CC BY
26ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© С.П.ЗАДНОВА, Н.И.СМИРНОВА, 2015
С.П.Заднова, Н.И.Смирнова
ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНОВ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ В ШТАММАХ VIBRIO CHOLERAE О1 И О139 СЕРОГРУПП
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Цель. Определение чувствительности штаммов V. cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор и О139 серогруппы к антибиотикам и выявление присутствия генов антибиотикоре-зистентности в их геноме. Материалы и методы. Исследования проведены на 75 штаммах V. cholerae О1 и О139 серогрупп. Чувствительность культур к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом. Выделение ДНК осуществляли в присутствии 6М гуанидинтиоцианата. ПЦР проводили на многоканальном амплификаторе Терцик. Результаты. Сконструирована мультиплексная ПЦР, включающая пять пар праймеров для выявления генов резистентности к сульфаметоксазолу, стрептомицину В, тримето-приму вибрионов О1 и О139 серогрупп, наличия SXT элемента, разработана программа амплификации. С помощью созданной ПЦР установлено, что штаммы V. cholerae О1 биовара Эль Тор c множественной лекарственной устойчивостью были завезены в Россию в 1993 г. Именно в данных штаммах, относящихся к токсигенным геновариантам V. cholerae биовара Эль Тор, выявлено присутствие SXT элемента с генами устойчивости одновременно к четырем антибиотикам. Показано, что все штаммы Эль Тор вибрионов, завезенные в последующие годы, стабильно сохраняют SXT элемент, что указывает на его важную роль в биологии холерного вибриона. Выявлены штаммы О139 серогруппы с интактным SXT элементом и имеющим делецию в гене, кодирующим устойчивость к триметоприму. Заключение. Полученные сведения могут быть использованы для установления молекулярно-генетических механизмов появления антибиотикорезистентных штаммов холерного вибриона, конструирования новых генодиагностических тест-систем и проведения паспортизации штаммов, хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий.
Журн. микробиол., 2015, № 3, С. 3—10
Ключевые слова: Vibrio cholerae, мультиплексная ПЦР, гены антибиотикоустойчивости, SXT элемент
S.P.Zadnova, N.I.Smirnova
ISOLATION OF ANTIBIOTICS RESISTANCE GENES IN VIBRIO CHOLERAE О1 AND О139 SEROGROUP STRAINS
Russian Research Institute of Plague Control «Microb», Saratov, Russia
Aim. Determination of sensitivity of V. cholerae O1 serogroup El Tor biovar and O139 sero-group strains to antibiotics and determination of the presence of antibiotics resistance genes in their genome. Materials and methods. The studies were carried out in 75 V. cholerae О1 and О139 serogroup strains. Sensitivity of cultures to antibiotics was determined by disc-diffusion method. DNA isolation was carried out in the presence of 6M guanidine thiocyanate. PCR was carried out in multi-channel amplificator Tercyc. Results. A multiplex PCR was constructed, that includes 5 primer pairs for the detection of O1 and O139 serogroup resistance genes of vibrios to sulfame-thoxazolum, streptomycin B, trimethoprim, the presence of SXT element, an amplification program was developed. Using the developed PCR, V. cholerae O1 serogroup El Tor biovar strains with multiple drug resistance were established to be imported into Russia in 1993. The presence of SXT elements with genes of resistance to 4 antibiotics simultaneously was detected precisely in
these strains, that belong to toxigenic genovariants of V.cholerae El Tor biovar. All the El Tor vibrio strains imported in the subsequent years were shown to stably preserve SXT element, this indicates its important role in biology of cholera vibrios. O139 serogroup strains with intact SXT element and having a deletion of the gene coding trimethoprim resistance were isolated. Conclusion. The data obtained may be used to establish molecular-genetic mechanisms of emergence of antibiotics resistant strains of cholera vibrio, construction of novel gene diagnostic test-systems and carrying out passportization of strains that are stored in the State collection of pathogenic bacteria.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 3, P. 3-10
Key words: Vibrio cholerae, multiplex PCR, antibiotics resistance genes, SXT element ВВЕДЕНИЕ
Согласно данным Всемирной организации здравоохранения с каждым годом растет число антибиотикоустойчивых штаммов возбудителей инфекционных заболеваний. Не являются исключением и штаммы возбудителя холеры — Vibrio cholerae, вызывающие острую инфекционную болезнь с диарейным синдромом. С одной стороны, применение антибиотиков при лечении холеры существенно сокращает развитие инфекционного процесса, выделение и распространение вибрионов, но с другой — способствует возникновению устойчивых штаммов.
