ДК. При помощи молекулярного моделирования было показано, что ОГ связывается с белком LMP7 за счет сильного электростатического взаимодействия [41]. Эксперименты L. Xu с соавт. (2016) продемонстрировали усиление поглощения модельного антигена и синтеза TLR-2 и -4 в ДК, примированных ОГ, модифицированным одновременно пЭг и ПЭА [42].
В 2017 г. было показано, что в присутствии ОГ снижалась жизнеспособность ДК, а функционализация частиц ОГ аминогруппой способствовала уменьшению его цитотоксичности. Кроме этого, под воздействием ОГ и функционализированного ОГ, повышался уровень внутриклеточных цитокинов (TNF-a, MIP-1 р, IL-6), ассоциированных с воспалением, что аналогично ситуации с моноцитами [10].
Одно из важнейших применений графена — его использование в качестве нано-адъюванта. Подобные адъюванты могут значительно усилить иммуногенность антигенов, тем самым помогая в лечении инфекционных заболеваний, в основном путем клеточного поглощения антигенов и(или) позитивной активации ДК. Известно, что ОГ-ПЭГ и ОГ-ПЭА стимулировали созревание ДК и продукцию ими цитокинов [42].
В 2014 г. W. Wang с соавт. исследовали формирование иммунного ответа на клетки глиомы in vitro при помощи ОГ-активированных ДК [43]. В качестве антигена применяли активный фрагмент сурвивина (пептид ELTLGEFLKL), сорбированный на наночастицах ОГ (ОГ-АГ). В эксперименте изучали реакцию ДК на клетки линии глиомы T98G: ДК прединкубировали отдельно с ОГ, АГ и с конъюгатом ОГ-АГ и установили, что обработанные ОГ-АГ ДК демонстрировали более высокий уровень противоопухолевого ответа по сравнению с ОГ и АГ [43].
Важно отметить, что при контакте любых наночастиц с клетками моноцитарно-макрофагального ряда мы, в первую очередь, сталкиваемся с поглощением (интер-нализацией) наночастиц, так как эти клетки способны к фагоцитозу. ОГ не может полностью фагоцитироваться моноцитарными клетками человека, и это явление назвали «фрустированный фагоцитоз» [19]. Более того, ОГ может в ряде случаев не поглощаться клетками (клеточная линия A549), но вызывать окислительный стресс и дозозависимую цитотоксичность [28]. Помимо этого было доказано, что наночастицы графена диаметром около 15 мкм не фагоцитировались клетками моноцитарной линии THP-1 [44]. Однако, ОГ размером 500 нм мог быть интернализирован клатрин-опосредо-ванным эндоцитозом, тогда как ОГ большего размера (1 мкм) фагоцитировались клетками в экспериментах на клеточной линии мышей C2C12 [45]. Следует подчеркнуть, что уровень поглощения наночастиц ОГ был выше в клеточной линии HeLa, чем в моноцитах. Этот эффект может представлять интерес, поскольку ОГ способен более активно проникать в раковые клетки HeLa по сравнению с незлокачественными клетками [19].
Несмотря на сообщения о клеточном поглощении наночастиц графена, углеродных нанотрубок и фулле-ренов, механизм клеточного поглощения для фагоцитирующих, не фагоцитирующих, раковых или нормальных клеток остается непонятным.
Помимо интернализации наночастиц, существует также специфическое взаимодействие плоских листов ОГ с клетками, связанное с параллельным расположением их на мембране. Фактически, обнаружен «эффект маски», который может либо способствовать интернали-зации наночастиц, либо создавать механический барьер между клеткой и окружающей средой [34].
Таким образом, очевидно, что в настоящий момент данные о влиянии ОГ на ДК весьма противоречивы, тем не менее, именно ДК, по-видимому, являются перспективными для усиления противоопухолевого ответа при помощи функционализированного соответствующим антигеном ОГ.
Взаимодействие ОГ с Т-лимфоцитами
Известно, что ДК участвуют в формировании иммунного ответа на уровне лимфоцитов. При изучении антигензависимой дифференцировки наивных CD4+ Т-лимфоцитов, при активации их дендритными клетками, предварительно инкубированными с ОГ, было показано снижение продукции IL-2 лимфоцитами, а также подавление синтеза в ДК белка LMP7, участвующего в процессинге антигена. Одновременно, экспозиция ОГ приводила к увеличению количества молекул MHC I и II на поверхности ДК, как уже было сказано выше [41].
