CC BY
110
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДк 615.371:[579.842.23+579.852.11].015.4.036.8
Н.В. Богачева, А.В. Крючков, И.В. Дармов, К.А. Воробьев, Д.В. печенкин, Г.Д. Елагин, Д.п. Колесников
экспериментальная оценка методом проточной цитофлюориметрии уровня клеточной иммунологической памяти у лиц, вакцинированных против чумы и сибирской язвы
фГКУ 33-й Центральный научно-исследовательский испытательный институт минобороны России, г. Киров
Проведена экспериментальная оценка методом проточной цитофлюориметрии уровня клеточной иммунологической памяти у лиц, прививаемых чумной и сибиреязвенной живыми сухими вакцинами. В ответ на введение вакцины чумной живой сухой (ВЧЖС) и вакцины сибиреязвенной живой сухой (ВСЖС) в организме вакцинированных лиц происходит иммунологическая перестройка, которая проявляется в наличии достоверного повышения на фоне вакцинации уровня содержания в крови Thl-лимфоцитов - клеток иммунологической памяти. Определен высокий коэффициент корреляции между КЛЛ и КС по показателю уровня содержания в крови Т-лимфоцитов, преимущественно за счет Thl-лимфоцитов. Рассчитаны значения КС для соответствующих клеток крови вакцинированных лиц, которые свидетельствуют об эффективности проведения вакцинации против чумы и сибирской язвы.
Ключевые слова: проточная цитофлюориметрия, уровень клеточной иммунологической памяти, вакцина чумная живая сухая, вакцина сибиреязвенная живая сухая, коэффициент корреляции, коэффициент лизиса лейкоцитов, иммунологическая перестройка организма
N.V. Bogatcheva, A.V. Kryutchkov, I.V. Darmov, K.A. Vorobiyev, D.V. Petchenkin, G.D. Elagin, D.P. Kolesnikov
THE EXPERIMENTAL EVALUATION WITH FLOW CYTOFLUORIMETRY TECHNIQUE OF THE LEVEL OF CELLULAR IMMUNOLOGIC MEMORY IN PERSONS VACCINATED AGAINST PLAGUE AND ANTHRAX
The 33 central research testing institute of Ministry of defense of Russia, Kirov, Russia
The article deals with experimental evaluation with flow cytofluorimetry technique of the level of cellular immunologic memory in persons vaccinated with plague and anthrax live dry vaccines. It is established that the introduction of plague and anthrax live dry vaccines into organism of vaccinated persons ignites immunologic rearrangement manifested by reliable increase of level of blood concentration of Thl-lymphocytes (immunologic memory cells) against the background of vaccination. The higher correlation coefficient is detected between leucocytes lysis coefficient and stimulation coefficient according blood concentration level of T-lymphocytes predominantly at the expense of Thl-lymphocytes. The values of stimulation coefficient were calculated for corresponding blood cells of vaccinated persons. This data testifies the effectiveness of application of vaccination against plague and anthrax.
Key words: flow cytofluorimetry, level of cellular immunologic memory, plague live dry vaccine, anthrax live dry vaccine, correlation coefficient, leucocytes lysis coefficient, immunologic rearrangement of organism
Вакцинопрофилактика инфекционных болезней проводится посредством осуществления плановых прививок и прививок по эпидемическим показаниям. К плановым относятся прививки, проводимые во всех регионах страны в рамках национального календаря профилактических прививок. К прививкам по эпидемическим показаниям относятся прививки, проводимые населению, проживающему на территориях с высоким риском заражения той или иной инфекционной болезнью, а также лицам с высоким риском инфицирования, в том числе, работающим с ПБА в научно-исследовательских учреждениях Минобороны России [6, 8].
В отношении вышеперечисленных категорий лиц должен проводиться контроль эффективности вакцинации. Настоящее положение закреплено СП 1.3.1285-03 [9].
В настоящее время для отдельных бактериальных инфекций, таких как туляремия и бруцеллез, определен уровень иммунологической перестройки организма (уровень титров антител в сыворотке крови вакцинируемого; выра-
Для корреспонденции:
Богачева Наталья Викторовна, канд. мед. наук, доц., нач. группы отд. науч.-исслед.
Адрес: 610033, Киров, Октябрьский пр-т, 119 E-mail: [email protected]
женность реакции клеточного иммунитета, определяемая in vitro и in vivo), свидетельствующий об эффективности проведенной иммунизации. Имеющиеся иммунологические методы позволяют проводить комплексную оценку иммунологической перестройки организма на фоне вакцинации против соответствующих инфекций [3, 4].
Для чумы и сибирской язвы, несмотря на большой объем исследований, проведенных в данном направлении, вопрос оценки эффективности вакцинации остается открытым.
