Научная статья на тему 'Взаимодействие ДНК с k2[PdHGluCl2] in vitro'

Взаимодействие ДНК с k2[PdHGluCl2] in vitro Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

CC BY
134
36
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ДНК / КОМПЛЕКСЫ ПАЛЛАДИЯ / АТОМНАЯСИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ / COORDINATION COMPOUNDS OF PD(II) / DNA / ATOMIC FORCE MICROSCOPY

Аннотация научной статьи по химическим наукам, автор научной работы — Коженков Павел Владимирович, Рамазанов Руслан Рафядинович, Шишилов Олег Николаевич, Ефименко Инесса Александровна, Касьяненко Нина Анатольевна

Представлены результаты экспериментального изучения in vitro взаимодействии молекулы ДНК с K2[PdHGluCl2] в 0,15М и 0,005М NaCl методами спектрофотометрии, кругового дихроизма и атомной молекулярной микроскопии. Проведён квантово-механический расчёт структуры соединения палладия при изменении его координационной сферы в результате акватации с использованием программных пакетов HyperChem 8.0 и GAMESS (FireFly 7.1g). При расчёте молекул использован неограниченный метод Хартри-Фока и базисы: SBKJC VDZ ECP дляпалладия, DH дляатомов водорода и 6,31+G* длявсех остальных атомов в молекуле комплекса. Показано, что соединение палладия взаимодействует с молекулой ДНК в растворе малой ионной силы, тогда как при физиологических условиях (в 0,15М NaCl) взаимодействияД НК с соединением палладия не наблюдается.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по химическим наукам , автор научной работы — Коженков Павел Владимирович, Рамазанов Руслан Рафядинович, Шишилов Олег Николаевич, Ефименко Инесса Александровна, Касьяненко Нина Анатольевна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

DNA interaction with K2[PdHGluCl2] in vitro

The experimental results for DNA interaction in vitro with K2[PdHGluCl2] in 0.15M and 0.005M NaCl were obtained by the methods of spectrophotometry, circular dichroism and atomic force microscopy. The quantum-chemical calculation of Palladium compound structure at the alteration of its coordination sphere as a result of aquatation was done. HyperChem 8.0 and GAMESS (FireFly 7.1g) software were used. For the calculation of molecular structure the Hartree-Fock method and SBKJC VDZ ECP bases: for palladium, DH for hydrogen atoms and 6.31+G* for all other atoms in the molecule of the complex were explored. It was shown that the palladium compound under study interacts with DNA in the solution of low ionic strength and does not form any complexes in physiological conditions (0.15M NaCl).

Текст научной работы на тему «Взаимодействие ДНК с k2[PdHGluCl2] in vitro»

П. В. Коженков, Р. Р. Рамазанов, О. Н . Шишилов, И. А. Ефименко, Н . А. Касьяненко ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С K2[PdHGluCl2] in vitro

Введение. Препараты на основе координационных соединений металлов платиновой группы занимают важное место в противоопухолевой терапии. Наиболее успешно применяется препарат цисплатин, хотя серьёзные побочные эффекты (токсическое действие, неспецифичность, развитие резистентности при лечении), сопровождающие его использование, стимулируют поиск новых координационных соединений металлов (платины, палладия, рутения и др.), обладающих высокой противоопухолевой активностью.

Соединения палладия характеризуются значительно меньшей токсичностью по сравнению с комплексами платины. Если соединения платины обладают сильным им-муносупрессорным действием, то для комплексов палладия это несвойственно. Так как основной мишенью действия в клетке для противоопухолевых препаратов на основе платины является молекула ДНК, широко используется изучение действия новых препаратов на уровне модельных систем — водных растворов ДНК. Изучение взаимодействия соединений палладия с ДНК в растворе представляет значительный интерес для понимания механизма образования таких комплексов и выявления их сходства или различия по сравнению с действием известных препаратов платины. Известно, что повреждения ДНК, индуцированные соединениями палладия, репарируются труднее, чем вызванные воздействием цис-ДДП. Содержание воды в биологических структурах велико, поэтому in vivo координационные соединения палладия могут акватировать-ся — на место атома хлора в координационную сферу палладия встраивается молекула воды. Изучение кинетики комплексообразования позволило предположить, что атака комплексными соединениями палладия позиции N7 гуанина в большой бороздке ДНК является первичным химическим актом, а на второй стадии взаимодействия оставшийся лабильный атом хлора (или молекула воды, заместившая его во внутренней координационной сфере) уходит, освобождая место для второй входящей группы молекулы ДНК.

