Выявление клеток памяти у ежегодно ревакцинируемых доноров вакциной сибиреязвенной живой

Фирстова В.В.; Карцева А.С.; Силкина М.В.; Марьин М.А.; Мунтян Я.О.; Рябко А.К.; Шемякин И.Г.

Original articles

Оригинальные статьи

Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet Инфекция и иммунитет

2019, vol. 9, no. 3-4, pp. 495-503 2019, Т. 9, № 3-4, с. 495-503

ВЫЯВЛЕНИЕ КЛЕТОК ПАМЯТИ У ЕЖЕГОДНО РЕВАКЦИНИРУЕМЫХ ДОНОРОВ ВАКЦИНОЙ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ЖИВОЙ

В.В. Фирстова, А.С. Карцева, М.В. Силкина, М.А. Марьин, Я.О. Мунтян, А.К. Рябко, И.Г. Шемякин

ФБУНГосударственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, п. Оболенск, Россия

Резюме. Вакцина сибиреязвеная живая сухая используется для проведения вакцинопрофилактки в России и странах ближнего зарубежья уже в течение нескольких десятилетий. В статье приведены данные об уровне антител к протективному антигену (ПА) и летальному фактору (ЛФ) у многократно вакцинированных доноров в ранние сроки (5—8 сутки) и через 1 месяц после плановой ревакцинации. Проанализировано наличие специфических клеток памяти в крови у доноров после предыдущих вакцинаций. У всех людей через 1 год после иммунизации живой сибиреязвенной вакциной сохраняются Т-лимфоциты памяти. Результаты исследований показали, что на 5—8 сутки после плановой ежегодной ревакцинации в крови у большинства доноров происходило нарастание эффекторных Т-клеток памяти с фенотипом CD3+CD45RO+CD62L-. Максимальное увеличение эффекторных Т-клеток памяти в крови наблюдали на 7 сутки, когда количество данной субпопуляции увеличивалось в 2 раза по сравнению с контрольной группой доноров. Количество центральных Т-лимфоцитов памяти в крови в ранние сроки после вакцинации не увеличивалось, но внутри этой субпопуляции возрастало количество активированных CD3+CD45RO+CD62L+HLA-DR+ центральных клеток памяти. Выявили также увеличение содержания активированных CD3+CD45RO+CD62L-HLA-DR+ клеток в субпопуляции эффекторных клеток памяти. У половины доноров на 5—8 сутки после плановой ежегодной ревакцинации в сыворотке крови были выявлены антитела класса IgG к ПА и у одного донора — к ЛФ. Быстрое нарастание IgG специфических иммуноглобулинов в крови свидетельствует о сохранении В-лимфоцитов памяти в крови доноров после предыдущей вакцинации. Достоверного увеличения количества CD19+CD27+ лимфоцитов памяти в крови людей после их вакцинации против сибирской язвы обнаружено не было, но прослеживалась тенденция к увеличению количества CD19+CD27+ клеток памяти в крови на 5—8 сутки после вакцинации против сибирской язвы. После вакцинации на 5—8 сутки иммуногенеза активировалась как субпопуляция Т-хелперов, так и субпопуляция цитотоксических лимфоцитов, на поверхности которых усиливалась экспрессия CD69 и/или CD25 молекул. Т-хелперы усиливали экспрессию преимущественно CD25 молекулы, что отражает их высокую пролиферативную активность, а цитотоксические лимфоциты — CD69 молекулу, появление которой свидетельствует об усилении функциональной активности клеток. Наличие антител к ПА коррелирует с защитой организма от сибиреязвенной инфекции, что подтверждено в ряде экспериментов на животных моделях. К сожалению, уровень антител к ПА в крови людей быстро снижается

Адрес для переписки:

Карцева Алена Сергеевна

142279, Россия, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск, ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии. Тел.: 8 (4967) 31-20-84. Факс: 8 (4967) 36-00-10. E-mail: [email protected]

Библиографическое описание:

Фирстова В.В., Карцева А.С., Силкина М.В., Марьин М.А., Мунтян Я.О., Рябко А.К., Шемякин И.Г Выявление клеток памяти у ежегодно ревакцинируемых доноров вакциной сибиреязвенной живой // Инфекция и иммунитет. 2019. Т. 9, № 3-4. С. 495-503. Со1: 10.15789/2220-7619-2019-3-4-495-503

Contacts:

Alena S. Kartseva

142279, Russian Federation, Moscow Region, Serpukhov District, Obolensk, State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology.

Phone: +7 (4967) 31-20-84. Fax: +7 (4967) 36-00-10. E-mail: [email protected]

Citation:

Firstova V.V., Kartseva A.S., Silkina M.V., Marin M.A., Muntian Ia.O., Ryabko A. K., Shemyakin I.G. Detecting specific memory T and B cells in volunteers annually revaccinated with live anthrax vaccine // Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2019, vol. 9, no. 3-4, pp. 495-503. doi: 10.15789/2220-7619-2019-3-4-495-503

после вакцинации. Выявленная нами способность В-лимфоцитов памяти быстро запускать синтез специфических антител в ответ на ревакцинацию позволяет предположить возможность оценки противосибиреяз-венного иммунитета по наличию В- и Т-клеток памяти в крови.