Принцип вакцинации основан на создании у людей иммунологической памяти к возбудителю инфекции. За счет вакцинации организм при последующей встрече с патогеном отвечает ускоренной и усиленной мобилизацией факторов иммунной защиты. По результатам проведенных в данном направлении исследований уровень индукции Т-клеток иммунологической памяти рассматривают как критерий эффективности проведения вакцинации [5, 10, 13]. На современном этапе развития иммунологии оценку уровня содержания в крови Т-клеток иммунологической памяти можно провести, используя проточную цитометрию.
Целью настоящей работы явилась экспериментальная оценка методом проточной цитометрии уровня клеточной иммунологической памяти у лиц, вакцинируемых по эпидемическим показаниям против чумы и сибирской язвы.
Материалы и методы. Исследование проводили на образцах крови 60 сотрудников, вакцинированных против чумы (30 проб крови) и сибирской язвы (30 проб крови). В качестве контроля использовали образцы крови невакцинированых сотрудников (24 пробы крови).
Для стимуляции лимфоцитов в условиях in vitro использовали следующие микробные культуры и антигенные препараты (производства НИЦ ФГКУ 33 ЦНИИИ Минобороны России, г. Киров): для стимуляции лимфоцитов крови лиц, вакцинированных против чумы -культуру EV чумного микроба, выращенную при 37оС и инактивированную формалином с концентрацией 1 • 108 микробных клеток/мл, Fl-антиген чумного микроба с концентрацией 100 мкг/мл; для стимуляции лимфоцитов крови лиц, вакцинированных против сибирской язвы, -протективный сибиреязвенный антиген с концентрацией 10 мкг/мл. Кровь смешивали с антигенным препаратом в соотношении 1:1 (опытная проба). В контрольную пробу к крови вместо антигенного препарата добавляли 0,9% раствор натрия хлорида. Контрольную и опытную пробы крови инкубировали в термостате в течение 2 ч при температуре 37 ± 1оС, после чего добавляли моно-клональные антитела и проводили пробоподготовку в соответствии с инструкцией по применению реагентов («Beckman Coulter», США).
Для окрашивания клеток использовали монокло-нальные антитела (МА), меченные флюорохромами («Beckman Coulter», США): CD4-APC, CD45-FITC, CD45-PC 5.5, CD62L-FITC, CD45RA-ECD, CD45RO-PE; витальный краситель - 7-AAD; для пробоподготовки -фосфатно-солевой буфер и лизирующий раствор OptiL-yse C («Beckman Coulter», США).
Перемешивание клеток крови и моноклональных антител в процессе пробоподготовки осуществляли на вортексе (ELMI, Латвия). Анализ окрашенных клеток (определение относительного содержания в крови субпопуляций лимфоцитов, выраженное в процентах) осуществляли на проточном цитофлюориметре Navios («Beckman Coulter», США).
Для оценки методом проточной цитометрии окрашенных лимфоцитов создан протокол цитометрическо-го анализа. Обязательным условием для исследования, которое заложено в протоколе, являлся анализ в каждой пробе не менее 10 000 лимфоцитов.
Параллельно с цитометрическим анализом ставили реакцию лизиса лейкоцитов.
Подсчет абсолютного количества лейкоцитов и учет результата реакции лизиса лейкоцитов проводили в камере Горяева на световом микроскопе Микмед-2 (ОАО Ло-мо, Россия).
Расчет средних значений, коэффициентов корреляции и доверительных интервалов осуществляли общепринятыми методами математической статистики [2].
Перед расчетом достоверности различий между средними арифметическими величинами, при уровне значимости 95%, проведена проверка того, что полученные экспериментальные данные подчиняются нормальному закону распределения и дисперсии выборок незначительно отличаются одна от другой. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office Excel.
Результаты и обсуждение. По экспрессии на клеточной поверхности различных изоформ молекулы CD45 разделяют три субпопуляции Т-лимфоцитов-хелперов человека (CD45+CD4+): покоящиеся наивные CD45+CD4+CD45RA+CD45R0-, активированные
- CD45+CD4+CD45RA+CD45R0+ Т-лимфоциты и покоящиеся CD45+CD4+CD45RACD45R0+ T-клетки памяти. Подобное разделение основано исключительно на способности Т-клеток памяти, а не наивных Т-лимфоцитов, интенсивно отвечать на повторный контакт с антигеном in vitro. Быстрый и усиленный ответ Т-клеток памяти на специфический антиген является их важнейшим функциональным отличием от наивных предшественников. Появление на поверхности клеток молекул CD45R0+ взамен изоформы CD45RA+ является фенотипическим признаком активированных Т-лимфоцитов и свидетельствует о дифференцировке покоящихся наивных CD45+CD4+CD45RA+CD45R0- Т-лимфоцитов человека в покоящиеся Т-клетки памяти. Все активированные CD45+CD4+CD45RA+CD45R0+ Т-лимфоциты возникают в процессе стимуляции наивных Т-клеток антигеном in vivo [7, 11, 12].