Бесконтрольное использование антибиотиков при лечении различных заболеваний способствовало тому, что всё чаще регистрируется выделение культур V. cholerae с множественной лекарственной устойчивостью. При этом неблагоприятный прогноз по холере усугубляется выделением штаммов с маркерами резистентности к широко применяемым для экстренной профилактики и лечения холеры антибактериальным препаратам (тетрациклинам, хлорамфениколу, фуразолидону, триметоприму/сульфа-метоксазолу, аминогликозидам, беталактамам) [3, 13]. Несмотря на то, что устойчивость к антибиотикам не является фактором вирулентности, она играет важную роль в селекции, выживаемости и широком распространении патогенных штаммов V. cholerae.
В связи с вышеизложенным цель нашей работы состояла в определении чувствительности штаммов V. cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор и штаммов О139 се-рогруппы к антибиотикам и выявлении распространенности в их геноме генов анти-биотикорезистентности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе было использовано 48 штаммов О1 серогруппы V cholerae биовара Эль Тор. Для уточнения времени появления антибиотикорезистентных штаммов в анализ были взяты предпандемические штаммы — V cholerae МАК97, МАК676, МАК757, МАК30 (Индонезия, 1937), а также изоляты, выделенные в начале текущей пандемии и в современный ее период. Кроме того, исследования проводились на 27 штаммах V. cholerae О139 серогруппы, изолированных в 1993 — 1997 гг. (табл. 1). Штаммы хранятся в лиофилизированном состоянии в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». Для культивирования бактерий применяли бульон и агар LB (рН 7,2), посевы инкубировали 16 — 18 часов при температуре 37°С.
Чувствительность культур к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом с использованием препаратов фирмы HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия) и НИЦФ (Санкт-Петербург). Диски с антибиотиками имели следующие концентрации — ампицилин (Ap) — 10 мкг, хлорамфеникол (Cm) — 30 мг, рифампи-цин (Rf) — 5 мкг, канамицин (Kn) — 20 мкг, спектиномицин (Sp) — 25 мкг, тетрациклин (Tc) — 30 мкг, стрептомицин (Sm) — 10 мг, триметоприм (Tp) — 25 мкг.