Ключевые слова: клетки памяти, сибирская язва, проточная цитометрия, вакцина, антитела, протективный антиген, летальный фактор.

DETECTING SPECIFIC MEMORY T AND B CELLS IN VOLUNTEERS ANNUALLY REVACCINATED WITH LIVE ANTHRAX VACCINE

Firstova V.V., Kartseva A.S., Silkina M.V., Marin M.A., Muntian Ia.O., Ryabko A.K., Shemyakin I.G.

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russian Federation

Abstract. Currently, live anthrax vaccine has been used for vaccine prophylaxis in Russia and neighbor countries for several decades, but precise mechanism of post-vaccination protection mechanism remains unclear. Here, we provide data on examining serum antibody level against protective antigen (PA) and lethal factor (LF) in repeatedly vaccinated volunteers at early stage (5—8 days) and 1 month after the performing pre-scheduled annual revaccination. Amount of peripheral blood antigen-specific memory T cells after previous vaccinations was analyzed. It was showed that frequency of CD3+CD45RO+CD62L- memory effector T cells was increased in the majority of volunteers on day 5-8 day after performing pre-scheduled annual revaccination that peaked at day 7 by elevating it by 2-fold compared with the control group. Percentage of anthrax-specific central memory T cells did not increase at early stage after vaccination, whereas amount of activated CD3+CD45RO+CD62L+HLA-DR+ subset within this memory T cell population was increased. Likewise, percentage of activated CD3+CD45RO+CD62L-HLA-DR+ effector memory T cell subset was also increased. Moreover, serum anti-PA IgG were detected on day 5—8 day after pre-sched-uled annual revaccination in half of volunteers, whereas anti-LF IgG were found only in a single volunteer. Rapidly elevated amount of serum anthrax-specific IgG antibodies evidences about sustained memory B cell response in peripheral blood samples in volunteers after pre-scheduled annual revaccination. However, percentage of CD19+CD27+ memory B cells was not significantly elevated at early stage after revaccination that tended to increase. Both helper and cytotoxic T cell subsets were activated on day 5—8 after revaccination revealed by upregulated expression of CD69 and/or CD25 markers, with the latter predominantly found on helper T cells, thereby accounting for their high proliferative activity, whereas the former — on cytotoxic T cell subsets. Detection of anti-PA IgG antibodies correlates with protection against anthrax, which was confirmed in animal models. Unfortunately, the level of serum anti-PA IgG antibodies rapidly declines after vaccination. Ability of memory B cells to rapidly trigger production of anthrax-specific antibodies in response to revaccination suggests that anti-anthrax immunity may be evaluated by measuring frequency of peripheral blood anthrax-specific memory B and T cells.

Key words: memory cells, anthrax, flow cytometry, vaccine, antibodies, lethal toxin, protective antigen.

Введение

Сибирская язва относится к особо опасной инфекции, вызываемой грамположительны-ми спорообразующими бактериями Bacillus anthracis. Для специфической профилактики сибирской язвы в России и странах ближнего зарубежья используют вакцину сибиреязвенную живую сухую. Вакцинация живой сибиреязвенной вакциной по профилактическим показаниям осуществляется ежегодно. После иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой у 13% людей специфические антитела не выявляются, и их уровень быстро падает: через 9 месяцев 95% вакцинированных являются серонегативными. Данные ретроспективного анализа показали, что после первой вакцинации против сибирской язвы положительный антраксиновый тест выявлялся у 89—90% людей, после двух-трех вакцинаций — у 87%, а после 4 и более — у 29—32% вакцинированных. В связи с этим возникает вопрос об эффективности многократной вакцинации [1].

В странах дальнего зарубежья для вакцино-профилактики используют химические вакцины: адсорбированную вакцину AVA — anthrax vaccine absorbed — в США и странах Западной Европы, AVP — anthrax vaccine precipitated — в Англии. Оценку иммунологической эффективности вакцинации AVA или AVP вакцинами проводят на основании выявления антител к протективному антигену (ПА) и их способности нейтрализовать летальный фактор (ЛФ). После иммунизации AVA вакциной у 17,6% вакцинированных людей не выявляются IgG антитела к ПА в ИФА, а у 30,9% серопозитивных доноров сыворотки не способны нейтрализовать летальный токсин. Аналогичные данные получены после вакцинации AVP вакциной [5].

У переболевших сибирской язвой людей специфические антитела также долго не циркулируют в крови — максимум 18 месяцев, и преимущественно это антитела к ЛФ [3].

Ряд экспериментальных исследований, проведенных на животных, свидетельствует о важности роли и Т- и В-клеточного звеньев имму-

нитета. В частности, в экспериментах на мышах и приматах была выявлена прямая корреляция между наличием в сыворотке крови токсин-нейтрализующих антител и защитой животных от летального исхода при сибиреязвенной инфекции [16]. Кроме того, у всех выживших людей после террористической атаки в 2011 г. в США в сыворотке крови были обнаружены антитела к ПА [4].