CD4+-Th1-лимфоциты являются клетками воспаления и участвуют преимущественно в клеточном иммунном ответе. CD4+-Th2-лимфоциты презентуют антиген В-лимфоцитам и определяют течение иммунного ответа по гуморальному типу. В дифференцировке Т-клеток на CD4+-Th1- и CD4+-Th2-лимфоциты принимают участие интерлейкины, определение содержания которых в крови при проведении исследований позволяет дать ответ о преобладании типа иммунного ответа на тот или иной антиген [1, 7, 14]. Содержание в крови CD4+-Th1- и CD4+-Th2- лимфоцитов можно определить по содержанию в крови лимфоцитов с фенотипом CD4+CD62L" и CD4+CD62L+ [15-18].
Учитывая приоритетную роль клеточного иммунного ответа на введение живой чумной и сибиреязвенной вакцин, принято решение провести экспериментальную оценку содержания в крови абсолютного и относительного (в процентах) количества CD45+-лимфоцитов (CD45+CD4+, CD45+CD4+CD45RA+CD45RO", CD45+CD4+ CD45RA+CD45RO+, CD45+CD4+ CD45RA-CD45RO+, CD45+CD4+cD62L+CD45RA+CD45RO-, CD45+CD4+ cD62L+CD45RA+CD45RO+, CD45+CD4+cD62L+CD45RA-CD45RO+, CD45+CD4+cD62L-CD45RA+CD45RO-, CD45+ CD4+cD62L-CD45RA+CD45RO+, CD4+cD62L-CD45RA-CD45RO+) до и после вакцинации, а также определить способность к стимуляции вышеперечисленных субпопуляций клеток специфическими антигенными препаратами в условиях in vitro.
Исследование проводили в нескольких направлениях. Одним из направлений стала оценка динамики изменения иммунологических показателей на фоне иммунизации вакциной чумной живой сухой (ВЧЖС) и вакциной сибиреязвенной живой сухой (ВСЖС). Для подтверждения специфической реакции иммунной системы в ответ на введение вакцинного препарата использовали абсолютные и относительные значения иммунологических показателей, определенные при анализе проб крови со стимуляцией антигенным препаратом до и после вакцинации. Достоверность различия содержания лимфоцитов до и после вакцинации, определенная по степени перекрытия доверительных интервалов, выявлена только в отношении относительных значений, определенных методом проточной цитометрии. Достоверность различия уровня в крови лимфоцитов (в процентах) до и после вакцинации у лиц, вакцинированных ВЧЖС, представлена в табл. 1, у лиц, вакцинированных ВСЖС, - в табл. 2.
Результаты, представленные в табл. 1 и 2, свидетельствуют о достоверной положительной динамике на фоне вакцинации ВЧЖС и ВСЖС уровня содержа-
Таблица
Достоверность различия уровня содержания в крови лимфоцитов (в %) до и по сле вакцинации у лиц, вакцинированных ВЧЖС
Клетки крови Разница (5) и доверительные интервалы (5-t S/Vn; 5 + t09J-S/Vn) для разницы уровня содержания в крови лимфоцитов при стимуляции клеток in vitro
культурой EV чумного микроба(n = 30) Р1-антигеном чумного микроба (n = 30)
Лимфоциты, в том числе с фенотипом -0,85 (-5,24; 3,55) -1,06 (-5,56; 3,54)
CD45+CD4+ -1,31 (-2,99; 0,38) -1,63 (-3,49; -0,24)
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO- -6,82 (-10,62; -3,04) -5,61 (-8,90; -2,33)
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO+ -4,77 (-5,90; -3,63) -4,04 (-5,32; -2,76)
CD45+CD4+CD45RA-CD45RO+ 11,02 (7,31; 14,73) 8,79 (5,47; 12,10)
CD45+CD4+CD62L+ -5,68 (-9,26; -2,10) -3,99 (-7,30; -0,67)
CD45+CD4+CD62L- 5,78 (2,15; 9,41) 4,07 (0,73; 7,40)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO- 1,45 (-2,34; 5,24) 1,90 (-0,16; 3,96)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO+ -3,57 (-4,75; -2,38) -5,02 (-6,15; -3,89)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA-CD45RO+ 4,07 (1,12; 7,01) 2,11 (0,27; 3,95)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO- -1,02 (-2,79; 0,75) -0,37 (-2,04; 1,31)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO+ -6,99 (-10,86; -3,11) -4,63 (-7,06; -2,21)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA-CD45RO+ 7,63 (3,35; 11,92) 3,48 (0,84; 6,12)
Примечание. Здесь и в табл. 2-4: 8 - среднее арифметическое Si (CDy), где Si - уровень содержания лимфоцитов в опытной пробе минус уровень содержания лимфоцитов в контрольной пробе; i = 1, 2, 3 и т. д. вакцинируемый; /095 = 2,05 (для числа степеней свободы и = 29); 5 - стандартное отклонение; п - количество человек в группе (п = 30). Жирным шрифтом выделены значения показателей, имеющих достоверную разницу.