Выделение ДНК для постановки полимеразной цепной реакции осуществляли в присутствии 6М гуанидинтиоцианата с использованием набора «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (Интерлабсервис, Москва) в соответствии с инструкцией к набору. ПЦР для
Таблица 1. Антибиотикограмма и наличие генов антибиотикорезистентности в штаммах V. сИо1егае
Штамм V. еЬо1егае Антибиотикограмма Присутствие геноЕ антибиотикорезистентности
¡¡иШ а£г18 а&А 8ХТ
О1 серогруппа Эль Тор биовара
1937
МАК97, МАК676, МАК757, МАК30 Ар8 Rf Кп8 Sps Тс8 Sms Сш8 Тр8 — — — — —
1961-1990
31 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Тр8 — — — — —
Т-4 Арг Rf8 Кпг Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Тр8 — — — — —
34Каюм Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Тр8 — — — — —
М818 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Tp8 — — — — —
М736, М738 Ар8 Rf8 Кп8 Spг Тс8 Smг Сш8 Tp8 + — — — —
М712, М713 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сш8 Tp8 + — — — —
С803 Ар8 Rf8 Кпг Spг Тс8 Sm8 Сш8 Tp8 — — — — —
М1011 Ар8 Rf8 Кп8 Spг Тс8 Smг Сш8 Tp8 + — — — —
М1013 Ар8 Rf8 Кп8 Spг Тс8 Sm8 Сш8 Tp8 — — — — —
М582 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Tp8 — — — — —
М1114, М1115 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Tp8 — — — — —
Р14161 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Tp8 — — — — —
Р14169 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сш8 Tp8 + — — — —
С402 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сш8 Tp8 + — — — —
Р14576 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Tp8 — — — — —
М1259, М1261 Ар8 Rf8 Кп8 Spг Тс8 Smг Сш8 Tp8 + — — — —
1993-2011
М1264, М1272, М1299, М1298 Арг Rf8 Кп8 Spг Тсг Smг Сшг TpI + + — + +
М1270, М1271 Арг Rf8 Кп8 Spг Тсг Smг Сшг TpI + + — + +
М1268 Арг Rf8 Кп8 Spг Тс8 Smг Сшг TpI + + — + +
М1269 Арг Rf8 Кп8 Spг Тсг Smг Сшг TpI + + — + +
Р17644, Р17647, Р17645 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг TpI + + — + +
М1337 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Tp8 — — — — —
М1344, М1345, М1349 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг TpI + + — + +
М1411 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Tp8 — — — — —
М1429 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг TpI + + — + +
Р18748 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Sm8 Сш8 Tp8 — — — — —
М1430 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг TpI + + — + +
Р18899 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг TpI + + — + +
Л3225, Л3226, Л4150 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг TpI + + — + +
301 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг TpI О139 серогруппа + + — + +
1993-1997
МО28 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг TpI + + + — +
62, 88, 70, 71 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг TpI + + + — +
55 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сш8 TpI — — + — —
AS486, AS549, АБ581, PG29 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сш8 Tp8 + + — — —
AS507, AS514, AS612, АБ559, Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг Tp8 + + — — +
АМ308, АМ354
АМ324, АМ348, PG8, AS528, АБ536 Арг Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сш8 Tp8 + + — — —
АБ521, АМ319, АМ338А, S497, PG3 Ар8 Rf8 Кп8 Sp8 Тс8 Smг Сшг Tp8 + + — — +
АМ333 Ар8 Rf8 Кпг Sp8 Тс8 Smг Сшг Tp8 + + — — +
Таблица 2. Праймеры, использованные в работе
Название праймера Последовательность праймера Температура отжига, °С Размер ампликона, п.н. Осылка
ctxA-F CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG 64 564 [7]
ctxA-R CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC 62
tcpAEl GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACAC 56 471 [12]
tcpAEl GAAAGGACCTTCTTTCACGTTG 56
dfrA1-F CAAGTTTACATCTGACAATGAGAACGTAT 61 278 [6]
dfrA1-R ACCCTTTTGCCAGATTTGGTA 56
strB-F CCGCGATAGCTAGATCGCGTT 62 515 [14]
strB-R CGACTACCAGGCGACCGAAAT 62
dfr18-F TGGGTAAGACACTCGTCATGGG 59 389 [10]
dfr18-R ACTGCCGTTTTCGATAATGTGG 62
sulII-F AGGGGGCAGATGTGATCGAC 62 626 [10]
sulII-R TGTGCGGATGAAGTCAGCTCC 61
SXT-F ACTTCACTCGTGGTAACTGGTCCCA 65 860 рассчитаны в дан-
SXT-R CGTCTGTGTAGGCATTGCACCG 64 ном исследовании
определения наличия генов ctxA и tcpA проводили в микропробирках объемом 600 мкл и 200 мкл на многоканальном амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Москва). Использованные в работе праймеры приведены в табл. 2.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
На первом этапе работы все взятые для анализа штаммы V. cholerae были исследованы методом ПЦР на присутствие основных генов вирулентности — ctxA, входящего в состав оперона ctxAB, кодирующего продукцию холерного токсина, ответственного за развитие диареи, и tcpA, кодирующего биосинтез основной субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА), участвующих в колонизации. В результате проведенных исследований выявлено, что большинство исследованных штаммов холерных вибрионов биовара Эль Тор были токсигенными. Отдельного внимания заслуживают штаммы V. cholerae М1337 (Астрахань, 2000), М1411 (Калмыкия, 2002), Р18748 (Сочи, 2004), у которых не выявлены гены ctxA и tcpA. Возникает вопрос, за счет каких факторов вирулентности штаммы вызвали заболевание, если гены, кодирующие основной фактор колонизации и холерный токсин отсутствовали? Возможно, заселение кишечника было связано с продукцией вибрионами дополнительных факторов колонизации, синтезируемых V. cholerae [8], а диарея могла быть результатом продукции на фоне ослабленного организма дополнительных токсинов и токсических веществ, например, RTX токсина (repeat in toxin) и/или термолабильного гемолизина.