Иммунизация мышей конъюгатом модифицированного карнозином ОГ и овальбумина стимулировала активацию и пролиферацию CD4+- и CD8+-Т-лимфоцитов ex vivo [46]. Присутствие карнозина на поверхности наночастиц ОГ также, вероятно, способствует усилению антигенспе-цифического адаптивного иммунного ответа посредством модуляции секреции некоторых цитокинов, включая IL-6, CXCL1, CCL2 и CSF3 [46]. В то же время имеются данные о дозозависимом подавлении наночастицами ОГ пролиферации Т-лимфоцитов [19]. Относительно недавно появились сведения о влиянии ОГ и аминированного ОГ (ОГ-NH2) на разные популяции клеток иммунной системы, полученные при помощи инновационного интегративного подхода, использующего одновременный анализ транс-криптома клетки с «single-cell» масс-цитометрией. Было
продемонстрировано, что ОГ снижал жизнеспособность активированных т-хелперов в большей степени, чем ОГ-NHg [10]. В свою очередь, наночастицы ОГ-NHg активировали в т-клетках и моноцитах, соответственно, гены хемокинов, ассоциированных с Th1-ответом, (CXCL10, CCL3, CCL3L3, CCL4L1, CCL4L2 и CCL5) и гены провос-палительных цитокинов (TNF-a и IL-1 в). Помимо этого, ОГ-NHg индуцировал экспрессию генов транскрипицион-ных факторов IRF1 и STAT1, обеспечивающих взаимодействие между врожденным и приобретенным иммунитетом. Авторы подтверждают гипотезу о том, что ОГ поляризует т-клетки и моноциты в провоспалительные фенотипы Th1/M1, при этом наличие аминогрупп нивелирует про-воспалительный эффект ОГ и повышает его биосовместимость [10]. Наряду с этим, для препаратов ОГ были получены и противоположные результаты: модифицированные гамма-излучением наночастицы ОГ (в виде квантовых точек, GQD) опосредовано через ДК стимулировали выработку цитокинов Th2-типа, а также способствовали поляризации CD4+-Т-лимфоцитов в направлении Т-регуляторных лимфоцитов (Treg), ответственных за формирование иммунной толерантности [40].
Как и ожидалось, при функционализации ОГ целевыми молекулами, такими, как антитела к рецептору интер-лейкина-10 PNL-10R) или специфическому пептиду, наночастицы успешно модулировали иммунный ответ. Антитела, «пришитые» к наночастицам ОГ, медленно высвобождались и оставались биологически активными как in vitro, так и in vivo, при этом свободные анти-IL10R-антитела были менее эффективными. Было показано, что наночастицы 0Г-IL-10R специфически усиливали Т-клеточный ответ после активации, что обусловлено свойствами IL-10, который секретируется клетками иммунной системы для ослабления и контроля иммунного ответа [47]. В работе M. Zhang с соавт. (2013) было установлено, что токсичность пептида Vpr13-33 (фрагмент регуляторного белка ВИЧ) заметно снижалась в присутствии ОГ в Т-клетках из-за преимущественной адсорбции пептида и его конформационного изменения [48]. Известно также, что ОГ нивелировал стимулирующий эффект a-GalCer на секрецию внутриклеточных цитокинов IFN-y, TNF-a в уб T-лимфоцитах в экспериментах in vivo на мышах [49]. Важно отметить, что на сегодняшний день отсутствуют сведения о прямом влиянии наночастиц ОГ на регуляторные субпопуляции Т-лимфоцитов (Treg, Th17), как и на Т-клетки иммунной памяти.
Взаимодействие ОГ с В-лимфоцитами
ОГ в относительно высокой концентрации (50 мкг/мл) снижал жизнеспособность плазмоцитов, при этом механизм клеточной гибели индуцировался через продукцию АФК, но без вовлечения молекул TLR4 [50]. В то же время, ОГ в более низкой концентрации (20 мкг/мл) стимулировал синтез Fas и CD69 и подавлял экспрессию молекул CD40, CD80, CD86, MHCI на поверхности В-клеток мыши. Помимо этого, ОГ приводил к повышению экспрессии не классической антигенпрезентирующей молекулы (CD1d) В-клетками. При воздействии ОГ на терминально-дифференцированные Ig-секретирующие плазматические клетки снижалась секреция Ig и наблюдался выраженный ER (endoplasmatic reticulum)-стресс, вызванный накоплением секретируемой формы Ig в клетке. Авторы делают вывод о том, что ОГ оказывает супрессивное воздействие на В-клетки и гуморальный иммунитет [50]. Это предположение подтверждается в работе, где ОГ снижал жизнеспособность B-клеток, плазматических клеток и B-клеток памяти [10]. В экспериментах на первичной
культуре спленоцитов мышей было показано, что нано-частицы ОР^т-ПЭГ и ОГ^нт-ПЭГ не оказывали прямого эффекта на спонтанную пролиферацию клеток, однако в присутствии активаторов (LPS, ConA и анти-CD3) наночастицы ОГ-ПЭГ отменяли стимулирующий эффект активаторов на пролиферацию клеток. Таким образом, наночастицы ОГ-ПЭГ способны снижать пролиферацию иммунных клеток, Т- и В-лимфоцитов в присутствии специфических стимулов [29]. Для получения большего объема информации о провоспалительном ответе иммунной системы мышей, в супернатантах культур спле-ноцитов мыши оценивали уровень провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-1 в и TNF-a). Активаторы LPS, ConA и анти-CD3 существенно стимулировали продукцию IL-6, но в присутствии наночастиц ОР^т-ПЭГ и ОГ^ит-ПЭГ этот эффект не наблюдался. В отношении продукции IL-1 в и TNF-a подобных эффектов зафиксировано не было [29]. В целом, наночастицы ОГ, покрытые армированным ПЭГ, способны оказывать противовоспалительное действие на клетки иммунной системы.
В 2020 г. при помощи метода «single-cell» масс-цитометрии было показано, что ОГ с нанесенными кристаллами AgInS2 (ОГ-In) взаимодействовал с В-клетками человека, не влияя на жизнеспособность этих клеток. При анализе субпопуляций оказалось, что ОГ-In взаимодействовал c наивными В-клетками, В-клетками памяти и плазмоцитами, повышая экспрессию CD25 на поверхности этих клеток. В ходе исследования цитокинового профиля было обнаружено, что ОГ-In повышал внутриклеточный уровень MIP-1 в (CCL4, аттрактант для Т-хелперов) в наивных В-клетках и В-клетках памяти [23].
