CC BY
340
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
experimental gastroenterology
ВЫЖИВАЕМОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРОБИОТИКОВ В УСЛОВИЯХ IN VITRO, ИМИТИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС ПИЩЕВАРЕНИЯ У ЧЕЛОВЕКА
Дармов И.В.1, Чичерин И.Ю.2Погорельский И.П.1, ЛундовскихИ.А.1,
1 Вятский государственный университет, кафедра микробиологии
2 ООО «МедСтар»
Погорельский И.П.
610000, Киров, ул. Московская, 36
Тел.: (8332) 32 1650
E-mail: biologiavgu@yandex.ru
РЕЗЮМЕ
Цель исследования. Оценка выживаемости бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro, имитирующих пищеварение в желудке и кишечнике человека, и изучение выживаемости пробиотических и индигенных микроорганизмов в условиях совместного культивирования на плотной питательной среде.
Материалы и методы. В экспериментах использовали пробиотические микроорганизмы, выделенные из коммерческих препаратов бифидумбактерин, лактобактерин, клинические изоляты лактобацилл (Lactobacillus acidophilus № 1, L. brevis № 2). Изучение выживаемости микроорганизмов пробиотиков проводили на модели in vitro, имитирующих условия пищеварения в организме человека. Оценку взаимоотношений микроорганизмов пробиотиков и индигенных микроорганизмов проводили в условиях совместного культивирования in vitro на плотной питательной среде.
Результаты. Установлено значительное снижение числа жизнеспособных пробиотических микроорганизмов при их инкубации в модельных средах, а также подавление роста пробиотических микроорганизмов культурами клинических штаммов лактобацилл, соответствующее бионесовместимости по типу «хозяин против пробиотика».
Заключение. При выборе пробиотиков при лечении дисбактериозов необходимо предварительно изучить характер взаимоотношений микроорганизмов пробиотиков с индигенной микрофлорой пациента, а также стимулировать микроорганизмы собственной микрофлоры с использованием современных пребиотиков.
Ключевые слова: индигенные и пробиотические микроорганизмы; выживаемость; антагонизм; биосовместимость; бионесовместимость; пребиотики.
SUMMARY
Purpose of the study. Assessment of survival bifidobacteria and lactobacteria under the conditions in vitro, simulating digestion in human stomach and intestine, and study of survival probiotic and indigenous microorganisms in co-cultivation on solid nutrient medium.
Materials and methods. Probiotic microorganisms from commercial preparations Bifidobacterin and Lacto-bacterin, clinical isolates lactobacillus (Lactobacillus acidophilus № 1, L. brevis № 2) were used in experiments. Survival study of probiotic microorganisms was performed on a model in vitro, simulating the process of digestion in the human body. Assessment of the relationship of probiotic microorganisms and indigenous microorganisms was carried out in co-cultivation in vitro on solid nutrient medium.
Results. A significant reduction in the number of viable probiotic microorganisms during their incubation in model media was set as well as suppression of probiotic microorganisms growth by cultures of a clinical strains of lactobacillus, corresponding to biocompatibility by type "host against probiotic".
Conclusion. While choosing probiotics in the treatment of dysbacterioses the character of relationship between probiotic microorganisms and indigenous microorganisms of a patient is recommended to be preliminarily tested. Also microorganisms of own microflora should be stimulated using modern prebiotics.
Keywords: indigenous and probiotic microorganisms; survival; antagonism; biocompatibility; bioincompatibility; prebiotics.
ВВЕДЕНИЕ
Дисбактериозы являются актуальной проблемой медицины, привлекающей пристальное внимание ученых и профильных врачей-клиницистов, ежедневно сталкивающихся с микроэкологическими нарушениями при клинической патологии различного происхождения [1; 2]. С дисбактериозами связаны многочисленные проявления болезней, расстройства в функционировании тех или иных органов и систем [1; 3]. Современные подходы к лечебной коррекции дисбиотических изменений в кишечнике больных и восстановлению нормальной микрофлоры включают ряд мероприятий, связанных как с патогенетическим лечением основного заболевания, так и, в случае необходимости, с избирательной деконтаминацией условно патогенной и патогенной микрофлоры и последующим усилением местного и системного иммунитета [1; 3]. Параллельно проводится восстановление индигенной микрофлоры путем коррекции нарушений микробиоценоза. Среди множества средств коррекции нарушений микрофлоры кишечника пробиотики занимают особое место в связи с теми эффектами (общего характера, гуморальными и клеточными), которые регистрируются как объективно, так и субъективно — улучшением самочувствия больного [4; 5]. Появление нового поколения пробиотиков связано не только с совершенствованием технологии их производства, но и с имеющимися случаями низкого, а порой и нулевого эффекта от их применения при некоторых дисбиотических состояниях. В этой связи в плане комплексной профилактики и лечения дисбактериозов чрезвычайно важно внедрить в практику новые подходы к нормализации микрофлоры, в частности связанные со стимуляцией собственной индигенной микрофлоры больного [1]. В то же время до настоящего времени не решен вопрос о выживаемости пробиотических микроорганизмов при их пероральном применении в ходе продвижения по пищеварительному тракту, что предопределяет необходимость проведения микробиологических исследований в данном направлении.