Все исследованные изоляты О139 серогруппы содержала оба (ctxA+, tcpA+) тестируемых гена, что указывает на их вирулентность.
Таким образом, 93,8% использованных в работе штаммов V. cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор и все взятые для анализа штаммы V. cholerae О139 серогруппы были вирулентными.
Далее была определена устойчивость штаммов V cholerae к восьми наиболее часто используемым в медицинской практике антибиотикам (табл. 1: r — резистентность, s — чувствительность). В результате проведенного анализа подтверждена временная связь между введением в лечебную практику антибиотиков и появлением устойчивых к ним клинических штаммов. Так, предпандемические штаммы V. cholerae биовара Эль Тор были чувствительны ко всем изученным лекарственным препаратам. Штаммы, выделенные в начале пандемии (1961 — 1990 гг.), были устойчивы к одному—двум антибиотикам. При этом 20% были устойчивы к стрептомицину, 15% — к ампицили-ну и 5% — к спектиномицину. Однако наибольшее количество штаммов (25%) были одновременно устойчивы к двум антибиотикам — стрептомицину и спектиномицину, по 5% — к ампицилину/канамицину и канамицину/спектиномицину. Авирулентные штаммы V cholerae М1337, Р18748, М1411 были устойчивы только к ампицилину.
Штаммы V. cholerae О1 биовара Эль Тор c множественной лекарственной устойчивостью (стрептомицин, хлорамфеникол, триметоприм) начали завозиться в Россию с 1993 года, что подтверждает данные литературы о циркуляции в данное время полирезистентных штаммов на эндемичной по холере территории [10,13]. Необходимо отметить, что 94% исследованных штаммов V cholerae биовара Эль Тор были чувствительны к тетрациклину и 100% — к рифампицину.
При анализе штаммов V. cholerae О139 серогруппы, изолированных от больных во Франции (1994 г.) и Индии (1997 г.), выявлено, что 100% изолятов были устойчивы к стрептомицину, 74% — к хлорамфениколу, 41% — к ампицилину, 22% — к стрептомицину и триметоприму. Однако в отличие от штаммов V cholerae О1 серогруппы Эль Тор биовара холерные вибрионы О139 серогруппы были чувствительны не только к рифампицину и тетрациклину, но и к спектиномицину, а 96,3% — к канамицину.
Следующий этап работы был посвящен выявлению в геноме исследуемых штаммов генов антибиотикорезистентности, входящих в состав SXT элемента (sulfamethoxazole-trimethoprim). Выбор данного элемента обусловлен тем, что он несет гены устойчивости сразу к четырем антибиотикам — сульфаметоксазолу, триметопри-му, фуразолидону и стрептомицину. Для определения генов антибиотикорезистент-ности была сконструирована мультиплексная ПЦР, которая включала праймеры для выявления генов — sulII (резистентность к сульфаметоксазолу), dfrA1 (устойчивость к триметоприму вибрионов О1 серогруппы), dfr18 (резистентность вибрионов О139 серогруппы к триметоприму), strB (устойчивость к стрептомицину В) и rumB (наличие SXT элемента) (табл. 2). Праймеры к генам sulII, dfrA1, dfr18, strB описаны в литературе, праймеры на ген rumB сконструированы с использованием программы Oligo 6.0 и обеспечивали амплификацию фрагмента размером 860 т.п.н.