На сегодняший день мы не обладаем исчерпывающими сведениями о влиянии ОГ на В-клетки человека. Тем не менее, опубликованы весьма перспективные работы, касающиеся применения ОГ, функционализированного ритуксимабом (РМ). Было показано, что ОГ-РМ обладает высокой авидностью к CD20 (маркер В-клеток), а связывание ОГ-РМ с CD20-позитивными клетками лимфомы вызывает кэппирование CD20 и гибель клеток-мишеней через актин-зависимый механизм. В экспериментах in vivo, ОГ-РМ, в отличие от использования только РМ, эффективно уничтожал лимфомы высокой степени злокачественности на модели ксенотрансплан-тата у мышей [51]. Таким образом, ОГ, функционализиро-ванный антителами, может быть эффективен в качестве цитотоксической терапии злокачественных опухолей В-клеток человека в отсутствии химиотерапии.
Взаимодействие ОГ с NK- и -iNKT-клетками
Известно, что как ОГ, так и ОГ-NHg вызывают минимальную цитотоксичность в NK-клетках человека. Тем не менее, методом «single-cell» масс-цитометрии было показано, что ОГ-NHg индуцирует повышение уровня TNF-a в NK-клетках [10].
В 2018 г. было проведено исследование, в котором наночастицы ОГ использовали в качестве матрицы для получения наноразмерных кластеров, активирующих NK-клетки [52]. Кластеры (размер 50-300 нм) состояли из наночастицы ОГ, к которой при помощи авидина-стрептавидина были «пришиты» антитела к CD1 6, фиксированные на ПЭГ. Было установлено что эти нанокла-стеры, используемые для стимуляции NK-клеток через CD16-рецептор, успешно индуцировали клеточную активацию, дегрануляцию цитолитических гранул и секрецию IFN-y. Важно отметить, что активация клеток с помощью нанокластера значительно превышала таковую, вызванную антителами к CD16. Авторы предполагают, что
в будущем иммунотерапия может осуществляться с применением подобных нанокластеров [52].
iNKT-клетки (Т-клетки с функциями натуральных киллеров] способны оказывать как активизирующее, так и угнетающее действие на иммунный ответ посредством стимуляции секреции цитокинов клетками Th1 и Th2 и, следовательно, могут рассматриваться в качестве эффекторов для различных видов клеточной терапии [53]. При изучении влияния ОГ на воспалительные реакции, опосредованные а-галактозилцерамидом (а-GalCer], агонистом iNKT-клеток, было показано, что in vivo ОГ существенно ингибирует способность а-GalCer индуцировать опосредованную iNKT активацию и продукцию цитокинов клетками иммунной системы (макрофагами, NK-клетками и уб T-клетками). Важно отметить, что эффекты ОГ в этих экспериментах коррелировали с поляризацией iNKT-клеток в направлении продукции TGF-p, что также объясняет способность ОГ расширять пул Treg. Эти же авторы на модели сепсиса у мышей, вызванного а-GalCer, продемонстрировали, что применение нано-частиц ОГ достоверно защищает мышей от летального исхода. таким образом, наночастицы ОГ в перспективе могут использоваться в качестве адъюванта для модуляции ответов клеток iNKT при иммунотерапии [53].
В 2019 г. был создан и протестирован препарат, состоящий из наночастиц восстановленного ОГ, функционали-зированных ингибитором индоламин-2,3-диоксигеназы (ОГ-iIDO) [54]. Эксперименты in vivo продемонстрировали, что противоопухолевый иммунный ответ может синерги-чески стимулироваться путем ингибирования IDO этими наночастицами в составе комплексной терапии, включающей в себя блокаду PD-L1 и фототермальную терапию. В результате такой терапии наблюдалось увеличение инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, включая CD45+-лейкоциты, повышение уровня CD4+ и CD8+ T-клеток и NK-клеток; суммарное увеличение уровня INF-y, а также ингибирование иммуносупрессорной активности Treg. Данная работа показала что, наночастицы ОГ, функ-ционализированные ингибитором IDO, при сочетании
с фототермальной терапией могут эффективно ингиби-ровать рост опухолевых клеток [54]. Очевидно, что это открывает новые перспективы для применения ОГ.
В 2020 г. было установлено, что иммунный ответ in vivo на ОГ-ПЭГ при внутрибрюшинном введении его мышам зависит от временных интервалов введения и дозы наночастиц [55]. В частности, иммунный ответ может быть значительно усилен после однократного введения высокой дозы ОГ-ПЭГ, что свидетельствует о возможности использования ОГ-ПЭГ в качестве адъюванта. В то же время, при многократных инъекциях в низких дозах иммунный ответ был мягким, временным и слабо выраженным, что объясняется, по-видимому, биосовместимостью ОГ-ПЭГ с клетками иммунной системы [55].
Возвращаясь к результатам, полученным при помощи «single-cell» масс-цитометрии, можно сделать вывод, что ОГ индуцирует цитотоксичность во всех субпопуляциях B-клеток. Функционализированный ОГ-NHg является менее цитотоксичным по отношению к клеткам иммунной системы, в частности, на уровне В-клеток. В целом, функционализация ОГ усиливает его биосовместимость с клетками иммунной системы, за исключением NK-клеток и цитотоксических лимфоцитов, в которых ОГ-NHg индуцировал минимальную цитотоксичность [10]. Эти данные подчеркивают важность функцио-нализации в повышении биосовместимости наноматери-алов на основе ОГ, а также необходимость учитывать тип таргетных клеток при постановке экспериментов.
