CC BY
169
Т| Теоретическая и клиническая медицина________________________________________________________
УДК 579.262:615.37: 616.34-008.87
ХАРАКТЕРИСТИКА ОТНОШЕНИЙ МЕЖДУ ПРОБИОТИЧЕСКИМИ И АВТОХТОННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ И АЛГОРИТМ ИНДИВИДУАЛЬНОГО ПОДБОРА ПРОБИОТИКОВ
Александр Васильевич Семенов Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург
Реферат
Цель. Изучение in vitro особенностей межмикробных отношений между пробиотическими и автохтонными микроорганизмами и на этой основе разработка алгоритма индивидуального подбора пробиотиков.
Методы. Отношения между автохтонной Lactobacillus sp. и коммерческими штаммами-пробиотиками изучались с использованием оригинального способа, позволяющего оценивать антимикробные и ростовые характеристики микроорганизмов, обработанных метаболитами ассоцианта.
Результаты. Обнаружено, что микроорганизмы пробиотики и автохтонные микроорганизмы могут стимулировать и ингибировать ростовые и антимикробные свойства друг друга.
Выводы. Предложен алгоритм индивидуального подбора пробиотиков с определением у пробиотического штамма антагонистической активности к патогену, биосовместимости с нормальной микрофлорой, способности стимулировать антагонизм и/или ростовые свойства нормальной микрофлоры индивидуума.
Ключевые слова: межмикробные отношения, антагонизм, пробиотик, алгоритм выбора.
CHARACTERISTIC OF THE RELATIONS BETWEEN PROBIOTIC AND AUTOCHTHONOUS MICROORGANISMS AND THE ALGORITHM OF INDIVIDUAL PROBIOTIC SELECTION. A.V. Semenov. Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Orenburg city. Aim. To study in vitro the characteristics of inter-microbial relations between probiotic and autochthonous microorganisms and on this basis, the development of an algorithm of individual probiotic’s selection. Methods. The relationships between the autochthonous Lactobacillus sp. and commercial probiotic strains were studied using an original method for assessing antimicrobial and growth characteristics of microorganisms treated with metabolites of associants. Results. It was found that probiotics and autochthonous microorganisms can stimulate and inhibit growth and antimicrobial properties of each other. Conclusion. Proposed was an algorithm of individual selection of probiotics with the determination in the probiotic strain of the antagonistic activity towards the pathogen, the biocompatibility of the normal microflora, the ability to stimulate antagonism and/or growth properties of the normal microflora of the individual. Key words: inter-microbial relations, antagonism, probiotic, algorithm selection.
Для коррекции дисбиозов, лечения и профилактики инфекционных заболеваний используют препараты на основе живых бактерий — пробиотики. Однако лечебно-профилактический эффект от их использования достигается не всегда. По-видимому, одна из основных причин низкой эффективности пробиотиков состоит в том, что штаммы, входящие в их состав, как и любые другие микроорганизмы, вступают в симбиотические взаимоотношения с микрофлорой пациента. В известных пределах отношения между организмами могут быть положительными (комменсализм, мутуализм), отрицательными (антагонизм) и индифферентными (нейтрализм). Соответственно от типа указанных взаимодействий будет зависеть и лечебный эффект препарата. Очевидно, что пробиотик должен вступать в антагонистические отношения с патогенами и как минимум в индифферентные — с индигенами пациента. Из-за индивидуальных особенностей микробного пейзажа и свойств микроорганизмов прогнозировать эти взаимодействия заранее
Адрес для переписки: lever3@yandex.ru
792
нельзя, т.е. назначение пробиотиков должно быть персонализированным.
В литературе предложены приёмы реализации данного подхода. Например, назначаемый пробиотик предлагается протестировать методом, аналогичным определению антибиотикочувствительно-сти, на антагонизм в отношении инфекта и нормофлоры индивидуума [2, 3]. Обнаружена способность различных микроорганизмов стимулировать антимикробные и ростовые свойства индигенных бактерий [1], которая позволяет использовать пробиотики для усиления защитного потенциала нормофлоры индивидуума. Однако до сих пор нет алгоритма отбора биопрепарата, полностью учитывающего указанные взаимодействия, позволяющего осуществлять выбор пробиотика, находящегося в позитивных отношениях с нормальной микрофлорой и негативных с инфекционными агентами индивидуума.
Целью настоящего исследования было изучение in vitro особенностей межмикроб-ных отношений пробиотических и автохтонных микроорганизмов и на основе этого разработка алгоритма индивидуального подбора пробиотиков.
<2Г Ж Ж ^ ^ «
J? У ^ лГ ^ ^ /
* f / / s s * / *
ч # <ь-
V <ъ
V
</
* р < 0,05 по сравнению с контролем антагонистической активности.
Влияние штаммов-пробиотиков на антагонистическую активность автохтонной Lactobacillus sp.