ния в крови Т-лимфоцитов хелперов - клеток иммунологической памяти (CD45+CD4+CD45RA-CD45RO+). У вакцинированных ВЧЖС наиболее значимо повышается уровень Th2- и Thl-лимфоцитов иммунологической памяти (CD45+CD4+CD62L+CD45RA-CD45RO+; CD45+CD4+CD62L-CD45RA-CD45RO+), преимущественно за счет последних, что подтверждают среднегруппо-вые доверительные интервалы динамики повышения на фоне вакцинации уровня содержания в крови лимфоцитов с фенотипом CD45+CD4+cD62L-; у лиц, вакцинированных ВСЖС, отмечается достоверная положительная динамика уровня содержания в крови лимфоцитов, преимущественно Thl-лимфоцитов, иммунологической памяти (CD45+CD4+cD62L-, CD45+CD4+cD62L-CD45RA-CD45RO+).
Проведена оценка степени иммунологической перестройки организма лиц после вакцинации ВЧЖС и ВСЖС, по определению способности к стимуляции лимфоцитов в условиях in vitro соответствующими антигенными препаратами. При этом рассчитывали коэффициент стимуляции (КС) по формуле 1.
КС = (C-D)/C-100, (1)
где КС - коэффициент стимуляции лимфоцитов в условиях in vitro (в %); С - относительный (абсолютный) уровень содержания в крови популяций (субпопуляций) лимфоцитов в опытной пробе; D - относительный (абсолютный) уровень в крови популяций (субпопуляций) лимфоцитов в контрольной пробе.
Положительный коэффициент стимуляции лимфоцитов крови in vitro культурой EV чумного микроба в концентрации 1 ■ 108 м.к./мл и Fl-антигеном чумного микроба в концентрации 100 мкг/мл у лиц, вакцинированных против чумы; протективным сибиреязвенным антигеном в концентрации 10 мкг/мл у лиц, вакцинированных
1 против сибирской язвы, определен в отношении активированных Т-лимфоци-тов-хелперов (CD45+CD4+, CD45+CD4+ CD45RA+CD45RO+) в большей степени за счет активированных ТЬ2-лимфоцитов (CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO+) и Т-лимфоцитов-хелперов - клеток иммунологической памяти преимущественно за счет ТЫ-лимфоцитов (CD45+CD4+CD45RA-CD45RO+, CD45+CD4+cD62L-CD45RA-CD45RO+).
Результаты расчета среднегрупповых доверительных интервалов разницы КС клеток в опытной пробе относительно контрольной пробы подтвердили достоверность различия уровня стимуляции вышеуказанных субпопуляций лимфоцитов in vitro у лиц, вакцинированных ВЧЖС и ВСЖС (табл. 3, 4).
Коэффициент лизиса лейкоцитов (КЛЛ) является установленным критерием, который используется для оценки эффективности проведения вакцинации против опасных и особо опасных инфекций бактериальной природы. Определили коэффициент корреляции между КЛЛ и КС лимфоцитов in vitro, антигенными препаратами. Результаты определения коэффициентов корреляции между КЛЛ и КС лимфоцитов in vitro культурой EV и Fi-антигеном чумного микроба у лиц, вакцинированных ВЧЖС, протективным сибиреязвенным антигеном у лиц, вакцинированных ВСЖС, представлены соответственно в табл. 5, 6.