Длительные наблюдения показали, что в эндемичных районах повторная реинфекция сибирской язвой людей не случается, если в их крови циркулируют специфические CD4+ Т-клетки памяти даже при отсутствии специфических антител в сыворотке крови [2]. Исследования на морских свинках показали, что для защиты от сибирской язвы достаточно наличия пула поствакцинальных/постинфекционных специфических CD4+ T-клеток памяти [11].

При расчете сроков ревакцинации обычно выбирают усредненные данные и учитывают гетерогенность людей по силе иммунологических реакций. Это позволило нам предположить, что у части доноров через год после вакцинации еще сохраняются клетки памяти к антигенам B. anthracis. Основная ниша клеток памяти — костный мозг и лимфоидные органы. В крови специфические клетки памяти циркулируют постоянно, но в единичных количествах для возможности быстрого выявления патогена в случае его повторного проникновения в организм. При проникновении специфического антигена клетки памяти активируются и их количество увеличивается.

Цель исследования — выявить Т- и В-клетки памяти у ежегодно ревакцинируемых доноров вакциной сибиреязвенной живой.

Материалы и методы

Доноры. У 8 людей, иммунизированных вакциной сибиреязвенной живой сухой для подкожного и скарификационного применения (серия 265, Киров), на 5, 6, 7, 8 и 30 сутки брали цельную кровь в вакуумные пробирки Vacuette (Greiner Bio-One, Австрия) с лития гепарином и с активатором свертывания крови для получения сыворотки. Контрольная группа состояла из 15 доноров неиммунизированных и ранее не болевших сибирской язвой.

Выделение мононуклеарных клеток. Гепари-низированную кровь, разведенную в 2 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с 2% фе-тальной бычьей сывороткой (ФБС), наслаивали на градиент плотности Histopaque-1,077 (Sigma, США) в соотношении 1:1, центрифугировали в течении 30 мин при 400g при комнатной температуре. Отобранное опалесцирующее кольцо дважды отмывали при 250g в 10 мл ФСБ

с 2% ФБС. Осадок ресуспендировали в полной питательной среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия), содержащей 10% ФБС, 2 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), 10 мМ HEPES (Sigma, США), 25 мкМ 2-меркаптоэтанола (Sigma, США). Жизнеспособность клеток определяли в тесте с трипановым синим. Концентрацию клеточной суспензии доводили до 5 х 106 клеток/мл с помощью автоматического счетчика ТС-20 (Bio-Rad, США).

Фенотипирование лимфоцитов. Лимфоци-тарную взвесь клеток (5 х 106 кл/мл) метили моноклональными антителами: для выявления субпопуляций Т-клеток — CD45RO-FITC, CD62L-APC, HLA-DR-PE, CD3-PerCP, CD4-PE, CD25-APC, CD69-FITC, для В-клеток — CD19-APC, CD138-FITC, CD27-PC5 (все производства eBioscience, США), в течение 20 мин в темноте при температуре 20°С в соответствии с инструкцией производителя. Затем клетки отмывали в ФСБ с 2% ФБС и фиксировали 1% раствором формалина. Цитометрический анализ проводили не позднее, чем через 24 ч. Образцы анализировали на проточном цито-флюориметре FACSAria III (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (версия 8.0). В каждом образце анализировали 10 000 клеток.

Получение рекомбинантных антигенов. Нук-леотидные последовательности ПА и ЛФ были получены амплификацией соответствующих участков генома B. anthracis СТИ-1 (ГКПМ-Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ) парами прайме-ров, дополнительно содержащих сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции. Полученные фрагменты ДНК были верифицированы в вектор pET22(b)+ (Novagen, Merck, США) и экс-прессированы в переплазматическое пространство E. coli BL21(DE3), а затем очищены ме-талл-хелатной хроматографией с последующей гель-фильтрацией. Чистоту полученных рекомбинантных белков проверяли в электрофорезе в ПААГ в денатурирующих условиях по методу Лэммли. Гель окрашивали Кумасси бриллиантовым синим (R-250), молекулярную массу полученных полос сравнивали с коммерческим маркером молекулярных масс. Концентрацию определяли на спектрофотометре Smart Spec Plus (Bio-Rad, США) при длине волны 280 нм.