Таким образом, ОГ может активировать определенные иммунные клетки, но одновременно подавлять другие, и это взаимодействие зависит от многочисленных переменных, таких как боковые размеры, степень окисления, функционализация, количество слоев и степень чистоты (пирогенности) графена. В совокупности, эти характеристики определяют, будет ли ОГ стимулировать, или подавлять иммунную систему. Очевидно, что эти разнонаправленные возможности ОГ могут быть очень полезны при разработке адъювантов, новых механизмов доставки лекарств и современных биосенсоров.
Таблица. Взаимодействие наночастиц оксида графена с клетками иммунной системы
Эффект Характеристика наночастиц ОГ Источник
Нейтрофилы
ОГ повреждался под воздействием АФК нейтрофилов ОГ, размер 1-2 нм, 20 нм, монослойный, [17]
бислойный
ОГ повреждался под воздействием АФК нейтрофилов ОГ-поли-1_-лизин, размер 100 нм и 10 мкм, [18]
без эндотоксина
ОГ инициировал кислородный взрыв в нейтрофилах человека, ОГ, размер ~1 мкм, толщина 1-2 нм, [19]
цитотоксичен для клеток монослой; концентрации 1; 12; 25 мкг/мл
ОГ повреждал мембраны нейтрофилов, индуцировал ОГ ~0,1 мкм и ~15 мкм, двуслойный, [20]
продукцию АФК и образование ВНЛ толщина 1-2 нм; концентрации 6,25; 12,5;
25 мкг/мл, без эндотоксина
Моноциты
ОГ снижал жизнеспособность моноцитов человека ОГ, размер 50-300 нм и 10-40 мкм, без [22]
эндотоксина; концентрация 50 мкг/мл
ОГ индуцировал экспрессию антиоксидантных ферментов ОГ, динамический диаметр 37-56 нм, [22]
и воспалительных факторов, и повышал экспрессию толщина 1 нм.
ЫР-кВ в клетках линии ТНР-1 ОГ восстановленный, динамический
диаметр 37-56 нм, толщина 2 нм; концентрации 5 и 50 мкг/мл
Эффект Характеристика наночастиц ОГ Источник
ОГ и Or-NH2 повышали уровень внутриклеточных цитокинов (TNF-a, MIP-1 ß, IL-6) в моноцитах человека ОГ (1-3 слоя) и ОГ с пришитой аминогруппой (ОГ-\1Н2; с1 300 нм); концентрации 5; 25; 50 мкг/мл [1G]
ОГ-In повышал экспрессию TNF-a, MIP-1 ß в канонических моноцитах периферической крови человека ОГ (размер 200-300 нм) в комплексе с кристаллами Дд1пВ2 (5нм), ОГ-1п; концентрация 50 мкг/мл [2З]
Макрофаги
ОГ вызывал TLR4-зависимый некроз макрофагов ОГ и ОГ с пришитым 6-arm ПЭГ, размер 2 и 10 мкм; концентрация 100 мкг/мл [У]
ОГ привлекал макрофаги и ДК в микроокружение опухоли у мышей, эксперименты in vivo ОГ, размер ~ 450 нм, толщина менее 2 нм [24]
ОГ способствовал аутофагии макрофагов клеточной линии RAW 264.7 ОГ, гидродинамический диаметр 350 нм и 2,4 мкм, толщина 1,0-1,2 нм; концентрации 5 и 100 мкг/мл [25]
ОГ индуцировал продукцию АФК в мышиных альвеолярных макрофагах ОГ толщиной от 0,5 до 2,0 нм, более 90% нанопластин имели площадь менее 25 000 нм, 250 мкг/мышь [26]
ОГ оказывал цитотоксическое влияние на макрофаги клеточной линии A549, частицы меньшего размера были более цитотоксичными ОГ, толщина 0,9 нм, преимущественно монослой, размер 780±300, 430±300, 160± 90; концентрации 10, 25, 50, 100, 200 мкг/мл [2В]
ОГ-ПЭГ усиливал фагоцитоз Candida albicans макрофагами ОГ-ПЭГ, размер в диапазоне 200-600 нм, толщина, 10 нм. Метка ФИтЦ Ш]
ОГ-ПВП снижал фагоцитоз макрофагами этих частиц и имел менее выраженную цитотоксичность в сравнении с ОГ ОГ-ПВП (поливинилпирролидон), размер 265 нм, толщина 2,6 нм; не модифицрованный ОГ, размер 230300 нм, толщина 1,7 нм; концентрации 25, 50, 100 мкг/мл [З1]
ОГ дозозависимо ингибировал LPS-индуцированный синтез IL-6 и PHA-индуцированный синтез IFN-y в клетках культур цельной крови, но в отсутствии митогенов наночастицы ОГ стимулировали синтез IL-10 ОГ, размер 1-2 мкм; концентрации 5; 50; 500 мкг/мл [З6]
ОГ вызывал воспалительную реакцию у мышиных макрофагов (линия RAW 264.7) и в клетках культур цельной крови человека при анализе профиля протеома ОГ, размер 1-2 мкм; концентрация 15,6 (линия RAW 264.7) и 5 (цельная кровь) мкг/мл [З6]
ОГ подавлял LPS-стимулированную продукцию хемокинов и цитокинов, включая IL-10 макрофагами человека. ОГ индуцировал каспаза-зависимую экспрессию IL-1 в в LPS-стимулированных макрофагах ОГ, 1-2 слоя, толщина 1-2 нм, размер 50-300 нм и 10-40 мкм [ЗУ]