Реакционная смесь включала 2,5 мкл стандартного 10-кратного буфера для Taq-полимеразы (0,7 М трис-HCl, рН 8,8; 0,2 М сульфат аммония; 200 мкг/мл БСА; 0,1% Т^^п^), 2,5 мкл 25 М MgCl2, 2 мкл смеси дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ «Fermentas», каждый в концентрации 2 ммоль), 0,4 мкл Taq ДНК-полимеразы (5 ед/ мкл, «Fermentas»), 5,1 мкл деионизованной воды. В готовую смесь добавляли смесь прямого и обратного праймеров в количестве 0,5 мкл для SXT, 0,25 мкл sulII, 0,4 мкл dfr18, 1 мкл dfrA, 0,4 мкл strB и 10 мкл исследуемой ДНК. Амплификацию осуществляли на термоциклере с горячей крышкой «MJ RESEARCH» (США). Программа амплификации была следующей: предварительная денатурация при температуре 94°С — 2 мин, затем 34 цикла, включающих денатурацию при температуре 94°С в течение 1 мин, отжиг праймеров при температуре 61°С — 1 мин, синтез комплементарной цепи при 72°С — 1 мин и финальная элонгация 72°С — 2 мин. Регистрацию результатов ПЦР осуществляли методом электрофореза в 1,5 — 2% агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл этидия бромида.
В результате использования тест-системы подтверждено отсутствие в геноме пред-пандемических штаммов генов антибиотикорезистентности (табл. 1). SXT элемент и гены антибиотикорезистентности не выявлены также и в геноме авирулентных штаммов (М1337, Р18748, М1411). Можно предположить, что утрата мобильных элементов, содержащих гены вирулентности, происходит одновременно с потерей SXT элемента.
Однако SXT элемент обнаружен в штаммах V cholerae биовара Эль Тор, выделяемых после 1993 года. Необходимо отметить, что данные штаммы относятся к генетически измененным штаммам (геновариантам), которые отличаются от типичных Эль Тор вибрионов, вызвавших текущую 7 пандемию холеры, по структуре ряда генов вирулентности (ctxB, rstR), а изолированные в последние годы — и по структуре острова пандемичности VSP-II и tcpA. Геноварианты в отличие от типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор являются более вирулентными и вызывают тяжелую клиническую форму болезни с высокой смертностью [5, 15]. При ПЦР тестировании геновариантов в их геноме выявлено наличие SXT элемента Эль Тор типа (SXTEX) с геном dfrA1.
У ряда штаммов V. cholerae биовара Эль Тор (М736, М738, М712, М713, М1011,
Р14169, С402, М1259, М1261), устойчивых к стрептомицину, тестировался ген strB, но SXT элемент в их геноме выявлен не был. Возможно, данные изоляты содержат другие мобильные элементы (например, плазмиды) с геном устойчивости к стрептомицину.
Таким образом, SXT элемент, определяющий устойчивость штаммов сразу к нескольким антибиотикам, впервые обнаружен в штаммах V. cholerae биовара Эль Тор, завезенных в Российскую Федерацию в 1993 году и относящихся к токсигенным штаммам геновариантов.
Особого внимания заслуживает факт выявления SXTET элемента в геноме штамма V. cholerae 301, выделенного из морской воды в районе города Таганрог (2011 г.). Согласно данным литературы в отсутствии селективного давления антибиотиков штаммы V. cholerae биовара Эль Тор утрачивают устойчивость к ним [1, 4]. Однако анализ штамма V cholerae 301 указывает, что находясь во внешней среде, токсигенные штаммы геновариантов способны сохранять устойчивость к антибиотикам и мобильные генетические элементы (МГЭ) с генами антибиотикорезистентности.