Определение антител к ПА и ЛФ в сыворотке крови. В лунки планшета вносили по 100 мкл раствора одного из антигенов в концентрации 0,1 мг/мл, инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°С на орбитальном шейкере. По окончании инкубации проводили трехкратную отмывку лунок планшета ФСБ раствором, содержащим 0,05% Tween-20 (ФСБ-Т). Свободные валентности пластика блокировали 5% молоком. Блокировку проводили в течение

1 ч при температуре 37°С и перемешивании, после чего троекратно отмывали с использованием ФСБ-Т. Начиная с разведения 1:25 сыворотки крови вакцинированных людей, титровали с шагом в 2 раза. Далее инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С и перемешивании на шейкере, затем троекратно отмывали ФСБ-Т. Конъюгаты античеловеческих антител с пероксидазой хрена разводили 1:5000. После инкубирования в течении 40 мин при температуре 37°С планшеты шестикратно отмывали ФСБ-Т. Во все лунки вносили по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора 3,3,5,5-тетраме-тилбензидина. Положительную реакцию оценивали по появлению окрашивания раствора в синий цвет. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл 1 M серной кислоты. Учет результатов проводили на многофункциональным планшетном анализаторе Thermo Scientific Varioskan Flash (Thermo Scientific, США) при длине волны 450 нм. В качестве отрицательного контроля брали сыворотки доноров, невакцинированных против сибирской язвы и не болевших ранее сибиреязвенной инфекцией. Положительным контролем являлась сыворотка мышей линии Balb/c в разведении 1:1000. Положительным считали результат реакции в лунках, оптическая плотность в которых превышает показатели оптической плотности отрицательных контролей не менее чем в 2 раза.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета программ Excel

2013. Оценка достоверности различия сравниваемых величин проводилась по критерию Стьюдента (t) и уровню вероятности безошибочного прогноза (P). Цитометрический анализ разных образцов проводили по одинаковому протоколу настроек компенсации и напряжения. Статистический анализ проводили в программе BD FACS Diva (версия 8.0).

Результаты

Определение антител к ПА и ЛФ. У всех людей, вакцинированных 1 год назад против сибирской язвы в сыворотках крови не были выявлены антитела к ПА и ЛФ (данные не представлены). На 5—8 сутки после плановой ежегодной ревакцинации у четверых из восьми доноров в сыворотках крови были выявлены антитела к ПА. Все серопозитивные доноры были ранее многократно (10—20 раз) вакцинированы против сибирской язвы. Титры антител к ПА варьировали в пределах от 1:50 до 1:400. Серонегативные доноры иммунизировались вакциной живой сибиреязвенной сухой также многократно, а один их них во второй раз. Антитела к ЛФ были выявлены только у одного многократно вакцинированного донора, кровь которого взяли на исследование на 7 сутки после вакцинации (рис. 1).

На 30 сутки после иммунизации у всех доноров в сыворотке крови были выявлены антитела к ПА и у 6 из 8 — антитела к ЛФ. Уровень антител к ПА варьировал от 1:400 до 1600, к ЛФ — от 1:200 до 1:800 (рис. 2).

о ю м-

-i о Í* 8

н £

О со

g 5

к ^ 2 g

¥ H S о

4

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5

25 50 100 200 400 800 1600 Разведение сывороток/Delution of serum

Номер донора/Сутки после вакцинации Donor number/ Day after vaccination

9-23/Control 1/5 day 2/5 day

3/6 day 4/6 day 5/7 day

6/7 day ••• 7/8 day — 8/8 day

Рисунок 1. Титры антител IgG к протективному антигену (A) и летальному фактору (Б) в сыворотке крови доноров на 5-8 сутки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой

Figure 1. Human serum IgG antibodies to protective antigen (A) and lethal factor (B) on 5-8 days after immunization with live anthrax vaccine

25 50 100 200 400 800 1600 3200 Разведение сывороток/Delution of serum

4

\ î. N

\\

. \

ЛЛ \

Tvv4

N

25 50 100 200 400 800 1600 3200 Разведение сывороток/Delution of serum

Номер донора/Сутки после вакцинации Donor number/ Day after vaccination

9-23/Control • • • 3/6 day ---6/7 day

1/5 day 4/6 day •••• 7/8 day 2/5 day .....5/7 day ---8/8 day

Рисунок 2. Титры антител IgG к протективному антигену (A) и летальному фактору (Б) в сыворотке крови доноров на 30 сутки после иммунизации вакциной живой сибиреязвенной сухой

Figure 2. Human serum IgG antibodies to protective antigen (A) and lethal factor (B) on the 30th day after immunization with live anthrax vaccine

ФенотипированиеВ-лимфоцитов. Процентное содержание СВ19+ В-лимфоцитов в мононук-леарной фракции крови доноров на 5—8 сутки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой достоверно не отличалось от значений в контрольной группе доноров и колебалось в диапазоне от 6,1 до 9,5% (табл.). Внутри популяции В-лимфоцитов содержание клеток памяти с фенотипом СВ19+СВ27+ у контрольных

доноров варьировало в пределах от 18,5 до 28,6%. На 6—7 сутки после иммунизации против сибирской язвы у вакцинированных доноров отмечалась тенденция к увеличению СВ19+СВ27+ субпопуляции (рис. 3).