ОГ-6 arm-ПЭГ индуцировал продукцию TNF-a (но не IL-6 и IL-1 в) макрофагами клеточной линии RAW 264.7. Показана внутриклеточная локализация ОГ на F-актиновых филаментах ОГ-1 arm-ПЭГ: размер ~100 нм. ОГ-6 arm-ПЭГ: размер ~300 нм. ОГ, размер ~70 нм; концентрации 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 мкг/мл [2G]
ОГ отменял активирующий эффект a-GalCer на уровень внутриклеточных цитокинов IFN-y, TNF-a в макрофагах; эксперименты in vivo, мыши ОГ размером менее 1 мкм [5З]
Дендритные клетки
ОГ стимулировал продукцию 11_-1 р, 11_-6, Т1\1Б-а, а также экспрессию 0040 и 0086. ОГ-ПВП снижал продукцию 11_-1 р, 11_-6, ТЫБ-а, ДК человека ОГ, размер 230-300 нм, толщина 1,7 нм; ОГ-ПВП (поливинилпирролидон), размер 265 нм, толщина 2,6 нм; концентрации 25, 50, 100 мкг/мл [З1]
ОГ-овальбумин усиливал антигенпрезентирующие функции ДК костного мозга мышей, а также продукцию ими 1П\-у ОГ-овальбумин, размер 2 мкм, толщина 25 нм; концентрация 5 мкг/мл [ЗЗ]
Эффект Характеристика наночастиц ОГ Источник
ОГ подавлял экспрессию 0086, Н_Д-0П и стимулировал синтез 1_-4 и 1_-10, но подавлял продукцию !Р\1-у ДК человека. ОГ подавлял продукцию АФК и транслокацию ЫР-кВ в ДК человека. ОГ индуцировал аутофагию ДК человека (квантовые графеновые точки), овальная форма 23/65 нм, толщина 2,0 нм; концентрация 200 мкг/мл [40]
ОГ подавлял презентацию антигена т-лимфоцитам ДК, механизм связан со снижением экспрессии _МР7, входящего в состав иммунопротеасомы. ОГ повышал экспрессию молекул МНС ! и !! Не модифицированный ОГ, размер 0,5±0,35 мкм, толщина 0,6 нм, фильтрация 0,22 мкм; концентрации 1; 6,25; 25 мкг/мл [41]
ОГ-ПЭГ-ПЭА стимулировал поглощение антигена и экспрессию Т_П-2 и -4 в ДК, полученных из костного мозга мыши, не модифицированный ОГ не влиял на эти показатели Не модифицированный ОГ, размер 100 нм; ОГ-ПЭГ, размер 40 нм; ОГ-ПЭА, размер 250 нм; ОГ-ПЭГ-ПЭА, размер 40 нм, концентрации 5, 10, 40, 40 мкг/мл [42]
ОГ и ОГ-\1Н2 повышали уровень внутриклеточных цитокинов (ТЫР-а; М1Р-1Р, !_-6) в ДК человека Не модифицированный ОГ (1-3 слоя) и ОГ с пришитой аминогруппой (ОГ-ЫН2; с1 300 нм); концентрации 5; 25; 50 мкг/мл [10]
Т-лимфоциты
ОГ снижал продукцию IL-2 Т-хелперами, опосредовано ДК Не модифицированный ОГ, размер 0,5±0,35 мкм, толщина 0,6 нм, фильтрация 0,22 мкм; концентрации 1; 6,25; 25 мкг/мл [41]
ОГ-карнозин, ОГ-карнозин-альбумин стимулировали пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов ex vivo ОГ-карнозин, диаметр 18,2; 3,2; толщина 1,5 нм. [46]
ОГ дозозависимо подавлял пролиферациию Т-лимфоцитов человека Не модифицированный ОГ, размер ~1 мкм, толщина 1-2 нм, монослой; концентрации 1; 12; 25 мкг/мл [19]
ОГ снижал жизнеспособность активированных Т-хелперов. ОГ-1\1Н2 активировал в Т-клетках человека гены хемокинов (CXCL10, CCL3, CCL3L3, CCL4L1, CCL4L2 и CCL5) и индуцировал экспрессию IRF1 и STAT1 Не модифицированный ОГ (1-3 слоя) и ОГ с пришитой аминогруппой (ОГ-\1Н2; С 300 нм); концентрации 5; 25; 50 мкг/мл [10]
GQD способствовали поляризации CD4+-Т-лимфоцитов в направлении Treg Э00, овальная форма 23/65 нм, толщина 2,0 нм; концентрация 200 мкг/мл [40]
ОГ-IL-IOR специфически усиливал Т-клеточный ответ, мыши, in vivo ОГ-!_-ЮП в сравнении с ОГ были больше и агрегированы [47]
ОГ отменял активирующий эффект a-GalCer на уровень внутриклеточных цитокинов IFN-y, TNF-a в уб T-лимфоцитах; эксперименты in vivo, мыши ОГ размером менее 1 мкм [53]
В-лимфоциты
ОГ снижал жизнеспособность B-клеток, плазматических клеток и B-клеток памяти человека Не модифицированный ОГ (1-3 слоя) и ОГ с пришитой аминогруппой (ОГ-\1Н2; С 300 нм); концентрации 5; 25; 50 мкг/мл [10]
ОГ снижал жизнеспособность плазмоцитов (50 мкг/ мл), ОГ (20 мкг/мл) стимулировал экспрессию Fas и CD69 и подавлял экспрессию CD40, CD80, CD86, MHC I на В-клетках мыши (культура спленоцитов) ОГ, размер 200-500 нм, толщина 1,1 нм; концентрации 10, 20, 50 мкг/мл [49]
ОГ-1 arm-ПЭГ, ОГ-6 arm-ПЭГ угнетал пролиферацию первичных спленоцитов мыши, отменяя эффект LPS ОГ-1 агт-ПЭГ, размер ~100 нм. ОГ-6 агт-ПЭГ, размер ~300 нм. ОГ, размер ~70 нм; концентрации 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 мкг/мл [29]
