CC BY
32УДК 633.63:632.38
http//doi.org/10.24411/2413-5518-2020-10308
Выявление устойчивых к корневым гнилям образцов сахарной свёклы с помощью технологии ДНК-маркирования
С.В. МАЙСЕНЯ, зав. селекционно-семеноводческим комплексом РУП «Опытная научная станция по сахарной свёкле» (e-mail: [email protected])
Л.В. МОЖАРОВСКАЯ, научн. сотр. лаборатории геномных исследований и биоинформатики С.В. ПАНТЕЛЕЕВ, канд. биолог. наук, ст. научн. сотр. лаборатории геномных исследований и биоинформатики О.Ю. БАРАНОВ, д-р биолог. наук, доцент, зав. лабораторией геномных исследований и биоинформатики (e-mail: [email protected]) ГНУ «Институт леса НАН Беларуси»
Введение
Сахарная свёкла является одной из главных стратегических сельскохозяйственных культур в мире, и рентабельность её выращивания во многом зависит от эффективности противодействия неблагоприятным абиотическим факторам, среди которых доминирующее положение занимают вредители и инфекционные болезни. Корневые гнили представляют собой группу широко распространённых и экономически значимых заболеваний сахарной свёклы, способных поражать растения на различных стадиях онтогенеза. В качестве инфекционных агентов, как правило, выступают почвообитающие микромицеты, принадлежащие к родам Rhizoctonia, Fusarium, Phoma, Crinipellis, Botiytis, Penieillium, Rhizopus. Применительно к агроклиматическим условиям Беларуси среди возбудителей корневых гнилей сахарной свёклы наибольшее распространение получили фитопатогенные грибы Rhizoctonia spp. и Fusarium spp.
Rhizoctonia solani Kuhn. представляет собой видовой комплекс близкородственных почвообитающих ми-кромицетов, способных вызывать ризоктониальную и корончатую гнили (ризоктониоз) сахарной свёклы. Данный патоген встречается повсеместно и в местах произрастания культуры может представлять собой значимый фактор, определяющий потерю урожая [1]. По литературным данным, среднестатистическая гибель растений от ризоктониоза составляет около 2 %. В то же время в случае формирования неблагоприятного инфекционного фона потеря урожая может колебаться от 30 до 60 %, а в отдельных случаях принимать характер эпифитотий. Развитие данного заболевания наиболее интенсивно происходит при диапазоне температур (22—35 °С) в сочетании с повышенной влажностью почвы. Кроме взрослых растений Rh. solani может активно поражать сеянцы, что выражается преимущественно в форме их послевсходового полегания, но
также способна вызывать гибель прорастающих семян сахарной свёклы на довсходовой стадии [1].
Fusarium oxysporum Schlect. emend. Snyd. & Hans. — большой и очень разнообразный комплекс морфологически сходных анаморфных грибов с множественным филогенетическим происхождением, поражающий широкий спектр сельскохозяйственных растений и приводящий к значительным количественным и качественным потерям мирового урожая [2]. Грибы видового комплекса F. oxysporum вызывают у сахарной свёклы не только корневую гниль, но и пожелтение и увядание листьев, что значительно повышает вредоносность данного возбудителя. Кроме того, микроми-цеты рода Fusarium являются продуцентами широкого спектра вторичных метаболитов, характеризующихся токсическими свойствами не только по отношению к растениям, но и к животным организмам, включая человека. Таким образом, вредоносность фузариоза связана не только с потерей урожая, но и с загрязнением токсинами сельскохозяйственной продукции, употребление которой может явиться причиной ослабления иммунной системы или фактором, определяющим возникновения онкопатологий [3, 4].
Кроме совершенствования химических и биологических средств защиты растений большое значение в борьбе с корневыми гнилями сахарной свёклы имеет селекционная работа, направленная на создание сортов, гибридов и линий с повышенной резистентностью к фитопатогенам. Исходя из того, что признак резистентности зачастую имеет полигенную детерминацию, проведение селекционного отбора, как правило, должно осуществляться с использованием комплексных критериев. Одним из способов молекулярно-гене-тического скрининга селектируемых форм и образцов является сравнительный анализ морфофизиологиче-ского состояния растений и структуры их эндофитно-го микробиома в условиях явно выраженного инфек-
ционного фона. При этом инфицированные растения без признаков болезни относят к толерантной группе, а в случае отсутствия и биологического материала патогенов данные образцы определяются как резистентные.
Исходя из вышесказанного, целью данной работы являлось проведение молекулярно-фитопатологиче-ского анализа растений в условиях искусственного инфекционного фона Rhizoctonia spp. и Fusarium spp. для последующего отбора форм по признаку резистентности к корневым гнилям.