Цель настоящего исследования — оценка выживаемости бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro, имитирующих пищеварение в желудке
и кишечнике человека, и изучение взаимоотношения пробиотических и индигенных микроорганизмов в условиях совместного культивирования in vitro на плотной питательной среде.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В экспериментах использовали пробиотические микроорганизмы, выделенные из коммерческих препаратов бифидумбактерин (серии 090210, 245, 5 074, 288 -1, 315 - 6), лактобактерин (серии 15 / 6, 125 - 2, 125 - 6), а также два изолята инди-генных лактобацилл (Lactobacillus acidophilus № 1, Lactobacillus brevis № 2), выделенные из фекалий больных.
Бифидобактерии выращивали на плотной питательной среде, рекомендованной в информационном письме [6]. Выращивание лактобацилл проводили на среде МРС, приготовленной по прописи, представленной в работе [7]. При выращивании пробиотических микроорганизмов в микроаэро-фильных условиях использовали систему для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark III-LE003 (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными HiAnaero Gas Pacet.
При оценке биосовместимости бифидобактерий и лактобацилл различного происхождения использовали плотные питательные среды на основе перевара Хоттингера или триптического гидролизата мяса с добавлением стимуляторов роста (сульфита натрия, гемина, стимулятора роста Карпузиди).
Изучение выживаемости микроорганизмов пробиотиков проводили на модели in vitro, имитирующей условия пищеварения в организме человека. В качестве основы была использована модель, описанная в методических рекомендациях «Оценка безопасности наноматериалов» [8].
Модельные среды готовили на основе цитратно-фосфатного буферного раствора и ферментных препаратов ацидин-пепсина, регистрационный номер ЛС-001355; производство РУП «Белмедпрепараты»,
■ экспериментальная гастроэнтерология
experimental gastroenterology
№03/2011 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Основываясь на методических рекомендациях
[8], нами была разработана методика изучения выживаемости пробиотических микроорганизмов в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека. Суть методики состоит в инкубации микроорганизмов последовательно в кислой модельной среде с ацидин-пепсином (рН 2,0) и щелочной модельной среде с панзинорм форте 20000 (рН 7,2) в течение среднего времени пребывания смешанной пищи соответственно в желудке и кишечнике с последующим определением числа выживших микроорганизмов и их общего количества в исходной суспензии путем подсчета в камере Горяева.
В соответствии с разработанной методикой определяли количество жизнеспособных бактерий в одной дозе препарата (КОЕ-мл -1) в начале эксперимента (0 час), через 4 часа инкубации в кислой среде в присутствии ацидин-пепсина (0,5 мг-мл -1) и через 12 часов инкубации в щелочной среде в присутствии панзинорм форте 20000 (2,5 мг-мл -1). Результаты определений представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1
ВЫЖИВАЕМОСТЬ БИФИДОБАКТЕРИЙ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА БИФИДУМБАКТЕРИН В МОДЕЛЬНЫХ СРЕДАХ И УСЛОВИЯХ, ИМИТИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС ПИЩЕВАРЕНИЯ У ЧЕЛОВЕКА (п = 5)
Серия препарата Штаммы бифидобактерий Внешний вид лиофилизированной микробной массы Общее количество бактерий в одной дозе препарата, определенное в камере Горяева Содержание живых бактерий в пробе на.. .час эксперимента, КОЕ-мл1 (х ± I95)
0 4 12
090210 B. bifidum 1 или B. bifidum 791 Пористая масса бежевого цвета 1,9 • 107 (1,7 ± 0,2) • 107 (1,2 ± 0,4) • 104 (1,8 ± 0,5) • 103
245 Пористая масса беловато-серого цвета 1,8 • 107 (1,7 ± 0,2) • 107 (1,1 ± 0,3) -10“ (4,5 ± 0,2) •Ю2
Пористая масса светло-коричневого цвета 1,9 • 107 (1,8 ± 0,3) • 107 (1,0 ± 0,4) • 104 (3,9 ± 0,4) • 102
315-б Пористая масса бежевого цвета 2,0 • 107 (1,1 ± 0,3) • 107 (4,0 ± 0,5) • 105 (2,0 ± 0,3) • 103
Пористая масса светло-коричневого цвета 2,1 • 107 (1,2 ± 0,3) • 107 (2,0 ± 0,4) • 105 (2,5 ± 0,4) • 103