Для определения характера взаимодействия соединений палладия с ДНК и возможных мест связывания препаратов необходимо знать пространственную структуру координационного соединения и его точные размеры: длину связей, углы между ними, расстояния между атомами. Квантово-химические методы дают возможность численного расчёта конформации молекул, а современные вычислительные машины осуществляют этот расчёт сравнительно быстро.

В представляемой работе приведены экспериментальные данные, полученные при изучении влияния на конформацию молекулы ДНК комплекса K2[PdHGluCl2] in vitro, а также результаты теоретического расчёта структуры соединения палладия.

Материалы и методы. Соединения палладия растворяли в дистиллированной воде, 0,005М NaCl или 0,15М NaCl при комнатной температуре. Их комплексы с ДНК готовили, сливая равные объёмы растворов компонентов заданной ионной силы. Взаимодействие компонентов исследовали в растворе физиологической ионной силы (0,15M NaCl) и при малых концентрациях поддерживающего электролита (0,005M NaCl). Выбор такой концентрации NaCl обусловлен тем, что во внутриклеточной жидкости его

© П. В. Коженков, Р. Р. Рамазанов, О. Н. Шишилов, И. А. Ефименко, Н. А. Касьяненко, 2011

концентрация существенно ниже упомянутой физиологической. Использовали коммерческий препарат тимусной ДНК фирмы “Sigma” с молекулярной массой 11 • 106 г/моль, определённой вискозиметрически.

Спектры поглощения соединений изучали на спектрофотометре СФ-56 (Россия). Спектры кругового дихроизма (КД) ДНК регистрировали на приборе “Mark 4” (Jobin Ivon, Франция). АСМ изображения ДНК и продуктов её взаимодействия с соединениями палладия (комплекс ДНК—Pd) были получены с помощью атомного силового микроскопа “NanoScope 4a” (Veeco). При приготовлении образцов использовали способ самопроизвольной адсорбции ДНК из раствора на поверхность слюды в присутствии ионов магния Mg2+ (C[Mg2+j = 5 • 10~4). Раствор MgCl2 добавляли в исследуемые растворы ДНК и её комплексов непосредственно перед фиксацией. После нанесения капли приготовленного раствора ДНК на свежесколотую поверхность слюды и выдержки образца при комнатной температуре в течение 3 мин слюду промывали дистиллированной водой, удаляя незафиксированные компоненты, высушивали струёй воздуха, а затем в вакуумном сушильном шкафу. Использовали метод прерывистого контакта сухих образцов на воздухе.

Квантово-механические расчёты комплексного иона [PdHGluCb]2~ и двух стадий его акватации (поэтапное замещение атомов хлора молекулами воды согласно общепринятой модели) сделаны с использованием программных пакетов HyperChem 8.0 [1] и GAMESS (FireFly 7.1g) [2]. Обязательными входными параметрами являются координаты атомов, их заряды, полный заряд молекулы, мультиплетность. Неэмпирическое исследование при полной оптимизации геометрии комплекса проводилось с использованием неограниченного метода Хартри—Фока—Рутаана [3] и следующих базисных наборов волновых функций: эффективный псевдопотенциал (SBKJC VDZ ECP) [4] — для палладия, DH [5] — для атомов водорода и 6-31G* (с поляризующими функциями) — для всех остальных атомов в молекуле комплекса.

Результаты и обсуждение. На рис. 1 представлены изображения комплексного иона [PdHGluCb]2- после диссоциации используемого в работе соединения палладия, а также продукты его акватации [PdHGlu(H2O)Cl]_ и [PdHGlu(H2O)2]. Их равновесные структуры имеют плоскую квадратную симметрию в окружении атома палладия, а длина связей и углы между лигандами и комплексообразующим металлом близки к таковым в структуре цис-ДДП (таблица) [6]. Уменьшение энергии комплексов, полученных по схеме двухстадийного замещения ацидолигандов Cl на молекулы воды, позволяет (в первом приближении) говорить о выгодности процесса акватации. Следуя общепринятым представлениям о связывании цис -ДДП с молекулой ДНК [7, 8], на основании структуры соединения можно предположить сходный механизм взаимодействия K2[PdHGluCl2] с макромолекулой по позиции N7 гуанина.