Представленные данные свидетельствуют о наличии положительной корреляционной связи между КЛЛ и КС
Таблица 2
Достоверность различия содержания в крови лимфоцитов (в %) до и после вакцинации у лиц, вакцинированных ВСЖС
Клетки крови Разница (5) и доверительные интервалы (S-i^-S/Vn; S+i^-S/Vn) для разницы содержания в крови лимфоцитов при стимуляции клеток in vitro протективным сибиреязвенным антигеном (n = 30)
Лимфоциты, в том числе с фенотипом -1,89 (-4,29; 0,51)
CD45+CD4+ 0,89 (-1,78; 3,56)
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO- -12,42 (-16,62; -8,22)
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO+ -3,63 (-7,97; 0,72)
CD45+CD4+CD45RA-CD45RO+ 16,27 (12,89; 19,64)
CD45+CD4+CD62L+ -4,13 (-7,73; -0,52)
CD45+CD4+CD62L- 3,84 (0,05; 7,63)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO- -3,02 (-8,42; 2,38)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO+ -1,94 (-5,62; 1,74)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA-CD45RO+ 4,77 (-0,80; 10,33)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO- -11,28 (-16,72; -5,84)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO+ -6,82 (-13,22; -0,41)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA-CD45RO+ 17,61 (9,74; 25,49)
Таблица 3
Достоверность различия КС лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы у лиц, вакцинированных ВЧЖС
Клетки крови Разница (5) и доверительные интервалы (5-t09J-S/Vn; 5+t09J-S/Vn) для разницы КС лимфоцитов in vitro
культурой EV чумного микроба (n = 30) F1-антигеном чумного микроба (n = 30)
Лимфоциты, в том числе с фенотипом -5,05 (-8,82; -1,27) -4,73 (-8,71; -0,74)
CD45+CD4+ 4,74 (1,40; 8,08) 4,84 (1,25; 8,43)
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO- -9,36 (-12,59; -6,13) -7,77 (-11,23-4,32)
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO+ 0,65 (-0,57; 1,87) 0,27 (-0,91; 1,44)
CD45+CD4+CD45RA-CD45RO+ 8,71 (5,24; 12,17) 6,71 (3,03; 10,38)
CD45+CD4+CD62L+ -9,47 (-13,77; -5,77) -7,83 (-10,79; -4,88)
CD45+CD4+CD62L- 9,37 (5,76; 12,97) 7,72 (4,80; 10,64)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO- -1,18 (-5,00; 2,64) -1,00 (-4,90; 2,90)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO+ 0,59 (-0,79; 1,96) 1,17 (-0,10; 2,23)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA-CD45RO+ 0,59 (-3,34; 4,52) -1,19 (-4,77; 2,39)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO- -4,12 (-5,40; -2,84) -3,91 (-5,97; -1,85)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO+ -0,06 (-1,49; 1,37) -1,37 (-2,93; 0,19)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA-CD45RO+ 4,21 (2,16-6,26) 3,88 (2,28-5,48)
Примечание. Здесь и в табл. 4: жирным шрифтом выделены достоверные поло^ жительные значения КС лимфоцитов в условиях in vitro антигенными препаратами.
по анализу Т-клеток иммунологической памяти, а именно Thl-лимфоцитов (CD45+CD4+CD45RA-CD45RO+, CD45+CD4+CD62L-CD45RA-CD45RO+). Учитывая высокий коэффициент корреляции по данным показателям, который наблюдается при стимуляции лимфоцитов in vitro всеми тремя вышеперечисленными антигенами, мы сочли необходимым провести статистический ана-
лиз полученных результатов с целью определения уровня КС лимфоцитов, свидетельствующего о формировании специфического клеточного иммунитета, и возможности применения данного критерия для контроля проведения вакцинации против чумы и сибирской язвы.
При определении использовали линейную регрессию, рассчитанную по формуле 2.
z = В + С ■ y, (2)
где z - показатель КС лимфоцитов крови; y - показатель оценки реакции лейколи-зиса; В и С - параметры сдвига и регрессии соответственно.
Параметры В и С вычисляли с использованием экспериментальных данных по методу наименьших квадратов.
Расчет z КС лимфоцитов крови, проводили по формуле 3.
z = В + С ■ y (3)
где z - минимальное (пограничное) значение показателя КС лимфоцитов крови, свидетельствующее о формировании специфического клеточного иммунитета; y - минимальное (пограничное) значение показателя для оценки реакции лейколи-зиса, свидетельствующее о формировании специфического клеточного иммунитета (y = 0,20 - критерий оценки наличия иммунологической перестройки организма в ответ на введение бактериальных вакцин по показателю реакции лейколизиса).