ОГ-In повышал экспрессию CD25 на наивных В-клетках, В-клетках памяти и плазмоцитах, ОГ-In повышал внутриклеточный уровень MIP-1 р в наивных В-клетках и В-клетках памяти периферической крови человека ОГ (размер 200-300 нм) в комплексе с кристаллами Дд!пБ2 (5нм); концентрация 50 мкг/мл [50]
Эффект Характеристика наночастиц ОГ Источник
NK- и NKT-клетки
Or-NH2 повышал внутриклеточный уровень TNF-a в NK-клетках человека и обладал слабой цитотоксичностью в отношении этих клеток
ОГ-антиСй16 индуцировал клеточную активацию, дегрануляцию цитолитических гранул и секрецию IFN-y NK-клетками
ОГ отменял стимулирующий эффект a-GalCer на уровень внутриклеточных цитокинов IFN-y, TNF-a в iNKT и NK-клетках в экспериментах на мышах in vivo. ОГ переключал фенотип iNKT-клеток на продукцию TGF-ß
Не модифицированный ОГ (1-3 слоя) [10] и ОГ с пришитой аминогруппой (ОГ-\1Н2; С 300 нм); концентрации 5; 25; 50 мкг/мл
ОГ-антиС016, размер кластеров [51]
50-300 нм
ОГ размером менее 1 мкм [53]
Заключение
Изучение воздействия оксида графена и его производных на клетки иммунной системы является чрезвычайно важным вопросом для биомедицины. Прежде всего, необходимо учитывать тот факт, что функционализация поверхности ОГ биосовместимыми полимерами снижает цитотоксичность этих наночастиц. Кроме того, при анализе данных необходимо учитывать размер ОГ, как прямой, так и латеральный. Важно также применять в работе стерильные препараты ОГ, не содержащие эндотоксины. В настоящее время данные о воздействии наноча-стиц ОГ на иммунные клетки отрывочны, а зачастую
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Разумов В.Ф. Графен — новый прорыв в области нанотехнологий. Российские нанотехнологии 2010; 5: 17-22. [Razumov V.F. Graphene is a new breakthrough in nanotechnology. Russian nanotechnology 2010; 5: 17-22].
2. Панкратов Д.В., Гонзалез-Аррибас Е., Парунова Ю.М. и др. Новые нанобиокомпозитные материалы для биоэлектронных устройств. Acta Naturae 2015; 7: 103-7. [Pankratov D.V., Gonzalez-Arribas E., Parunova Yu.M. et al. New nanobiocomposite materials for bioelectronic devices. Acta Naturae 2015; 7: 103-7.]
3. Dasari Shareena T.P., McShan D., Dasmahapatra A.K. et al. Review on graphene-based nanomaterials in biomedical applications and risks in environment and health. Nanomicro Lett. 2018; 10: 53.
4. Zhang H., Yan T., Xu S. et al. Graphene oxide-chitosan nanocompos-ites for intracellular delivery of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleo-tides. Mater. Sci. Eng. С Mater. Biol. Appl. 2017; 73: 144-51.
5. Park M.V.D.Z., Bleeker E.A.J., Brand W. et al. Considerations for Safe Innovation: The Case of Graphene. ACS Nano 2017; 11: 9574-93.
6. Makharza S., Cirillo G., Bachmatiuk A. et al. Graphene oxide-based drug delivery vehicles: functionalization, characterization, and cytotoxicity evaluation. J. Nanoparticle Research 2013; 15: 2099.
7. Ou L., Lin S., Song B. et al. The mechanisms of graphene-based materials-induced programmed cell death: a review of apoptosis, autophagy, and programmed necrosis. Int. J. Nanomedicine 2017; 12: 6633-46.
8. Tang Z., Zhao L., Yang Z. et al. Mechanisms of oxidative stress, apoptosis, and autophagy involved in graphene oxide nanomaterial anti-osteosarcoma effect. Int. J. Nanomedicine 2018; 13: 2907-19.
9. Dudek I., Skoda M., Jarosz A. et al. The molecular influence of gra-phene and graphene oxide on the immune system under in vitro and in vivo conditions. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz) 2016; 64(3): 195-215.
10. Orecchioni M., Bedognetti D., Newman L. et al. Single-cell mass cytometry and transcriptome profiling reveal the impact of graphene on human immune cells. Nat. Commun. 2017; 8(1): 1109.
11. Dreyer D.R., Park S., Bielawski C.W. et al. The chemistry of graphene oxide. Chem. Soc. Rev. 2010; 39(1): 228-40.
12. Singh D.P., Herrera C.E., Singh B. et al. Graphene oxide: An efficient material and recent approach for biotechnological and biomedical applications. Mater. Sci. Eng. 2018; 86: 173-97.