Параметры геометрии [PdHGluX2], X = Cl, H2O и цис- ДДП

Y = Pd, Pt [PdHGluXa], X = Cl, H20 Pt(NH3)X2, X = Cl, H2O

Y-Cl 2,36 À 2,31 À

Y-ОНз 2,16 Á 2,13 Á

Cl-Y-Cl 96° 94°

H2O-Y-H2O 94° 92°

Экспериментальное исследование взаимодействия комплексов палладия с ДНК проводили в растворах физиологической (0,15Ы) и малой ионной силы раствора (0,005Ы

Рис. 1. Молекула [PdHGluCl2]2 в двух ортогональных проекциях (а, б) и структура комплексов [PdHGlu(H20)СЦ- (в) и [PdHGlu(H20)2] (г)

^С1). Опыт показал, что присутствие соли в водном растворе К2 [РЖС1иС12] оказывает влияние на состояние комплекса. На рис. 2 представлены спектры поглощения этого соединения в дистиллированной воде и в растворах NaCl двух концентраций (0,005М и 0,15М). Измерения проводили при комнатной температуре. На рис. 2 видно, что

присутствие соли в растворе приводит к длинноволновому смещению максимума, что может быть связано с изменением координационной сферы комплексного иона.

Спектр K2[PdHGluCl2] в 0,005М ^С1 в присутствии ДНК представлен на рис. 3, а. Для систем использовали раствор соединения палладия в 0,005М ^С1, приготовленный за сутки до сливания с раствором ДНК.

Измерения проводили через 3 ч после приготовления систем и по прошествии недели. Заметим, в рассматриваемой спектральной области ДНК не имеет полосы поглощения, что позволяет следить за состоянием именно комплексного иона палладия в присутствии ДНК. Как видно, в этом случае спектр поглощения соединения в присутствии ДНК отличается от наблюдаемого для свободного соединения палладия, что однозначно свидетельствует о формировании комплекса ДНК с используемым координационным соединением палладия. В комплексе максимум рассматриваемой полосы смещается в область более коротких длин волн. Кроме того, наблюдается возрастание оптической плотности при 300 нм < \ < 350 нм, где нет поглощения у молекулы ДНК. Результаты свидетельствуют также, что комплекс достаточно устойчив во времени, тогда как свободное соединение, возможно, со временем частично выпадает из раствора. Действительно, опыт показал, что даже через 7 дней (при хранении растворов при температуре 4 °С) существенных изменений в спектре соединения в комплексе на наблюдается. На основании полученных данных можно заключить, что присутствие ДНК в растворе стабилизирует состояние комплексного иона палладия.

Влияние концентрации ДНК в растворе на длинноволновую полосу поглощения препарата в 0,005М и 0,15М ^С1 можно увидеть на рис. 3, б и в. При малой ионной силе раствора взаимодействие компонентов осуществляется, и оно проявляется не только в изменении этой полосы, но и в увеличении оптической плотности растворов в области 300 нм < X < 350 нм (повторим, что в этом диапазоне длин волн ДНК не поглощает). Измерения были проведены спустя сутки после приготовления комплексов. При физиологической ионной силе (0,15М ^С1) изменения в спектре поглощения соединения палладия не фиксируется. Таким образом, взаимодействие компонентов осуществляется только при низкой концентрации поддерживающего электролита ^аС1), что указывает на важную роль электростатических взаимодействий при образовании комплекса.

Спектры КД ДНК в 0,005М ^С1 (рис. 3, г) при разных концентрациях K2[PdHG1uCl2] также указывают на реализацию связывания компонентов в растворе. Так как мы не можем исключить появления наведённого кругового дихроизма у соединения палладия, которое не обладает собственной оптической активностью, но имеет полосу поглощения в используемой области спектра, то представленные данные не позволяют сделать более конкретных выводов о влиянии связывания на вторичную структуру ДНК. Следует отметить, что при увеличении концентрации исследуемого соединения палладия в комплексе спектральные изменения становятся всё значительнее.