Таблица 5
Коэффициент корреляции между КЛЛ и КС лимфоцитов in vitro культурой EV и Fl-антигеном чумного микроба у лиц, вакцинированных ВЧЖС
Клетки крови Коэффициент корреляции между КЛЛ и КС при проведении стимуляции лимфоцитов in vitro
культурой EV чумного микроба (n = 30) F1- антигеном чумного микроба (n = 30)
Лимфоциты, в том числе с фенотипом -0,056 -0,340
CD45+CD4+ 0,151 -0,135
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO- -0,276 -0,458
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO+ -0,544 -0,619
CD45+CD4+CD45RA-CD45RO+ 0,583 0,751
CD45+CD4+CD62L+ -0,263 -0,254
CD45+CD4+CD62L- 0,359 0,262
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO- -0,369 -0,177
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO+ -0,345 -0,260
CD45+CD4+CD62L+CD45RA-CD45RO+ 0,443 0,283
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO- -0,432 0,183
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO+ -0,663 -0,430
CD45+CD4+CD62L-CD45RA-CD45RO+ 0,827 0,790
Таблица 4
Достоверность различия КС лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы у лиц, вакцинированных ВСжС
Клетки крови Разница (5) и доверительные интервалы (6-t0,95-S/Vn; 6+t0,95-S/Vn) для разницы КС лимфоцитов in vitro протек-тивным сибиреязвенным антигеном (n = 30)
Лимфоциты, в том числе с фенотипом 0,29 (-0,72; 1,31)
CD45+CD4+ 0,36 (-0,88; 1,60)
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO- -2,69 (-4,73; -0,65)
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO+ 0,11 (-2,09; 2,31)
CD45+CD4+CD45RA-CD45RO+ 3,45 (0,64; 6,25)
CD45+CD4+CD62L+ -4,11 (-6,22; -1,99)
CD45+CD4+CD62L- 4,22 (2,04; 6,40)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO- -2,20 (-4,60; 0,21)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO+ 1,09 (-0,99; 3,17)
CD45+CD4+CD62L+CD45RA-CD45RO+ 0,79 (-1,46; 3,03)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO- -0,87 (-1,84; 0,11)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO+ -1,50 (-3,09; 0,09)
CD45+CD4+CD62L-CD45RA-CD45RO+ 2,35 (0,35-4,35)
Примечание. Здесь и в табл. 6 жирным шрифтом выделены достоверные значения коэффициента корреляции между КЛЛ и КС при проведении стимуляции лимфоцитов in vitro антигенными препаратами.
Таблица 6
Коэффициент корреляции между КЛЛ и КС лимфоцитов in vitro протективным сибиреязвенным антигеном у лиц, вакцинированных ВСжС
Клетки крови Коэффициент корреляции между КЛЛ и КС лимфоцитов in vitro про-тективным сибиреязвенным антигеном (n = 30)
Лимфоциты, в том числе с фенотипом -0,057
CD45+CD4+ 0,003
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO- -0,249
CD45+CD4+CD45RA+CD45RO+ -0,376
CD45+CD4+CD45RA-CD45RO+ 0,509
CD45+CD4+CD62L+ -0,478
CD45+CD4+CD62L- 0,428
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO- -0,275
CD45+CD4+CD62L+CD45RA+CD45RO+ -0,326
CD45+CD4+CD62L+CD45RA-CD45RO+ 0,469
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO- -0,595
CD45+CD4+CD62L-CD45RA+CD45RO+ -0,671
CD45+CD4+CD62L-CD45RA-CD45RO+ 0,740
Определены минимальные (пограничные) значения показателя КС лимфоцитов крови in vitro, рассчитанные по уровню содержания в крови Thi-лимфоцитов - клеток иммунологической памяти (CD45+CD4+CD62L-CD45RA-CD45RO+), в отношении которых установлена высокая корреляция между КЛЛ и КС. Значения КС in vitro субпопуляций лимфоцитов крови вакцинированных лиц, определенные методом проточной цитофлюориметрии и свидетельствующие об эффективности проведения вакцинации против чумы и сибирской язвы, представлены соответственно в табл. 7, 8.
Учитывая высокий коэффициент корреляции между КЛЛ и КС лимфоцитов с соответствующим фенотипом, значение КС, равное или превышающее указанный уровень, в совокупности с показателем КЛЛ «— 20%» и выше может быть рекомендовано для использования в качестве критерия контроля эффективности вакцинации против чумы и сибирской язвы.
Заключение. В ответ на введение ВЧЖС и ВСЖС в организме вакцинированных лиц происходит иммунологическая перестройка, которая проявляется в наличии достоверного повышения на фоне вакцинации уровня содержания в крови Т-клеток иммунологической памяти. Значимое повышение Thi-лимфоцитов - клеток иммунологической памяти подтверждает результаты ранее проведенных работ об участии данной субпопуляции в развитии иммунного ответа на инфекционный (вакцинальный) процесс, вызванный внутриклеточными микроорганизмами [15-18].
Определен высокий коэффициент корреляции между КЛЛ и КС по показателю уровня содержания в крови Т-лимфоцитов, преимущественно за счет Th1-лимфоцитов. Рассчитаны значения КС для соответствующих клеток крови вакцинированных лиц, которые свидетельствуют об эффективности проведения вакцинации против чумы и сибирской язвы.