В работе были использованы штаммы-пробиотики Escherichia coli (колибакте-рин, «Микроген», Россия), L. acidophilus (аципол, «Лекко», Россия), L. acidophilus (экофемин, «Фарма-Винчи А/С», Дания), L. plantarum (лактобактерин, «Микроген», Россия), Bifidobacterium bifidum (бифидум-бактерин, «Партнер», Россия), В. longum (бифиформ, «Ферросан А/С», Дания), Enterococcus faecium (бифиформ, «Ферросан А/С», Дания), Bacillus subtilis (споробак-терин, «Бакорен», Россия), Saccharomyces boulardii (энтерол, «Биокодекс», Франция). Автохтонный представитель микрофлоры человека — Lactobacillus sp., выделенный из вагинального биотопа и идентифицированный до рода общепринятыми методами по Берджи. Тест-культура — Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р.
Культивирование всех микроорганизмов проводилось в микроаэрофильных условиях при 370С 20 — 24 часа на среде Манна — Рогоза — Шарпа (МРС, «HiMedia», Индия). Бифидобактерии культивировали на среде МРС при 370С 72 часа в анаэробных условиях с использованием «GasPakPlus» («Becton Dickinson», США).
Для оценки биосовместимости штаммов-пробиотиков с автохтонными лактобактериями, а также оценки их антагонистической активности в отношении патогена S. aureus использовали чашечный метод
© 51 «Казанский мед. ж.», № 6.
прямого антагонизма или сокультивирова-ния в агаре. Активность выражали в миллиметрах радиуса зоны задержки роста тест-культуры. Изменения антимикробных и ростовых характеристик бактерий при межмикробных отношениях изучали оригинальным методом (Бухарин О.В., патент РФ №2376381 от 20.12.2009 г.), основанным на исследовании свойств антагониста, обработанного метаболитами культуры-регулятора. Антагонизм клеточных компонентов исследуемых штаммов-регуляторов исключали. Метаболиты получали центрифугированием культуральной жидкости при 3000g 20 минут, стерилизовали фильтрованием (0,30 мкм, «МПНроге»). Антагонизм выражали в процентах угнетения прироста колониеобразующих единиц (КОЕ) индикаторной культуры при инкубации с метаболитами антагониста по сравнению с приростом КОЕ культуры при влиянии среды роста антагониста (бактерицидность за 1,5 часа инкубации). Ростовые свойства оценивали по приросту оптической плотности культуры-антагониста, измеренной при 492 нм в стандартных, 96-луночных планшетах.
Все эксперименты проводились в двух сериях при трехкратном воспроизведении. Результаты обрабатывали с использованием ^критерия Фишера — Стьюдента и представляли в виде средней арифметической и
Т| Теоретическая и клиническая медицина____________________________
Модель пробиотикограммы пациента
Степень эффективности Антагонизм к патогену Антагонизм пробиотика к доминантой нормофлоре Антагонизм доминантой нормофлоры к пробиотку Стимуляции антагонизма доминантой нормофлоры Назначаемый пробиотик
высокая + + - - + Бифиформ E. faecium B. longum
+ +/- - + Экофемин
+/- - - + Энтерол
средняя + - + + Бифидумбак терин
+ - +/- ингибирование Аципол
низкая + + +/- - Лактобактерин
+ + +/- ингибирование Споробактерин
- - + - Колибактерин
Примечание: «+» наличие эффекта, «-» отсутствие эффекта, «+/-» слабо выраженный эффект. В скобках указаны особенности влияния микроорганизма.
её ошибки (М+m). В качестве максимально допустимого использовали уровень значимости р<0,05.
На первом этапе оценивали антагонистическую активность исследуемых бактерий в отношении выбранной тест-культуры — S. aureus. Чашечным методом прямого антагонизма было выяснено, что все штаммы являются антагонистами, за исключением E. coli. По силе активности культуры можно расположить в следующем порядке: L. plantarum (7 мм), E. faecium (5 мм), B. longum, (5 мм), L. acidophilus «Аципол» (4 мм), B. subtilis (3 мм), B. bifidum (3 мм), L. acidophilus «Экофемин» (1 мм). S. bou-lardii обладал слабо выраженной активностью, наличие которой обозначено далее как (+/-).
На втором этапе оценивали биосовместимость автохтонной Lactobacillus sp. с выбранными пробиотиками. В результате было установлено, что индигенные лактобациллы угнетают развитие штаммов-пробиотиков E. coli (7 мм), B. bifidum (3 мм), L. plantarum (+/-), B. subtilis (+/-), L. acidophilus «Аципол» (+/-), но не S. bou-lardii, L. acidophilus «Экофемин», B. longum и E. faecium. Вместе с тем задержку роста Lactobacillus sp. вызывают штаммы-пробиотики B. subtilis (2 мм), L. plantarum (2 мм) и L. acidophilus «Экофемин» (+/-). Таким образом, индигеннный штамм лактобактерий биосовместим со штаммами-пробиотиками