Рис. 2. Спектр поглощения K2[PdHGluCl2] в воде (1); 0,005M NaCl (2) и 0,15M NaCl (3) через сутки после приготовления растворов Сра = 10~3M

Я, нм

Я, нм

D 0,15 -

0,10 -

0,05

0,00

*■£* *

«й*

«V

320 360 400 440

Я, нм

Я, нм

Рис. 3. Спектры поглощения (для а, б, в) свободного соединения K2[PdHGluCl2] (1, 3) и его комплексов с ДНК (2, 4): в 0,005М NaCl в зависимости а: от времени выдержки растворов спустя 15 мин (1, 2) и через неделю (2, 4) после приготовления растворов CPd = 10~3M, Сднк = 0,004 %; б, в: от концентрации ДНК в растворах 0,005М (б) и 0,15М (в) NaCl при измерении систем на следующий день после приготовления; для (б) и (в):

Cpd = 5 • 10~4M, Сднк = 0 % (1); 0,000125 % (2); 0,00025 % (3); 0,000375 % (4);

0,0005 % (5); 0,00075 % (6); 0,001 % (7); для (г): спектры КД ДНК в 0,005M NaCl в присутствии соединения палладия; Cpd = 0М (1); 0,625 • 10~4М (2); 1,25 • 10~4М (3);

2,5 • 10~4М (4); 5 • 10~4М (5); Сднк = 0,001 %

На рис. 4 представлены АСМ-изображения ДНК и соответствующих комплексов, полученные в режиме прерывистого контакта для кольцевой плазмидной ДНК. Эти результаты демонстрируют фиксацию отдельных молекул ДНК на подложке. Увеличение концентрации соединения в растворе ДНК приводит к заметному изменению конформации макромолекулы. При малых концентрациях соединения заметно формирование структур на макромолекуле, которые можно трактовать либо как определённое «закручивание» цепи ДНК в месте связывания препарата, либо, возможно, как восстановление палладия при связывании с макромолекулой и фиксации на слюде. С увеличением концентрации палладия в растворе таких структур становится больше. Возможно, такие конформационные изменения ДНК и объясняют наблюдаемые при больших концентрациях соединения палладия спектры КД. В этом случае в системе может появиться

Щ 1,0 мкм 1 ^OO : : 1,5 мкм 1

Рис. 4. АСМ-изображения свободной ДНК (а) и ДНК в комплексе с соединением палладия в 0,005М NaCl; СДнк = 0,75 • 10~4 %, Сра = 2 • 10~6М (б), 10~5М (в), 2 • 10~5М (г)

рассеяние из-за нарушения молекулярности раствора. Заметим, что ранее при изучении взаимодействия молекулы ДНК с соединениями палладия иной структуры были получены АСМ-изображения комплексов, которые имеют сходные черты с наблюдаемыми нами [9].

Проведённые расчёты структуры препарата дают основание предполагать, что используемое соединение палладия может образовывать комплексы с молекулой ДНК, аналогичные для платиновых препаратов сходного состава. Экспериментальные данные указывают на формирование комплексов, которые затрагивают координационную сферу палладия. АСМ-изображения демонстрируют образование структур, сходных с наблюдаемыми ранее для соединений палладия.

1. HyperChem. Release 7.0 for Windows, Molecular Modeling System. 2002.

2. Granovsky A. A. PC GAMESS/Firefly version 7.I.F. URL: http://classic.chem.msu.su/gran/ / gamess/index.htm

3. Клементи Э. Электронная структура ароматических соединений // Журн. структ. химии. 1969. T. 19. № 2. C. 354-399.

4. KraussJ., Stevens W., BaschH. J. // Chem. Phys. 1984. Vol. 81. P. 6026.

5. Hay P. J., Dunning T. H. Modern Theoretical Chemistry / ed. by H. F. Schaefer. New York., 1976. P. 1-28.

6. Рамазанов Р. Р., Щёголев Б. Ф., Сурма С. В., Касьяненко Н. А. Исследование комплексов цис- и транс-ДДП с молекулой ДНК методами молекулярной динамики и квантовой химии // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2010. Вып. 2. C. 32-39.

7. WangD., LippardS. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs // Nat. Rev. Drug. Discov. 2005. Vol. 4. N 4. P. 307-320.

8. КасьяненкоН. А., Фрисман Э. В., Валуева С. В. и др. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины. I. Взаимодействие цис-ДДП с молекулой ДНК //Молекуляр. биология. 1995. T. 29. C. 345-356.

9. Kasyanenko N. A., Levykina E. V., Erofeeva O. S. et al. Study of influence of palladium acido-complexes [Ln] m [Pdx4] on DNA conformation in vitro // J. Struct. Chem. 2009. N 5. P. 1034-1044.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.