13. Orecchioni M., Jasim D.A., Pescatori M. et al. Molecular and genomic impact of large and small lateral dimension graphene oxide sheets on human immune cells from healthy donors. Adv. Healthcare Mater. 2016; 5: 276-87.
14. Kiew S.F., Kiew L.V., Lee H.B. et al. Assessing biocompatibility of graphene oxide-based nanocarriers: A review. J. Controlled Release 2016; 226: 217-28.
и противоречивы, причем противоречия касаются ряда клинически значимых аспектов: стимулирование и(или) подавление презентации антигена, влияние на поляризацию иммунного ответа, наличие или отсутствие цитоток-сических эффектов в отношении ряда иммунных клеток.
Тем не менее, очевидно, что дальнейшая разработка и появление новых наноматериалов требуют изучения процессов их взаимодействия с клетками иммунной системы.
Благодарности
Работа поддержана грантом РНФ 19-15-00244.
15. McCallion C., Burthem J., Rees-Unwin K. et al. Graphene in therapeutics delivery: Problems, solutions and future opportunities. J. Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2016; 104: 235-50.
16. Ishida T., Ichihara M., Wang X. et al. Injection of PEGylated liposomes in rats elicits PEG-specific IgM, which is responsible for rapid elimination of a second dose of PEGylated liposomes. J. Controlled Release 2006; 112(1): 15-25.
17. Kurapati R., Russier J., Squillaci M.A. et al. Dispersibility-dependent biodegradation of graphene oxide by myeloperoxidase. Small 2016; 11: 3985-94.
18. Mukherjee S.P., Gliga A.R., Lazzaretto B. et al. Graphene oxide is degraded by neutrophils and the degradation products are non-genotoxic. Nanoscale 2018; 10(3): 1180-8.
19. Paino I.M., Santos F., Zucolotto V. Biocompatibility and toxicology effects of graphene oxide in cancer, normal, and primary immune cells. J. Biomedical Materials Research — Part A 2017; 105(3): 728-36.
20. Mukherjee S.P., Lazzaretto B., Hultenby K. et al. Graphene oxide elicits membrane lipid changes and neutrophil extracellular trap formation. Chem. 2018; 4(2): 334-58.
21. Li Y., Feng L., Shi X. et al. Surface coating-dependent cytotoxicity and degradation of graphene derivatives: towards the design of non-toxic, degradable nano-graphene. Small 2014; 10(8): 1544-54.
22. Yan J., Chen L., Huang C.C. et al. Consecutive evaluation of graphene oxide and reduced graphene oxide nanoplatelets immunotoxicity on monocytes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2017; 153: 300-9.
23. Orecchioni M., Bordoni V., Fuoco C. et al. Toward high-dimensional single-cell analysis of graphene oxide biological impact: tracking on immune cells by single-cell mass cytometry. Small 2020; 16(21): e2000123.
24. Chen G.Y., Chen C.L., Tuan H.Y. et al. Graphene oxide triggers Toll-like receptors/autophagy responses in vitro and inhibits tumor growth in vivo. Adv. Healthcare Mater. 2014; 3: 1486-95.
25. Chen G.Y., Yang H., Lu C.H. et al. Simultaneous induction of autophagy and toll-like receptor signaling pathways by graphene oxide. Biomaterials 2012; 33(27): 6559-69.
26. Duch M.C., Budinger G.R., Liang Y.T. et al. Minimizing oxidation and stable nanoscale dispersion improves the biocompatibility of graphene in the lung. Nano Lett. 2011; 11(12): 5201-7.
27. Wang X., Podila R., Shannahan J.H. et al. Intravenously delivered graphene nanosheets and multiwalled carbon nanotubes induce site-specific Th2 inflammatory responses via the IL-33/ST2 axis. Int. J. Nanomedicine 2013; 8: 1733-48.
28. Chang Y., Yang S.T., Liu J.H. et al. In vitro toxicity evaluation of graphene oxide on A549 cells. Toxicol. Lett. 2011; 200(3): 201-10.
29. Feito M.J., Vila M., Matesanz M.C. et al. In vitro evaluation of graphene oxide nanosheets on immune function. J. Colloid and Interface Science 2014; 432: 221-8.
30. Diez-Orejas R., Feito M.J., Cicuendez M. et al. Differential effects of graphene oxide nanosheets on Candida albicans phagocytosis by murine peritoneal macrophages. J. Colloid and Interface Science 2018; 512: 665-73.
31. Zhi X., Fang H., Bao C. et al. The immunotoxicity of graphene oxides and the effect of PVP-coating. Biomaterials 2013; 34: 5254-61.
32. Mendes R.G., Koch B., Bachmatiuk A. et al. A size dependent evaluation of the cytotoxicity and uptake of nanographene oxide. J. Mater. Chem. 2015; 3: 2522.
33. Yue H., Wei W., Gu Z. et al. Exploration of graphene oxide as an intelligent platform for cancer vaccines. Nanoscale 2015; 7: 19949-57.
34. Russier J., Treossi E., Scarsi A. et al. Evidencing the mask effect of graphene oxide: a comparative study on primary human and murine phagocytic cells. Nanoscale 2013; 5: 11234-47.
35. Feito M.J., Orejas R.D., Cicuendez M. et al. Characterization of M1 and M2 polarization phenotypes in peritoneal macrophages after treatment with graphene oxide nanosheets. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2019; 176: 96-105.