Процентное содержание СВ19+СВ138+ плазматических клеток у доноров контрольной группы колебалось в диапазоне от 0,6 до 1,7%. Мы не обнаружили достоверного увеличения

Таблица. Процентное содержание В-лимфоцитов и субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови людей на 5-8 сутки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой

Table. The percentage of B-lymphocytes and subpopulations of T-lymphocytes in the peripheral blood of people 5-8 days after immunization with live anthrax vaccine

Срок после иммунизации, сутки Period after immunization, day Контроль Control 5 6 7 8

Номер донора Donor number 9-23 1 2 3 4 5 6 7 8

CD19+ 6,6-10,1 6,1 7,5 9,5 6,7 6,2 7,8 7,0 8,2

CD19CD27+ 18,5-28,6 20,9 25,3 43,5 38,5 36,4 41,2 29 34,5

CD19CD138+ 0,6-1,7 4,3 3,0 2,5 2,6 0,9 2,6 1,1 1,6

CD3+ 54,5-63,7 63,7 69,2 69,2 64,1 60,4 69,2 76,4 61,7

CD3CD4+ 28,2-49,3 56,1 57,7 42,1 34,9 46,6 35,8 48,8 46,9

CD3CD8+ 9,6-19,4 18 18 28,5 24,1 16,4 33,6 31,2 15,4

CD3CD45ROCD62L- 8,1-12,0 11,8 17,5 13,9 14,5 25,4 24,1 15,7 16,9

CD3CD45ROCD62LHLA-DR+ 2,5-14,5 10,9 7,8 10,3 9,4 15,1 12,6 14,1 16,2

CD3CD45ROCD62L+ 7,0-34,2 28,6 34,1 21,2 25,8 24 50,3 13,8 37,8

CD3CD45ROCD62LHLA-DR+ 3,5-15,0 11,6 14 16 7,7 4,4 13,5 6,2 6,7

CD3CD4CD69+ 0,2-0,8 0,2 0,8 0,9 1,9 1,4 6,8 0,3 1,5

CD3CD4CD25+ 1,6-3,1 7,3 3,5 3,9 7,4 6,2 3,9 11 6

CD3CD8CD69+ 0,3-1,8 3,8 3,2 3,9 4,3 5,7 4,3 0,5 3,1

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

CD3CD8CD25+ 0,2-0,6 2,6 1,4 0,5 1,1 1,6 1,8 0,6 0,5

-10* о 10s 10= ю* CD27 РС5-А

-10! О Ю2 10" 10*

CD27 РС5-А

Рисунок 3. Пример однопараметрических цитофлюорограмм, отражающих процентное содержание CD19+CD27+ лимфоцитов в крови донора контрольной группы (А) и вакцинированного донора (Б) на 6 сутки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой

Figure 3. Example of one-parameter cytofluorograms reflecting the percentage of CD19+ CD27+ lymphocytes in the blood of the donor of the control group (A) and the vaccinated donor (B) on the 6th day after immunization with the live anthrax vaccine

плазматических клеток в крови после вакцинации. Только у одного донора на 5 сутки количество СВ19+СВ138+ клеток увеличивалось до 4,3% (рис. 4).

Фенотипирование Т-клеток памяти. На основании дифференциальной оценки экспрессии СВ45ЯО и СВ62Ь молекул Т-клетки человека делят на эффекторные и центральные клетки памяти с фенотипами СБ3+СБ45ЯО+СБ62Ь-и СБ3+СБ45ЯО+СБ62Ь+ соответственно [14]. Многопараметрический цитофлюорометричес-кий анализ показал, что на 7 сутки после вакцинации в крови у доноров отмечалось увеличение более чем в 2 раза эффекторных Т-клеток памяти. По экспрессии маркера поздней активации — ИЬА-ВЯ — судили об активации эффекторных и центральных Т-клеток памяти. Полученные данные показали увеличение субпопуляций активированных центральных Т-клеток памяти (СБ3+СВ45ЯО+СБ62Ь+ИЬЛ-ВЯ) и эффекторных Т-клеток памяти (СВ3+ СВ45ЯО+СБ62Ь-НЬА-БЯ+) с 5 по 8 сутки после вакцинации в 2 раза и более по сравнению с контролем (рис. 5).

Выявление активированных цитотоксичес-ких лимфоцитов и Т-хелперов. По экспрессии молекул СВ69 и СВ25 определяли количество активированных клеток в субпопуляциях Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов. Во все сроки исследований после вакцинации в крови было выявлено увеличенное количество СВ3+СВ4+СВ25+ Т-хелперов и у некоторых доноров незначительное превышение содержания СВ3+СВ4+СВ69+ относительно данных контрольной группы. В субпопуляции цито-токсических лимфоцитов наблюдали увеличение СВ3+СВ8+СВ69+ клеток и менее выраженное нарастание СВ3+СВ8+СВ25+ лимфоцитов (табл.).

Обсуждение

Одними из ключевых факторов, обуславливающих иммунопатогенез сибирской язвы, являются ПА и ЛФ — субъединицы бинарного летального токсина. Летальный токсин сибирской язвы ингибирует формирование первичных реакций врожденного иммунитета, тем са-

1,4%

i CD19*CD138*

A *t....................