При анализе штаммов V. cholerae О139 серогруппы выявлено 20 штаммов (74%), содержащих SXT элемент. Однако из них только 5 штаммов (Индия, 1993; Франция, 1994) имели SX^010 с геном dfr18, характерный для штаммов О139 серогруппы. Остальные же штаммы (Индия, 1997) содержали дефектный SXT элемент, лишенный гена dfr18 (strB+, sulII+, dfr18-, SXT+). Обнаружен также один штамм — V cholerae 55, в геноме которого выявлен только ген dfr18 (strB-, sulII-, dfr18+, SXT-). У 26% изученных штаммов О139 серогруппы не выявлен ампликон размером 860 п.н., что указывает на отсутствие SXT элемента. Однако в геноме данных штаммов тестируются гены sulII и strB (strB+, sulII+, dfr18-, SXT-). Возможно, данные штаммы содержат измененный SXT элемент или другие МГЭ (интегроны, плазмиды) с генами антибиотикоре-зистентности.
Таким образом, исследованные нами штаммы V cholerae О139 серогруппы представляют собой гетерогенную группу, включающие изоляты с разной структурой SXT элемента.
ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно известным данным возникновение антибиотикоустойчивых штаммов V. cholerae связано с приобретением ими различных МГЭ с генами резистентности — коньюгативных плазмид, коньюгативных транспозонов, интегронов, SXT-элементов, а также в результате спонтанных мутаций в ряде генов, расположенных на хромосоме [2, 11]. Так, SXT-элемент или констин размером 99,5 т.п.н. впервые был обнаружен у холерных вибрионов О139 серогруппы, вызвавших вспышки холеры в Индии и Бангладеш в 1992 году. Данные вибрионы были устойчивы сразу к нескольким антибиотикам — сульфаметоксазолу, триметоприму, фуразолидону и стрептомицину. В результате молекулярно-генетического изучения штаммов О139 серогруппы было установлено, что гены, кодирующие резистентность к данным антибиотикам (dfr18, floR, strAB, sulII), расположены на транспозоноподобном элементе размером 17,2 т.п.н., внедренным в ген rumB из оперона rumAB SXT элемента [9, 10, 17]. По названию штамма — V. cholerae МО10, в котором он впервые был обнаружен, данный коньюгативный генетический элемент был обозначен как SXTM010 [16]. Кроме генов антибиотикорезистентности SXT констин содержит также высоко консервативную последовательность int, кодирующую интегразу, участвующую как в интеграции, так и исключении SXT, что указывает на возможность его вырезания и попадания в другие штаммы. Действительно, в штаммах V. cholerae биовара Эль Тор, появившихся на эндемичной территории после вспышек холеры, вызванных штаммами V. cholerae О139 серогруппы (1993 г.), было обнаружено присутствие SXT элемента [10]. Однако SXT элемент Эль Тор вибрионов отличался от SXTM010. В нем был делетирован фрагмент с геном drf18 размером 3,3 т.п.н., но присутствовал новый интегроноподобный элемент с геном drfA1, поэтому SXT элемент штаммов V cholerae биовара Эль Тор был обозначен как SXTET [10].
В результате проведенного нами анализа выявлено, что действительно штаммы
V. еИо1егае биовара Эль Тор, завезенные в Россию в 1993 году и относящиеся к токси-генным штаммам геновариантов, содержат SXT элемент с генами антибиотикорези-стентности. Таким образом, приобретение SXT элемента холерными вибрионами биовара Эль Тор совпало или произошло одновременно с изменением структуры их генов вирулентности (гена йхВ из профага СТХ).