Объекты исследования — мужскостерильные формы, закрепители стерильности, многосемянные опылители, межвидовые гибриды, гибриды сахарной свёклы.
Условия и методика проведения исследований
На первом этапе исследований был проведён отбор вирулентных изолятов, вызывающих гибель культур сахарной свёклы в полевых условиях. Для этого в выявляемых очагах корневой гнили сахарной свёклы производилась оценка вредоносности инфекции и отбирался биологический материал (инфицированные ткани корнеплодов) в целях последующей верификации возбудителей болезни и создания чистых культур фитопатогенных микромицетов F. oxysporum и Rh. solani.
Для создания культур in vitro была использована картофельно-глюкозная агаровая питательная среда. Верификация видовой принадлежности изолятов к F. oxysporum (рис. 1) и Rh. solani (рис. 2) подтверждалась как микробиологическими, так и молекулярно-генетическими методами. Инокулюм фитопатоген-ных грибов приготавливали в стерильных условиях на основе автоклавированных зёрен ячменя, на которую высевали суспензию культур F. oxysporum и Rh. solani. С целью получения гомогенной структуры инокулю-ма заражённый субстрат регулярно встряхивали. После окончательного обрастания субстрата грибницей (рис. 3, 4) инфицированное зерно рассыпали тонким (до 3 см) слоем и просушивали на воздухе. В фазу 5—6 пар настоящих листьев заражённое зерно раскладывали под каждый корнеплод для инициирования про-
Рис. 3. Внешний вид инокулюма Fusarium oxysporum
Рис. 4. Внешний вид инокулюма Rhizoctonia solani
Рис. 1. Чистая культура Fusarium oxysporum
Рис. 2. Чистая культура Rhizoctonia solani
цесса заражения. В течение вегетационного периода влажность почвы выдерживали на уровне 80 % путём орошения.
В ходе исследований была разработана система оценки уровня заражённости образцов исследуемых линий сахарной свёклы фитопатогенными грибами методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Для этого проводился сравнительный анализ титра видоспецифических локусов фитопатогенных грибов Rh. solani (Rs2.1, праймеры для амплификации F: GTTGTAGCTGGCCCATTC', R: GGTGTGAA-GCTGCAAAAG) и F. oxysporum (FORI, праймеры для амплификации F: CGCCAATCAATTTGAGGAACG, R: ACATACCACTTGTTGCCTCG) по отношению к ДНК сахарной свёклы (MS0235, праймеры для амплификации F: AATGCCGTTAGATTTCCC, R: ACAAACATTGGACGATGC; MS0246, праймеры для амплификации F: TCAAACGGACCAAACACT, R: GAGGAAACAAACTTGGGAA).
Кроме данных локусов был использован универсальный ДНК-маркер, позволяющий выявлять грибную инфекцию в растительных образцах — участок оперо-на рибосомальной ДНК (ITS1F-ITS4), включающий в себя фрагмент гена 18S рРНК, внутренний транскрибируемый спейсер (ВТС) 1, ген 5,8S рРНК, ВТС 2 и фрагмент гена 28S рРНК (праймеры для амплификации ITS1F: CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA, ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC).
Оценка устойчивости образцов сахарной свёклы определялась по следующим показателям: нормализованный титр (количество копий) ДНК фитопато-гена в диагностируемом образце (определятся в ходе количественной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)) и условный балл заражённости, полученный в результате денситометрического анализа ампли-конов на электрофореграммах (от 1 до 5; 1 — продукт амплификации не выявлен).
50 САХАР № 3 • 2020
Результаты исследований и их обсуждение
В ходе проведённых исследований анализу было подвергнуто 300 образцов 24 линий сахарной свёклы, из них 155 образцов были заражены микромицетом Rh. solani, 145 — F. oxysporum. Полученные данные относительно присутствия эндогенной инфекции в исследуемых образцах линий сахарной свёклы проанализированы и обобщены в сводной таблице.
Как следует из таблицы, наименьшие средние значения условного балла заражённости по отношению к ризоктониозу наблюдались у образцов МС 336-2, ОП 336, МС 223-2, МС 2/358,12 (1,0; 1,4; 1,4; 1,2 соответственно).
Повышенной устойчивостью к фузариозу обладали образцы Полибел, Р1 634210, МС 223-2, МС 336-2. Их усреднённый условный балл заражённости составил 2,2; 2,3; 2,4; 2,6; а среднее количество копий ДНК фитопатогена — 17 294, 19 055, 16 725, 20 253 соответственно. Стоит отметить, что во всех образцах титр фу-зариоза в абсолютных числах выше, чем ризоктониоза.