Значения КС лимфоцитов антигенными препаратами in vitro, определенные методом проточной цитофлюориметрии, могут быть использованы для комплексной
Таблица 7
КС лимфоцитов крови, свидетельствующий об эффективности проведения вакцинации против чумы
Лимфоциты с фенотипом КС лимфоцитов крови in vitro
культурой EV чумного микроба Р1-антигеном чумного микроба
CD45+CD4+CD62L-D45RO+CD45RA- 6,3 и выше 3,0 и выше
Таблица 8 Кс лимфоцитов крови, свидетельствующий об эффективности проведения вакцинации против сибирской язвы
Лимфоциты с фенотипом КС лимфоцитов крови in vitro протективным сибиреязвенным антигеном
CD45+CD4+CD62L-D45RO+CD45RA- 4,2 и выше
оценки уровня иммунологической перестройки организма лиц, вакцинируемых ВЧЖС и ВСЖС, наряду с другими методами исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1 Галактионов В.Г. Иммунология: Учебник для студентов вузов 3-е изд. М.: Академия; 2004.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. М.: Практика; 1999.
3. МУ 3.1.7.1 189-03. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза у людей: утв. главным государственным санитарным врачом РФ 30.01.03: введ. в действие 01.05.03: Информационно-правовое обеспечение GarantClient.
4. МУ 3.1.2007-05. Эпидемиологический надзор за туляремией: утв. главным государственным санитарным врачом РФ 09.09.05: введ. в действие 09.09.05: Информационно-правовое обеспечение GarantClient.
5. НайхинА.Н., КореньковД.А., ПетуховаГ.Д. Оценка Т-клеточной иммунологической памяти по экспрессии молекул CD45 у людей, привитых живой реассортантной гриппозной вакциной. Медицинская иммунология. 2008; 10 (6): 535-42.
6. Постановление Правительства от 15 июля 1999 г. № 825 «Об утверждении перечня работ, выполнение которых связано с высоким риском заболевания инфекционными болезнями и требует обязательного проведения профилактических прививок»: Информационно-правовое обеспечение GarantClient.
7. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: пер. с англ. 5-е изд. М.: Мир; 2000.
8. Онищенко Г.Г., ЧеркасскийБ.Л., ред. Санитарные правила и методические документы: в 2 т. М.; 2006.
9. Санитарно-эпидемиологические правила. Безопасность работ с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): СП 1.3.1285-03: утв. главным государственным санитарным врачом РФ 12.03.03: введены в действие 25.06.03: Информационно-правовое обеспечение GarantClient.
10. Смолькова Е. А. Влияние бактерий Yersinia pestis, Francisella tu-larensis и их антигенов на экспрессию Toll-подобных рецепторов (TLR2, TLR4) клетками врожденного и адаптивного иммунитета: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Саратов; 2012.
11. Топтыгина А.П. Т-клетки памяти. Иммунология. 2008; 5: 311-7.
12. Хайдуков С.В. Многоцветный анализ в проточной цитометрии для медико-бологических исследований: Дис. ... д-ра биол. наук. СПб; 2008.
13. Щуковская Т.Н., Смолькова Е.А., Шмелькова Т.П. Индуцированная продукция INF-g и IL-4 как показатель функциональной активности Th1- и ТЬ2-клеток у вакцинированных против чумы людей. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011; 6 (61): 78-83.
микробиология
14. Ярилин А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой формы ответа. Иммунология. 1999; 1: 17-24.
15. DaileyM.O. Expression of T-lymphocyte adhesion molecules regulation during antigen-induced T-cell activation and differentiation. J. Immunol. 1998; 18: 153-84.
16. Kanegane H. Expression of L-selectin (CD62L) discriminates Th1 and Th2 like cytokine-producing memory CD4 T-cell. J. Immunol. 1996; 18: 186-90.
17. Kruse C., VarmingK., Christiansen O.B. Prospective, serial investigations of in vitro lymphocyte cytokine production, CD62L expression and proliferative response to microbial antigens in women with recurrent miscarriase. Human Reproduction. 2003; 18 (11): 2465-72.
18. Van Wely C.A. Expression of L-selectin on Th1-cell is regulated by IL-12. J. Immunol. 1999; 163: 1214-21.
REFERENCES
1. Galaktionov V.G. Immunology: a textbook for students: 3rd ed. Moscow: Akademiya; 2004 (in Russian).
2. Glants S. Biomedical statistics: translation from English. Moscow: Praktika; 1999 (in Russian).
3. MU 3.1.7.1 189-03. Prevention and laboratory diagnosis of brucellosis in humans: approved by Chief state sanitary doctor of the Russian Federation 30.01.03: enacted 1.5.03. Information and legal support for by GarantClient (in Russian).
4. MU 3.1.2007-05. Epidemiological surveillance of tularemia: approved by Chief state sanitary doctor of the Russian Federation 09.09.05: enacted 9.9.05. Information and legal support for by GarantClient (in Russian).