Необходимо отметить, что штаммы геновариантов V еИо1егае биовара Эль Тор, выделяемые в настоящее время, подвержены дальнейшим эволюционным изменениям. В их геноме выявлены как точковые мутации, так обширные делеции в генах вирулентности (йхВ, 1ерЛ) и жизнеобеспечения (ш8ИЕ, Ш8Ы, Та&А-подобный белок, белки ОшрХ ОшрН, пируват-флаводоксин оксидоредуктаза, остров интегронов, остров пандемичности VSP-II) [5, 15, 16]. При этом, изменениям также подвержен и SXT элемент, в котором обнаружены различные однонуклеотидные замены, что, возможно, является следствием адаптации штаммов V. еИо1егае к новым условиям существования [16, 18].
Поскольку SXT констин является мобильным элементом, можно было ожидать, что штаммы могут легко его утрачивать. Однако среди изученных штаммов данный элемент отсутствовал лишь у авирулентных изолятов V еИо1егае биовара Эль Тор и у 26% вибрионов О139 серогруппы. Стабильное сохранение SXT элемента в геноме штаммов V еИо1егае биовара Эль Тор в течение длительного времени (около 20 лет) может указывать на его важную роль в биологии холерного вибриона. В связи с недостаточным количеством штаммов О139 серогруппы, имеющихся в нашем распоряжении, окончательный вывод для штаммов данной серогруппы сделать затруднительно. Однако в пользу высказанного предположения свидетельствуют данные литературы о выделении в современный период клинических штаммов V еИо1егае О139 серогруппы, содержащих SXT элемент [18].
Возникновение штаммов V. еИо1егае биовара Эль Тор, несущих SXT элемент, после вспышек холеры, вызванных вибрионами О139 серогруппы, вполне логично способствовало появлению распространенного мнения, что данный мобильный элемент был получен ими от вибрионов О139 серогруппы. Однако В. НоеИИи е1 а1., изучая штаммы О139 серогруппы, выделенные в Индии в 1996 году, высказали предположение, что штаммы V. еИо1егае биовара Эль Тор, содержащие SХТEГ, и штаммы V. еИо1егае О139 серогруппы с SХТMO10 эволюционировали независимо друг от друга [10]. При этом, их предковой формой был штамм, содержащий SXT элемент с генами 8и1П, 81гВ, f1oR, но с делетированным геном ёйг. Изоляты с данной структурой SXT элемента были выявлены и нами при изучении штаммов V. еИо1егае О139 серогруппы, выделенных в Индии в 1997 году. Однако высокая гетерогенность структуры SXT элемента, обнаруженная на небольшой выборке штаммов V еИо1егае О139 серогруппы, а также более позднее по времени появление штаммов О139 серогруппы с указанной выше структурой SXT элемента (1996 — 1997 гг.), на наш взгляд, подтверждают ранее высказанное предположение о приобретении SXT элемента штаммами V. еИо1егае биовара Эль Тор от штаммов О139 серогруппы.
Полученные нами сведения о наличии генов антибиотикорезистентности в исследованных штаммах V еИо1егае О1 и О139 серогрупп могут быть использованы при изучении молекулярно-генетических механизмов появления антибиотикорезистент-ных штаммов холерного вибриона, а также конструировании новых генодиагностических тест-систем и проведении паспортизации штаммов, хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий.
Формирование полирезистентных штаммов холерного вибриона происходит в результате горизонтального переноса генов, что позволяет говорить о возможности появления и распространения клонов, устойчивых к действию новых лекарственных препаратов. Очевиден также факт, что формирование штаммов холерных вибрионов с множественной устойчивостью к лекарственным препаратам — одно из основных направлений эволюции этого патогена, поэтому необходимо проведение молекулярного мониторинга за возбудителем холеры с использованием адекватных генодиагностических средств.
Работа частично выполнена в рамках ГК №56-Д от 09.06.2010 г. ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 — 2014 гг.)».