36. Lategan K., Alghadi H., Bayati M. et al. Effects of graphene oxide nanoparticles on the immune system biomarkers produced by RAW 264.7 and human whole blood cell cultures. Nanomaterials (Basel) 2018; 8(2): 125.
37. Mukherjee S. P., Kostarelos K., Fadeel B. Cytokine profiling of primary human macrophages exposed to endotoxin-free graphene oxide: size-independent NLRP3 inflammasome activation. Adv. Healthcare Mater. 2018; 7: 1700815.
38. Orecchioni D. Bedognetti F. Sgarrella F.M. et al. Impact of carbon nanotubes and graphene on immune cells. J. Transl. Med. 2014; 12: 138.
39. Schreibelt G., Tel J., Sliepen K.H.E.W.J. et al. Toll-like receptor expression and function in human dendritic cell subsets: implications for dendritic cell-based anti-cancer immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy 2010; 59(10): 1573-82.
40. Tomic S., Janjetovic K., Mihajlovic D. et al. Graphene quantum dots suppress proinflammatory T cell responses via autophagy-dependent induction of tolerogenic dendritic cells. Biomaterials 2017; 146: 13-28.
41. Tkach A.V., Yanamala N., Stanley S. et al. Graphene oxide, but not fullerenes, targets immunoproteasomes and suppresses antigen presentation by dendritic cells. Small 2013; 9(9-10): 1686-90.
42. Xu L., Xiang J., Liu Y. et al. Functionalized graphene oxide serves as a novel vaccine nano-adjuvant for robust stimulation of cellular immunity. Nanoscale 2016; 8(6): 3785-95.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ — антиген
АФК — активные формы кислорода
ВИЧ — вирус иммунодефицита человека
ВНЛ — внеклеточные нейтрофильные ловушки
ДК — дендритные клетки
ОГ — оксид графена
ОГ — оксид графена
ПАК — полиакриламин
ПВП — поливинилпирролидон
ПЭА — полиэтиленамин
ПЭГ — полиэтиленгликоль
РМ — ритуксимаб
ФИТЦ — флуоресцеинизотиоцианат
43. Wang W., Li Z., Duan J. et al. In vitro enhancement of dendritic cellmediated anti-glioma immune response by graphene oxide. Nanoscale Res. Lett. 2014; 9(1): 311.
44. Schinwald A., Murphy F.A., Jones A. et al. Graphene-based nano-platelets: a new risk to the respiratory system as a consequence of their unusual aerodynamic properties. ACS Nano 2012; 6(1): 736-46.
45. Mu Q., Su G., Li L. et al. Size-Dependent cell uptake of protein-coated graphene oxide nanosheets. ACS Appl. Mater. Interfaces 2012; 4(4): 2259-66.
46. Meng C., Zhi X., Li C. et al. Graphene oxides decorated with carnosine as an adjuvant to modulate innate immune and improve adaptive immunity in vivo. ACS Nano 2016; 10(2): 2203-13.
47. Ni G., Wang Y., Wu X. et al. Graphene oxide absorbed anti-IL10R antibodies enhance LPS induced immune responses in vitro and in vivo. Immunol. Lett. 2012; 148: 126-32.
48. Zhang M., Mao X., Wang C. et al. The effect of graphene oxide on conformation change, aggregation and cytotoxicity of HIV-1 regulatory protein (Vpr). Biomaterials 2013; 34: 1383-90.
49. Lee S.W., Park H.J., Van Kaer L. et al. Graphene oxide polarizes iNKT cells for production of TGFß and attenuates inflammation in an iNKT cell-mediated sepsis model. Sci. Rep. 2018; 8(1): 810081.
50. Xu S., Xu S., Chen S. et al. Graphene oxide modulates B cell surface phenotype and impairs immunoglobulin secretion in plasma cell. J. Nanosci. Nanotechnol. 2016; 16(4): 4205-15.
51. Luo C., Deng Z., Li L. et al. Association of rituximab with graphene oxide confers direct cytotoxicity for CD20-positive lymphoma cells. Oncotar-get 2016; 7(11): 12806-22.
52. Loftus C., Saeed M., Davis D.M. et al. Activation of human natural killer cells by graphene oxide-templated antibody nanoclusters. Nano Lett. 2018; 18(5): 3282-9.
53. Shissler S.C., Webb T.J. The ins and outs of type I iNKT cell development. Mol. Immunol. 2019; 105: 116-30.
54. Yan M., Liu Y., Zhu X. et al. Nanoscale reduced graphene oxide-mediated photothermal therapy together with IDO inhibition and PD-L1 blockade synergistically promote antitumor immunity. ACS Appl. Interfaces 2019; 11: 1876-85.
55. Ding Z., Luo N., Yue H. et al. In vivo immunological response of exposure to PEGylated graphene oxide via intraperitoneal injection. J. Mater. Chem. B 2020; 8: 10081.
GQD — графеновые квантовые точки IDO — индоламин-2,3-диоксигеназа IFN — интерферон Ig — иммуноглобулин IL — интерлейкин
LMP7 — низкомолекулярный пептид 7 LPS — липополисахарид
NLRP3 — цитозольный белок, Nod-подобный рецептор семейства NALP
PHA — фитогеммагглютинин
Th1 — Т-хелперы 1 типа
Th2 — Т-хелперы 2 типа
TLR-4 — Toll-подобные рецепторы 4 типа
TNF- фактор некроза опухоли
Treg — регуляторные T-лимфоциты