CD138 FITC-A

О 10! 101 10* 10'

CD138 FITC-A

Рисунок 4. Пример однопараметрических цитофлюорограмм, отражающих процентное содержание CD19+CD138+ лимфоцитов в крови донора контрольной группы (А) и вакцинированного донора (Б) на 5 сутки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой

Figure 4. Example of one-parameter cytofluorograms reflecting the percentage of CD19+CD138+ lymphocytes in the blood of the donor of the control group (A) and the vaccinated donor (B) on the 5th day after immunization with the live anthrax vaccine

мым нарушая формирование иммунного ответа. В присутствии летального токсина нарушаются презентация антигена, передачи сигналов Т-клеток и В-клеток, блокируется их пролиферация, запускается апоптоз макрофагов и дендритных клеток. Активация Т-лимфоцитов связана с появлением СВ69 и СВ25 рецепторов на поверхности клеток. Бактерии В. апШтасЫ за счет синтеза ПА и ЛФ ингибируют экспрессию активационных маркеров на поверхности В- и Т-лимфоцитов [12, 6].

Результаты наших исследований показали, что после вакцинации на 5—8 сутки иммуногенеза активируются как субпопуляция Т-хелперов, так и субпопуляция цитотокси-ческих лимфоцитов на поверхности которых усиливается экспрессия СВ69 и/или СВ25 молекул. Т-хелперы усиливали экспрессию преимущественно СВ25 молекулы, что отражает их высокую пролиферативную активность, а ци-тотоксические лимфоциты — СВ69 молекулы, появление которой свидетельствует об усилении функциональной активности клеток. Важность участия Т-лимфоцитарного звена в защите от сибиреязвенной инфекции показана в экспериментах на мышах, у которых спо-

собность Т-лимфоцитов синтезировать ^N7 СВ4+-клетками под влиянием инактивирован-ных спор В. аШИгасю коррелировала с защитой от сибиреязвенной инфекции даже в отсутствии антител [8]. Появление активированных Т-лимфоцитов в крови доноров в ответ на вакцинацию отражает формирование сибиреязвенного иммунитета, способного обеспечить защиту от последующего заражения [6, 9].

Присутствие Т-клеток, способных быстро активироваться под влиянием антигенов В. аnthrаcis, свидетельствует о наличии клеток памяти. Мы попытались выявить увеличение количества клеток памяти и/или усиление ими экспрессии маркеров активации в крови у людей на 5—8 сутки после иммунизации вакциной живой сибиреязвенной сухой. Начиная с 7 суток после вакцинации в крови доноров нарастало количество эффекторных клеток памяти (СБ3+СВ45ЯО+СБ62Ь-), которые являются ключевыми в формировании и обеспечении стремительного защитного иммунитета. Распространяясь через кровяное русло по всему организму после проникновения специфического для них антигена, эффекторные Т-клетки памяти регулируют направленность иммунных

<

6 <

о о

*

"V. . CD3*CD45RO*CD62L-12,0%

О 10! 10s 10* 10'

CD45R0 FITC-A

<

6 ь

о_ <

—I со

СМ о (О

а о

:>„ .rCD3*CD45RO*CD62L- чФ- 25,4%

О 10! 10s 10* 10'

CD45RO FITC-A

1 6,8%

I СОЗ,СР45ПО,СРе2^Н1Л-РП'

1 itta....................

О 102 10" 10* ю5 HLA-DR РЕ-А

ill 25,4%

1 CD3*CD45RO*CD62L HLA-DR*

J Ik..

10' 10* ю5 HLA-DR РЕ-А

Рисунок 5. Примеры цитофлюорограмм, отражающих процентное содержание эффекторных клеток памяти в периферической крови у донора контрольной группы (А, Б) и донора на 7 сутки после иммунизации (В, Г)

Figure 5. Examples of cytofluorograms reflecting the percentage of memory effector cells in the peripheral blood of the donor of the control group (A, B) and the donor on the 7th day after immunization (C, D) Примечание. А, Б —гистограммы распределения эффекторных клеток памяти и процент активированных внутри субпопуляции CD3+CD45RO+CD62LHLA-DR+ лимфоцитов у донора контрольной группы; В, Г — у донора после иммунизации.

Note. A, B — histograms of the distribution of memory effector cells and the percentage of activated within the subpopulation of CD3+CD45RO+CD62LHLA-DR+ lymphocytes from the donor of the control group; C, D — in the donor after immunization.

реакций, синтезируя соответствующие цито-кины. Количество центральных клеток памяти при проникновении специфического антигена может увеличиваться в лимфоидных органах, но основная их функция состоит в активации и усилении пролиферации пула эффекторных клеток памяти. Вероятно, поэтому мы не увидели увеличения в крови количества центральных клеток памяти, но обнаружили увеличение количества среди них активированных клеток, что свидетельствует о взаимодействии со специфическим для них антигеном.