ЛИТЕРАТУРА
1. Дудина Н.А. Природная и экспериментальная вариабельность антибиотикорезистент-ности у штаммов холерного вибриона O1 и O139 серогрупп и обоснование выбора средств этиотропной терапии холеры. Дисс. канд. биол. наук. Ростов-на-Дону. 2007.
2. Ильина Т.С. Мобильные ISCR-элементы: структура, функции и роль в создании, наращивании и распространении блоков бактериальных генов множественной резистентности к антибиотикам. Мол. генет. микробиол. вирусол. 2012, 4: 3-13.
3. Марамович А.С., Погорелов В.И., Урбанович Л.Я., Шкаруба Т. Т. Холера эльтор в Латинской Америке. Журн. микробиол. 2001, 5: 82-90.
4. Савельев В.Н., Бабенышев Б.В., Савельева И.В. и др. Чувствительность/устойчивость к антибактериальным препаратам клинических штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных на Кавказе в период седьмой пандемии холеры. Антибиотики и химиотерапия. 2010, 5: 8-13.
5. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры в современный период. Мол. генет. микробиол. вирусол. 2010, 4: 11-19.
6. Falbo V., Carattoli A., Tosini F. et al. Antibiotic resistance conferred by a conjugative plasmid and a class I integron in Vibrio cholerae O1 El Tor strains isolated in Albania and Italy. Antimicrob. Agent Chemother. 1999, 43 (3): 693-696.
7. Fields P.I., Popovic T., Wachsmuth K., Olsvik O. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic. J. Clin. Microbiol. 1992, 30 (8): 2118-2121.
8. Fullner K.J., Mekalanos J.J. Genetic characterization of a new type IV-a pilus gene cluster found in both classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 1999, 67 (3): 1393-1404.
9. Hochut B., Waldor M.K. Site-specific integration of the conjugal Vibrio cholerae SXT element into prfC. Mol. Microbiol. 1999, 32: 99-110.
10. Hochhut B., Lotfi Y., Mazei D. et al. Molecular analysis of antibiotic resistance gene clusters in Vibrio cholerae O139 and O1 SXT Constins. Antimicrob. Agent Chemother. 2001, 45 (11): 2991-3000.
11. Kitaoka M., Miyata S.T., Unterweger D., Pukatzki S. Antibiotic resistance mechanisms of Vibrio cholerae. J. Medical. Microbiol. 2011, 60: 397-407.
12. Keasler S.P., Hall R.N. Detecting and biotyping V. cholerae O1 with multiplex polymerase chain reaction. Lancet. 1993, 341: 1661.
13. Pugliese N., Maimone F., Scrascia M. et al. SXT-related integrating conjugative element and INCc plasmids in Vibrio cholerae O1 strains in Eastern Africa. J. Antimicrob. Chemother.
2009, 63: 438-442.
14. Ramachandran D., Bhanumathi R., Singh D.V. Multiplex PCR for detection of antibiotic resistance genes and the SXT element: application in the characterization of Vibrio cholerae. J. Medical. Microbiol. 2007, 56: 346-351.
15. Safa A., Balakrish W, Kong R.YC. Evolution of new variants of Vibrio. Trends Microbiol.
2010, 18 (1): 46-54.
16. Sealfon R., Gire S., Ellis C. et al. High depth, whole-genome sequencing of cholera isolates from Haiti and the Dominican Republic. BMC Genomics. 2012, 13: 468-478.
17. Waldor M.K., Tschape H., Mekalanos J.J. A new type of conjugative transposon encodes resistance to sulfamethoxazole, trimethoprim, and streptomycin in Vibrio cholerae O139. J. Bacteriol. 1996, 178: 4157-4165.
18. Yi Y, Lu N., Liu F. et al. Genome sequence and comparative analysis of a Vibrio cholerae O139 strain E306 isolated from a cholera case in China. Gut Pathogens. 2014, 6 (3): 1-7.
Поступила 09.11.14
Контактная информация: Заднова Светлана Петровна, д.б.н.,
410005, Саратов, Университетская, 46, р. т. (8452)26-47-23