По результатам анализа общего грибного спектра (маркерный локус рДНК) было установлено, что практически во всех образцах имелись дополнительные
Данные результатов молекулярно-фитопатологического анализа образцов сахарной свёклы
Племенное обозначение Rhizoctonia sp. Fusarium sp.
Средний условный балл заражённости Среднее количество копий ДНК фитопатогена Средний условный балл заражённости Среднее количество копий ДНК фитопатогена
ММ 663871 2,3 4 085 3,4 29 580
ММ 663872 2,3 4 543 3,0 2 456
PI 574626 2,4 5 198 4,4 34 902
PI 574625 2,4 5 464 3,0 24 201
PI 634210 2,2 4 770 2,3 19 055
PI 594911 2,4 4 993 3,0 24 810
PI 594910 2,0 3 453 3,0 24 804
PI 590844 1,8 2 179 2,8 22 310
PI 590843 1,6 2 005 2,8 22 357
Полибел 1,8 3 116 2,2 17 294
Белполь 1,6 1 738 3,0 28 644
МС 333-3 1,6 2 073 3,0 23 574
ОП 222-2 1,6 1 652 3,2 26 398
МС 223-2 1,4 892 2,4 16 725
МС 336-2 1,0 95 2,6 20 253
ОП 336 1,4 932 3,0 25 259
1/603,2716 1,6 1 539 3,0 26 119
МС 2/358,8 2,0 3 062 3,0 24 362
МС 2/358,10 1,8 2 177 2,6 21 246
МС 2/358,12 1,2 539 3,2 27 499
ОП 1/603,17 2,4 5 687 3,4 26 832
Янаш СУГ 1,8 3 194 2,8 22 685
М080 195/89 2,0 4 183 2,8 23 199
Си Апель 1,8 2 915 3,0 24 617
фракции. Это свидетельствовало о том, что инфекция носила смешанный характер и в процессе инфицирования растений сахарной свёклы принимали участие не только ризоктония и фузариум, но и другие микро-мицеты. В ходе выборочного секвенирования смешанных образцов было установлено, что доминирующим видом в инфицированных корнеплодах являлся ми-кромицет из порядка Гелоциевые, не имеющий микологического описания (идентифициованная нуклео-тидная последовательность данного гриба была депонирована в международной генетической базе данных GenBank NCBI под номером MT160413).
Стоит также отметить, что для образцов сахарной свёклы, обладающих повышенной устойчивостью к ризоктониозу и фузариозу, также характерны невысокие средние баллы заражённости другими грибами. Возможно, это связано с тем, что данные растения обладают общей системной устойчивостью к грибной инфекции.
Заключение
По полученным данным были выделены три односемянные линии сахарной свёклы (МС 336-2, МС 223-2, ОП 336), устойчивые к корневым гнилям, для которых составлены мультилокусные генетические паспорта с использованием RAPD- и SSR-маркеров.
Список литературы
1. Neher, O.T. Rhizoctonia on Sugar Beet: Importance, Identification and Control in the Northwest / O.T. Neher, J.J. Gallian [Electronic resource]. Available at: https://www.cals. uidaho.edu/edcomm/pdf/PNW/PNW629.pdf (date of access: 24.11.2016).
2. Occurrence of Fusarium species and mycotoxins in Nepalese maize and wheat and the effect of traditional processing methods on mycotoxin levels / A.E. Desjardins [et al.] // Journal of Agricultural and Food Chemistry. — 2000. — V. 48(4). — P. 1377-1383.
3. The use of species-specific PCR-based assays to analyse Fusarium ear blight of wheat / F. M. Doohan [et al.] // Plant pathology. - 1998. - V. 47(2). - P. 197-205.
4. Agonistic and antagonistic effects of zearalenone, an etrogenicmycotoxin, on SKN, HHUA, and HepG2 human cancer cell lines / G. S. Withanage [et al.] // Veterinary and human toxicology. - 2001. - V. 43(1). - P. 6-10.
Аннотация. Представлены результаты ДНК-анализа селекционных образцов сахарной свёклы на предмет устойчивости к ризоктониозной и фузариозной гнилям. Установлены селекционные образцы, характеризующиеся повышенной устойчивостью к корневым гнилям. Ключевые слова: полимеразно-цепная реакция (ПЦР), праймеры, сахарная свёкла, ризоктониоз, фузариоз. Summary. The results of DNA analysis of breeding samples of sugar beet for the identification of resistance trait to Rhizoctonia and Fusarium rot are presented. Resistant samples to root rot were identified.
Keywords: polymerase chain reaction (PCR), primers, sugar beet. Rhizoctonia spp., Fusarium spp.