Далее мы попытались выявить В-клетки памяти в крови вакцинированных доноров. По своему фенотипу и функциям В-лимфоциты гетерогенны. Наивные В-лимфоциты экспрес-сируют СВ19 и не экспрессируют СВ27 молекулу. После активации В-лимфоциты проходят антигенную дифференцировку и начинают экспрессировать СВ27 молекулу. Мы не выявили достоверного увеличения количества СВ19+СВ27+ лимфоцитов в крови людей после их вакцинации против сибирской язвы, но обнаружили тенденцию к увеличению количества В-лимфоцитов памяти в крови. Мы пытались обнаружить увеличение плазматических клеток в кровотоке. Плазматические клетки, синтезирующие антитела, являются терминальной стадией дифференцировки В-лимфоцитов. Их основное место пребывания — костный мозг и лимфоидные органы. В крови их содержание не превышает 1,5%, и их количество может увеличиваться только транзиторно при миграции в лимфоидные органы и ткани. Плазматические клетки экспрессируют СВ138 молекулу (син-декана-1) [13]. В наших исследованиях в изучаемые сроки достоверного увеличения плазматических клеток в крови выявлено не было за исключением одного донора на 5 сутки после вакцинации.

Иммуноферментный анализ сывороток на 5— 8 сутки после вакцинации позволил выявить у 4 из 8 вакцинированных доноров антитела к ПА и у одного донора — к ЛФ. Появление антител класса через 5 суток после вакци-

Список литературы/ЯеТегепсеБ

нации свидетельствует о сохранении В-клеток памяти. При наличии В-клеток памяти или плазматических клеток памяти антитела выявляются в сыворотке крови уже на 4—5 день после проникновения специфического антигена, тогда как при первичном попадании антигена в организм необходимо 7—10 дней для детектируемого накопления специфических антител в крови человека [7].

Протективный антиген и ЛФ являются Т-зависимыми антигенами. Можно предположить, что при наличии антител организм будет защищен от сибиреязвенной инфекции даже без участия Т-лимфоцитов, что было показано в экспериментах на животных [10, 16]. Если антитела в сыворотке крови не выявляются, но имеются В-клетки памяти, то для их активации необходимо участие Т-хелперов, которые должны презентировать антиген. А учитывая, что ПА и ЛФ ингибируют активацию Т-клеток, необходимо наличие Т-лимфоцитов памяти, способных активироваться под влиянием антигенов В. anthracis и презентировать антигены В-лимфоцитам.

Таким образом, в наших исследованиях было показано, что у всех людей через 1 год после иммунизации живой сибиреязвенной вакциной сохраняются Т-лимфоциты памяти. У четверых из 8 вакцинированных доноров в сыворотке крови обнаруживали антитела к ПА, начиная с 5 суток после вакцинации, что позволяет предположить о сохранении в организме В-лимфоцитов памяти, оставшихся после предыдущей вакцинации. Наличие антител к ПА коррелирует с защитой организма от сибиреязвенной инфекции, что подтверждено в ряде экспериментов на животных моделях. К сожалению, уровень антител к ПА в крови людей быстро снижается после вакцинации. Выявленная нами способность В-лимфоцитов памяти быстро запускать синтез специфических антител в ответ на ревакцинацию позволяет предположить возможность оценки про-тивосибиреязвенного иммунитета по наличию В- и Т-клеток памяти в крови.

1. Маринин Л.И., Дятлов И.А., Мокриевич А.Н., Бахтеева И.В., Белова Е.В., Борзилов А.И., Комбарова Т.И., Кравченко Т.Б., Миронова Р.И., Попова В.М., Сомов А.Н., Титарева Г.М., Тюрин Е.А., Чекан Л.В., Шишкина О.Б., Шишкова Н.А. Методы изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы. М.: ЗАО МП «Гигиена», 2009. 304 с. [Marinin L.I., Dyatlov I.A., Mokrievich A.N., Bakhteeva I.V., Belova E.V., Borzilov A.I., Kombarova T.I., Kravchenko T.B., Mironova R.I., Popova V.M., Somov A.N., Titareva G.M., Tyurin E.A., Chekan L.V., Shishkina OB, Shishkova N.A. Methods for studying the biological properties of the causative agent of anthrax. Moscow: ZAOMP«Hygiena», 2009. 304p. (In Russ.)]

2. Ascough S., Ingram R.J., Chu K.K., Reynolds C.J., Musson J.A., Doganay, M., Metan G., Ozkul Y., Baillie L., Sriskandan Sh., Moore St., Gallagher T.B., Dyson H., Williamson E.D., Robinson J.H., Maillere B., Boyton R.J., Altmann D.M. Anthrax lethal factor as an immune target in humans and transgenic mice and the impact of HLA polymorphism on CD4+ T cell immunity. PLoS Pathog, 2014, vol. 10, no. 5: e1004085. doi: 10.1371/journal.ppat.1004085

3. Brenneman K.E., Doganay M., Akmal A., Goldman S., Galloway D.R., Mateczun A.J., Cross A.S., Baillie L.W. The early humoral immune response to Bacillus anthracis toxins in patients infected with cutaneous anthrax. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2011, vol. 62, no. 2,pp. 164-72. doi: 10.1111/j.1574-695X.2011.00800.x.