5. Naykhin A.N., Koren'kov D.A., Petuhova G.D. Evaluation of T-cell immunological memory for the expression of CD45 molecules in persons vaccinated with live reassortant influenza vaccine. Meditsin-skaya immunologiya. 2008; 10 (6): 535-42 (in Russian).
6. Government Decree of July 15, 1999 N 825 "On approval of the list of work fulfillment of which is associated with a high risk of infectious disease, and requires mandatory vaccinations": information and legal support for by GarantClient (in Russian).
7. RoytA., Brostoff Dzh., MeylD. Immunology: translation from English: 5th ed. Moscow; 2000 (in Russian).
8. Onishchenko G.G., Cherkasskiy B.L., eds. Sanitary rules and guidance documents: in 2 volumes. Moscow; 2006 (in Russian).
9. Sanitary Rules. Working safely with microorganisms I—II pathogenicity groups (hazard): JV 1.3.1285-03: approved by Chief state sanitary doctor of the Russian Federation 12.03.03: enacted 6.25.03: Information and legal support for by GarantClient (in Russian).
10. Smol'kovaE.A. Influence of bacteria Yersinia pestis, Francisella tular-ensis and their antigens on the expression of Toll-like receptors (TLR2, TLR4) with cells of the innate and adaptive immunity: abstract dis. ... candidate of medical sciences. Saratov; 2012 (in Russian).
11. Toptygina A.P. T-cell memory. Immunologija. 2008; 5: 311-7 (in Russian).
12. Khaydukov S.V. Multicolor flow cytometry analysis for medical and biological researches: Dis. ... doctor boil. science. St. Petersburg; 2008 (in Russian).
13. SchchukovskayaT.N., Smol'kovaE.A., Shmel'kova T.P. Induced production of INF-y and IL-4 as an indicator of the functional activity of Th-1 and Th-2 cells of people vaccinated against plague. Epidemiologija I vakcinoprofilaktika. 2011; 61 (6): 78-83 (in Russian).
14. YarilinA.A. Intercellular cooperation in the immune response. Choosing a cell reply form. Immunologija. 1999; 1: 17-24 (in Russian).
15. Dailey M.O. Expression of T-lymphocyte adhesion molecules regulation during antigen-induced T-cell activation and differentiation. J. Immunol. 1998; 18: 153-84.
16. Kanegane H. Expression of L-selectin (CD62L) discriminates Th1 and Th2 like cytokine-producing memory CD4 T cell. J. Immunol. 1996; 18: 186-90.
17. Kruse C., VarmingK., Christiansen O.B. Prospective, serial investigations of in vitro lymphocyte cytokine production, CD 62L expression and proliferative response to microbial antigens in women with recurrent miscarriase. Human Reproduction. 2003; 18 (11): 2465-72.
18. Van Wely C.A. Expression of L-selectin on Th1 cell is regulated by IL-12. J. Immunol. 1999; 163: 1214-21.
Поступила 24.01.13
МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.24-004-078
О.Л. Воронина1, м.С. Кунда1, Е.И. Аксенова1, А.А. Орлова1, м.ю. Чернуха1, В.Г. Лунин1, Е.Л. Амелина 2, А.Г. Чучалин2, А.Л. Гинцбург1
ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ, ПОРАЖАЮЩИХ ДЫХАТЕЛЬНЫЕ ПУТИ БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ
1фГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.ф. Гамалеи минздрава России, 123098, москва; 2НИИ пульмонологии фмБА России, 105077, москва
Близкородственные бактерии Burkholderia cepacia complex (Bcc) и Achromobacter sp. инфицируют респираторный тракт больных муковисцидозом, вызывая нарушения дыхательной проходимости. Bcc отличает трансмиссивность и высокая летальность пациентов, зараженных буркхолдериями, поэтому дифференциация этих фенотипически сходных микроорганизмов представляется важной задачей. Разработанный экспресс-метод диагностики включает выделение ДНк из мокроты, амплификацию и секвенирование фрагментов генов recA, gltB, gyrB, 16S rDNA. Оценка продуктов амплификации генов recA, gltB позволяет дифференцировать Bcc и Achromobacter sp. При анализе последовательностей генов recA, gltB, gyrB был установлен генотип Bcc на основе базы данных аллельных профилей штаммов Bcc, циркулирующих в Рф. По последовательности гена 16S rDNA можно определить таксономическое положение доминирующего в мокроте микроорганизма, не принадлежащего Bcc или Achromobacter sp. ПЦР в реальном времени в присутствии интеркалирую-щего красителя Sybr Green I, DMSO и D(+)-трегалозы позволяет дифференцировать Bcc от других микроорганизмов, инфицирующих респираторный тракт больных муковисцидозом, дополнительно сократить время диагностики и снизить вероятность контаминации.
Ключевые слова: Burkholderia cepacia complex, Achromobacter sp., экспресс-диагностика