288-1 Пористая масса бежевого цвета 1,6 • 107 (1,2 ± 0,4) • 107 (2,2 ± 0,5) • 105 (3,1 ± 0,3) • 103
Кристаллическая масса светло-коричневого цвета 1,4 • 107 (7,8 ± 0,б) • 10б (3,б ± 0,5) • 104 (1,5 ± 0,4) • 103
5074 Пористая масса светло-коричневого цвета 1,2 • 107 (б,4 ± 0,5) • 105 (2,4 ± 0,3) • 104 (1,0 ± 0,3) • 102
Пористая масса бежевого цвета 1,2 • 107 (б,1 ± 0,4) • 105 (2,б ± 0,5) • 104 (1,б ± 0,5) • 102
Минск (Беларусь), панзинорм форте 20000, регистрационный номер П № 014602/01; производство ООО «КРКА-РУС», г. Истра Московской области (Россия).
Оценку взаимоотношений микроорганизмов пробиотиков и индигенных микроорганизмов в условиях совместного культивирования in vitro на плотной питательной среде проводили согласно методике, описанной в работе [9].
Общее количество микробных клеток в одной дозе препарата пробиотика определяли подсчетом в камере Горяева (модель 851, ЛПО «Красногвардеец»). Количество живых микроорганизмов в препаратах пробиотиков и в суспензиях после взаимодействия с ферментными препаратами и инкубации модельных сред и суспензий в анаэростате при температуре 37 °С определяли высевом соответствующих десятикратных серийных разведений исследуемых суспензий на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчета выросших колоний по истечении времени инкубирования.
Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве И. П. Ашмарина и А. А. Воробьева [10].
Из представленных данных следует, что в результате воздействия на пробиотические микроорганизмы факторов, имитирующих таковые в желудочно-кишечном тракте человека, происходит заметное снижение числа жизнеспособных микробных клеток: сначала в кислой среде с ферментным препаратом ацидин-пепсином число жизнеспособных микроорганизмов снижается на два-три порядка по сравнению с исходным количеством, а затем в щелочной среде с ферментным препаратом панзинорм форте 20000 — еще на один-два порядка.
Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных можно с большой долей вероятности утверждать, что в реальных условиях заместительной терапии пробиотическими препаратами бифидумбактерин, лактобактерин в результате пассажа через желудочно-кишечный тракт в толстую кишку больного дисбактериозом поступает сниженное количество пробиотических микроорганизмов, недостаточное для получения лечебного эффекта.
Н. А. Глушановой и Б. А. Шендеровым [9] в ходе изучения взаимоотношений пробиотических и ин-дигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro выявлено 3 типа взаимодействия: отсутствие антагонизма — биосовместимость (15,2%), подавление роста индигенных лактобацилл — биосовместимость по типу «пробиотик против хозяина» (62,3%) и ингибирование роста пробиотических бактерий — биосовместимость по типу «хозяин против пробиотика» (22,5%). В проведенных нами в соответствии с методикой авторов
[9] исследованиях с использованием двух клинических изолятов индигенных лактобацилл, изолированных из фекалий больных (L. acidophilus № 1, L. brevis № 2), было показано, что оба изолята проявляли антагонистические взаимоотношения (по типу «хозяин против пробиотика») с бифидо- и лактобактериями, выделенными из биотических препаратов бифидумбактерин и лактобактерин. Полученные результаты еще раз свидетельствуют о необходимости предварительного исследования взаимоотношения пробиотических культур с индигенными лактобациллами пациента, которому назначают соответствующий пробиотический препарат.
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Клинические наблюдения и экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что у многих жителей России, в том числе и у детей, имеет место выраженный дисбаланс нормальной микрофлоры кишечника [1; 9]. Именно от состояния кишечника, его нормальной микрофлоры на 70-80% зависит сопротивляемость организма к болезням. В постоянных симбиотических или антагонистических взаимоотношениях микроорганизмы нормальной микрофлоры развиваются, используя перевариваемую пищу и компоненты, секретируемые в желудочно-кишечный тракт организмом, и наконец экскретируются во внешнюю среду [11; 12].
Таблица 2
ВЫЖИВАЕМОСТЬ ЛАКТОБАКТЕРИЙ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ЛАКТОБАКТЕРИН В МОДЕЛЬНЫХ СРЕДАХ И УСЛОВИЯХ, ИМИТИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС ПИЩЕВАРЕНИЯ У ЧЕЛОВЕКА (п = 5)
Серия препарата Штаммы лактобактерий Внешний вид лиофилизированной микробной массы Общее количество бактерий в одной дозе препарата, определенное в камере Горяева Содержание живых бактерий в пробе на.. .час эксперимента, КОЕ-мл1 (х ± I95)
0 4 12
15 / 6 L. plantarum 8Р-А3, или L. plantarum 38, или L. fermentum 90Т-С4, или L. fermentum 39 Пористая масса желтовато-бежевого цвета 4,0 • 109 (2,1 ± 0,4) • 109 (4,0 ± 0,5) • 105 (2,0 ± 0,4) • 103
Пористая масса беловато-серого цвета 4,1 • 109 (2,2 ± 0,4) • 109 (3,6 ± 0,5) • 105 (2,2 ± 0,3) • 103
125-2 Пористая масса желтовато-бежевого цвета 4,5 • 109 (4,6 ± 0,6) • 109 (2,0 ± 0,6) • 106 (2,6 ± 0,4) • 102
То же 4,5 • 109 (4,2 ± 0,5) • 109 (2,2 ± 0,5) • 106 (1,8 ± 0,4) • 102
125-6 Пористая масса желтовато-бежевого цвета 4,1 • 109 (3,2 ± 0,4) • 109 (2,4 ± 0,5) • 107 (1,2 ± 0,6) • 106
То же 4,0 • 109 (3,1 ± 0,5) • 109 (2,5 ± 0,6) • 107 (1,5 ± 0,6) • 106
Кристаллическая масса светло-коричневого цвета 3,9 • 109 (3,7 ± 0,6) • 109 (2,1 ± 0,5) • 106 (1,1 ± 0,5) • 105
^-----------------------------------------------------------------
экспериментальная гастроэнтерология
experimental gastroenterology
№03/2011 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
В то же время в научной литературе имеется практически единственное указание [2] на то, что в сознании врача развитие заболевания не всегда ассоциируется с микроэкологическими нарушениями в кишечнике больного, которому планируется назначение пробиотиков с лечебной или профилактической целью. Безусловно, многолетний опыт применения пробиотических препаратов свидетельствует о физиологичности и значимости для больного такой заместительной терапии. Однако положительный эффект пробиотиков, как свидетельствует опыт клиницистов, носит временный характер, а при ряде дисбиотических состояний эффект отсутствует.
Важнейшим фактором, определяющим приживление или элиминацию пробиотических микроорганизмов в кишечнике больного, является состояние колонизационной резистентности [9], что, в свою очередь, связано с биологическими свойствами пробиотических бифидо- и лактобактерий и индигенных представителей кишечной микрофлоры. С одной стороны, между колониями микроорганизмов и кишечной стенкой складывается тесная взаимосвязь, объединяющая их в единый микробно-тканевой комплекс [13; 14], а с другой — между самими микроорганизмами формируется определенный тип взаимоотношений и, как следствие, их конкурентоспособность или совместимость. Именно для лечебной коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике и преодоления бионесовместимости предлагается производить новые поливалентные или комбинированные препараты с иммобилизованными бактериями различных таксономических групп [2] или искать новые оригинальные способы нормализации микрофлоры с помощью лекарственных препаратов.
При всей важности указанных подходов практически не изученным остается такой микробиологический аспект заместительной терапии пробиотическими препаратами при дисбактериозах, как выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте больного при перо-ральном их поступлении. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что на численность пробиотических микроорганизмов отрицательное влияние оказывают кислая и сменяющая ее щелочная модельные среды, содержащие соответственно ацидин-пепсин и панзинорм форте 20000, имитирующие in vitro условия пищеварения у человека. Естественно, что в условиях in vivo на пробиотические микроорганизмы воздействует гораздо больше, чем в эксперименте, факторов, приводящих к гибели значительной части их популяций. Снижение численности популяции микроорганизмов пробиотиков ниже критической в соответствии
с экологическими принципами ведет к гибели всей популяции. Это одна из причин низкой эффективности пробиотикотерапии либо ее отсутствия.
Другой причиной низкой эффективности заместительной пробиотикотерапии может быть бионесовместимость по типу «хозяин против пробиотика» [9]. В наших экспериментах по изучению взаимоотношения пробиотических бифидобактерий и лактобактерий и индигенных лактобацилл (двух клинических изолятов, выделенных из фекалий людей) в условиях совместного культивирования in vitro была однозначно показана их бионесовместимость. Именно такие антагонистически активные лактобациллы больного могут полностью предотвратить приживление пробиотических микроорганизмов.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о необходимости предварительного исследования взаимоотношения пробиотических микроорганизмов, которые будут предписаны врачом больному, с его индигенными микроорганизмами. Это позволит отбирать наиболее активные для конкретного пациента пробиотические препараты. Это во-первых. А во-вторых, необходимо стимулировать существующие в кишечнике больного, хоть и в минимальном количестве, микроорганизмы нормальной микрофлоры. Оригинальность данного способа нормализации микрофлоры, о чем говорится в работе [1], но который только сейчас в силу ряда обстоятельств начинает внедряться в клиническую практику, состоит в использовании пребиотической эффективности инулина и олигофруктозы. Волокна инулина и олигофруктозы, как это экспериментально подтверждено, избирательно стимулируют рост и метаболическую активность только определенных видов бактерий — бифидобактерий и лактобацилл, не влияя на развитие других бактерий (фузобакте-рий, пропионибактерий, бактероидов и т. д.). Именно таким пребиотическим эффектом обладает созданный в России препарат стимбифид, содержащий фруктоолигосахариды, фруктополисахариды и премикс витаминно-минеральный. Указанный эффект был продемонстрирован в экспериментах in vitro и на людях разных возрастных категорий — младенцах и детях раннего возраста, на взрослых людях и людях преклонного возраста, о чем свидетельствуют результаты клинико-лабораторного исследования пребиотика Стимбифид [5]. С учетом этих результатов и экспериментальных данных, полученных в настоящей работе, можно предположить, что пребиотики на основе фруктоолиго-и фруктополисахаридов могут занять свое особое место в лечении и профилактике микроэкологиче-ских нарушений в кишечнике в качестве перспективных препаратов для использования в практической медицине.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьев А. А., Абрамов Н. А., Бондаренко В. М., Шендеров Б. А. Дисбактериозы — актуальная проблема медицины // Вестн. РАМН. — 1997. — № 3. — С. 4-7.
2. Воробьев А. А., Бондаренко В. М., Лыкова Е.А. и др. Микроэколо-гические нарушения при клинической патологии и их коррекция бифидосодержащими пробиотиками // Вестн. РАМН. — 2004. — № 2. — С. 13-17.
3. Бондаренко В. М., Петровская В. Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестн. РАМН. — 1997. — № 3. — С. 7-10.
4. Утемурадова Г. Э. Этиология острых кишечных инфекций у детей и эффект пробиотикотерапии // Журн. микробиол. — 2009. — № 3. — С. 80-100.
5. Грачева Н. М., Ардатская М. Д., Аваков А.А., Соловьева А. И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дис-биотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. — М.: Московский НИИЭМ им. Г. Н. Габричевского, 2010.
6. Иванов В. П., Бойцов А. Г., Коваленко А. Д. и др. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. — СПб.: Центр госсанэпиднадзора, 2002.
7. Лихачева А. Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus // Журн. микробиол. — 1992. — № 9-10. — С. 74-78.
8. Методические рекомендации «Оценка безопасности наноматериалов». Утв. приказом Роспотребнадзора от 12.10.2007 г. № 280. — М.: Роспотребнадзор, 2007.
9. Глушанова Н. А., Шендеров Б. А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro // Журн. микробиол. — 2005. — № 2. — С. 56-61.
10. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. — Л.: Медгиз, 1962.
11. Mitsuoka T. Intestinal flora and host // Asian Med. J. — 1988. — Vol. 31, № 7. — P. 400-409.
12. Gorbach S. L. Function of the normal human microflora // Scand. J. Infect. Diseases. — 1986. — Vol. 18, Suppl. № 49. — P. 17 - 30.
13. Кузнецов О. Ю. Бактериальная колония как сложно организованное сообщество клеток // Журн. микробиол. — 2005. — № 2. — С. 3-7.
14. Минушкин О. Н., Ардатская М. Д., Зверков И. В., Чичерин И. Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей. — М.: Учебно-методический центр управления делами Президента Российской Федерации, 2010.
Б >
а
So L 2
О £
Я--
Щ а
Н1Ё £Е
2 ^
a.
Н ч
U
га
L
Б
га
X
<
га
I-
х
ш
2
s
а
ш
с
и
v
m