S. boulardii, B. longum и E. faecium «Бифи-форм» с L. acidophilus «Экофемин».
На третьем этапе изучали изменение антимикробных и ростовых свойств исследуемых микроорганизмов в условиях меж-микробных отношений. Оказалось, что антагонизм автохтонной Lactobacillus sp. стимулировали изученные L. acidophilus «Экофемин», E. faecium и S. boulardii, ингибировали L. acidophilus «Аципол» и B. subtilis; остальные штаммы-пробиотики обладали индифферентным действием (см. рис.). Исследуемые пробиотические микроорганизмы задерживали прирост индиген-ного штамма лактобацилл, за исключением E. coli и S. boulardii, которые стимулировали прирост антагониста на 5,0±2,0%. Вместе с тем автохтонный штамм Lactobacillus sp. стимулировал антагонистическую активность L. acidophilus «Экофемин» с 23,0+3,0% в контроле до 36,5+0,5% в опыте и B. bifidum с 35,0+1,0 до 47,5+1,5 %, снижал активность E. faecium с 55,5+0,5 до 40,5+4,5% (для всех р<0,05). При изучении влияния на антагонизм других штаммов-пробиотиков достоверных отличий не выявлено. Индиген-ный штамм лактобацилл незначительно, в пределах 5 — 5%, задерживал развитие изученных штаммов-пробиотиков, за исключением E. coli и B. subtilis, рост которых полностью ингибировался.
Полученные результаты демонстрируют, что штаммы-пробиотики вступают с
автохтонными бактериями и патогенами в разные взаимоотношения, результат которых может отражаться на лечебном эффекте препарата. Оптимально подобранный пробиотик должен обладать следующими качествами: 1) антагонистической активностью к патогенам индивидуума; 2) быть биосовместимым, т.е. не должен выражен-но угнетать развитие нормофлоры индивидуума и сам не подвергаться антагонизму со стороны нормальной микрофлоры; 3) стимулировать антагонизм и/или ростовые свойства нормальной микрофлоры индивидуума. Определение данных свойств с последующим отбором препарата, штаммы которого обладают максимальным набором и/или выраженностью указанных признаков, составляет алгоритм индивидуального подбора пробиотиков. Например, в нашей искусственно созданной модели «автохтонный доминант Lactobacillus sp. — патоген S. aureus» оптимальным было бы применение бифиформа и экофемина, так как они наиболее полно отвечают означенным выше критериям. Также антагонизм L. acidophilus «Экофемин» усиливается под действием индигенной лактобациллы, и препарат, согласно инструкции, рекомендован для нормализации микрофлоры влагалища. Данные результаты применимы только к изученной ассоциации, и подбор препарата в каждом случае необходимо проводить отдельно. Предложенный алгоритм позволяет определять очередность назначения пробиотиков и составлять пробиотикограмму пациента, которая будет являться ключом для выбора назначаемого препарата (см. табл.).
Согласно предложенным критериям, предпочтительным для назначения будет препарат, штаммы которого угнетают развитие патогена, биосовместимы с доминантной микрофлорой индивидуума и усиливают её защитные свойства. Этим требованиям в нашем случае отвечают би-фиформ и экофемин. Однако штаммов-пробиотиков с таким набором свойств может не оказаться. Во вторую очередь, предпочтение следует отдавать, вероятно, тому пробиотику, который обладает антагонизмом к патогену и/или стимулирует защитные свойства нормофлоры, даже если он не является биосовместимым, потому что эффекторами являются клеточные компоненты, которые останутся в биотопе и после гибели
микроорганизма.Так, данными свойствами обладали энтерол и бифидумбактерин. Наименее эффективными могут оказаться не-биосовместимые пробиотики, ингибирующие антимикробные свойства автохтонной флоры и обладающие слабой антагонистической активностью в отношении патогена, как это было показано для штаммов-пробиотиков из препаратов колибактерина, аци-пола, лактобактерина и споробактерина. Конечно, перечень потенциальных взаимодействий гораздо шире. Штамм-пробиотик может стимулировать ростовые и антимикробные свойства патогена, инфект может ингибировать активность антагонистов и т.д. На наш взгляд, с позиций микробной экологии, выбранных критериев достаточно для обеспечения положительного результата пробиотикотерапии, однако необходимо подтверждение гипотезы in vivo.
ВЫВОД
Результаты изучения особенностей меж-микробных отношений между пробиотическими и автохтонными микроорганизмами позволили предложить алгоритм индивидуального подбора пробиотиков, заключающийся в определении у пробиотического штамма антагонистической активности к патогену, биосовместимости с нормофло-рой, способности стимулировать анатаго-низм и/или ростовые свойства нормофлоры индивидуума с последующим отбором препарата, штаммы которого обладают максимальным набором и/или выраженностью указанных признаков.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бухарин О. В., Семенов А. В., Черкасов С. В. Характеристика антагонистической активности пробиотических бактерий при их взаимодействии // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. — 2010. — Т. 12, № 4. — С. 347 — 352.
2. Гончар Н.В., Березина Л.В., Тихомирова О.В. Выбор пробиотика для рациональной терапии клебсиеллез-ной инфекции у детей // Журн. микробиол. — 2009. — №2. — С. 85 — 89.
3. Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro // Журн. микробиол. — 2005. — №2. — С. 56 — 61.
4. Семенов А.В., Черкасов С.В. Влияние ассоциативных микроорганизмов на антагонистическую активность бактерий //Вестн. Новосиб. гос. ун-та. Серия: Биол. клин .мед. — 2001. — Т. 9. — №3. — С. 20 — 26.