4. Bush L.M., Perez M.T. The anthrax attacks 10 years later. Ann. Intern. Med, 2012, vol. 156, no. 1, pp. 41-45. doi: 10.7326/00034819-155-12-201112200-00373

5. Dumas E.K., Gross T., Larabee J., Pate L., Cuthbertson H., Charlton S., Hallis B., Engler R., Collins L.C., Spooner C.E., Chen H., Ballard J., James J.A., Farris A. Anthrax vaccine precipitated induces edema toxin-neutralizing, edema factor-specific antibodies in human recipients. Clin. Vaccine Immunol., 2017, vol. 24, no. 11: e00165-17. doi: 10.1128/cvi.00165-17

6. Fang H., Cordoba-Rodriguez R., Lankford C.S.R., Frucht D.M. Anthrax lethal toxin blocks MAPK kinase-dependent IL-2 production in CD4+ T Cells. J. Immunol., 2015, vol. 174, no. 8, pp. 4966-4971. doi: 10.4049/jimmunol.174.8.4966

7. Garman L., Smith K., Farris A., Nelson M., Engler R., James J. Protective antigen-specific memory B cells persist years after anthrax vaccination and correlate with humoral immunity. Toxins, 2014, vol. 6, no. 8, pp. 2424-2431. doi: 10.3390/toxins6082424

8. Glomski I.J., Corre J.-P., Mock M., Goossens P.L. Cutting edge: IFN-producing CD4 T lymphocytes mediate spore-induced immunity to capsulated Bacillus anthracis. J. Immunol., 2007, vol. 178, no. 5, pp. 2646-2650. doi: 10.4049/jimmunol.178.5.2646

9. Kachura M.A., Hickle C., Kell S.A., Sathe A., Calacsan C., Kiwan R., Hall B., Milley R., Ott G., Coffman R.L., Kanzler H., Campbell J.D. A CpG-ficoll nanoparticle adjuvant for anthrax protective antigen enhances immunogenicity and provides single-immunization protection against inhaled anthrax in monkeys. J. Immunol., 2015, vol. 196, no. 1, pp. 284-297. doi: 10.4049/jim-munol.1501903

10. Kobiler D., Gozes Y., Rosenberg H., Marcus D., Reuveny S., Altboum Z. Efficiency of protection of guinea pigs against infection with Bacillus anthracis spores by passive immunization. Infect. Immun., 2002, vol. 70, no. 2, pp. 544-560. doi: 10.1128/ iai. 70.2.544-550.2002

11. Marcus H., Danieli R., Epstein E., Velan B., Shafferman A., Reuveny S. Contribution of immunological memory to protective immunity conferred by a Bacillus anthracis protective antigen-based vaccine. Infect. Immun., 2004, vol. 72, no. 6, pp. 3471-3477. doi: 10.1128/IAI. 72.6.3471-3477.2004

12. Paccani S.R., Tonello F., Ghittoni R., Natale M., Muraro L., D'Elios M.M., Tang W.J., Montecucco C., Baldari C.T. Anthrax toxins suppress T lymphocyte activation by disrupting antigen receptor signaling. J. Exp. Med., 2005, vol. 201, no. 3, pp. 325-331. doi: 10.1084/jem.20041557

13. Pauli N.T., Henry Dunand C.J., Wilson P.C. Exploiting human memory B cell heterogeneity for improved vaccine efficacy. Front. Immunol., 2011, vol. 2. doi: 10.3389/fimmu.2011.00077

14. Segundo D.S., Fernandez-Fresnedo G., Gago M., Beares I., Ruiz- Criado J., Gonzalez M., Ruiz-Criado J., Gonzalez M., Ruiz J.C., Gomez-Alamillo C., Lopez-Hoyos M., Arias M. Kidney transplant recipients show an increase in the ratio of T-cell effector memory/central memory as compared to nontransplant recipients on the waiting list. Transplant. Proc., 2010, vol. 42, no. 8, pp. 2877-2879. doi: 10.1016/j.transproceed.2010.07.072

15. Sim B.K.L., Li M., Osorio M., Wu Y., Wai T.T., Peterson J.W., James E.R., Chakravarty S., Gao L., Xu R., Kc N., Stafford R.E., Lawrence W.S., Yeager L.A., Peel J.E., Sivasubramani S.K., Chopra A.K., Filippova S., Hoffman S.L. Protection against inhalation anthrax by immunization with Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a stably producing protective antigen of Bacillus anthracis. NPJ Vaccines, 2017, vol. 2, no. 1, pp. 1-7. doi: 10.1038/s41541-017-0018-4

16. Wild M.A., Xin H., Maruyama T., Nolan M.J., Calveley P.M., Malone J.D., Wallance M.R., Bowdish K.S. Human antibodies from immunized donors are protective against anthrax toxin in vivo. Nat. Biotechnol., 2003, vol. 21, no. 11, pp. 1305-1306. doi: 10.1038/nbt89

Авторы:

Фирстова В.В., д.б.н., главный научный сотрудник

лаборатории молекулярной биологии ФБУН ГНЦ прикладной

микробиологии и биотехнологии, п. Оболенск, Россия;

Карцева А.С., младший научный сотрудник лаборатории

молекулярной биологии ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии