CC BY
25
ORIGINAL ARTICLE
ЦИТОКИНЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 615.277.3.015.44
Потапнев М.П.1, Вашкевич Е.П.2, Петёвка Н.В.3, Белевцев М.В.2
ВЫСВОБОЖДЕНИЕ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-АЛЬФА IN VITRO МОНОНУКЛЕАРАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ВЫЗВАННОЕ ЦИТОСТАТИКОМ ЭТОПОЗИДОМ
1 Белорусский государственный медицинский университет, г. Минск, Беларусь;
2 Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, г. Минск, Беларусь;
3 Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий, г. Минск, Беларусь
Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) человека культивировали в течение 20 ч без или с возрастающими концентрациями этопозида (5, 50 и 250 мкг/мл), затем оценивали количество клеток, подвергшихся вторичному некрозу (окрашиваемых пропидиумом иодидом), и содержание фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-а) в культуральном супернатанте. Показано, что как в культуре МПК здоровых людей, так и онкологических больных высокие дозы этопозида (250 мкг/мл) вызывали увеличение в 33,1 и 13,2 раза соответственно количества МПК, находящихся в состоянии вторичного некроза, а в культуральном супернатанте — увеличение в 46,6 и 26,6 раза соответственно содержания ФНО-а. Сделано заключение, что при некротической гибели МПК, индуцированной цитостатиком этопозидом, отмирающие клетки высвобождают ФНО-а.
Ключевые слова: мононуклеары периферической крови человека; этопозид; вторичный некроз; фактор некроза опухолей-альфа.
Для цитирования: Потапнев М.П., Вашкевич Е.П., Петёвка Н.В., Белевцев М.В. Высвобождение фактора некроза опухолей-альфа in vitro мононуклеарами периферической крови человека, вызванное цитостатиком этопозидом. Иммунология. 2016; 37(5): 253-255. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-5-253-255
Potapnev M. P.1, Vashkevich K.P.2, Petyovka N.V.3, Belevtsev M.V.2
TUMOR NECROSIS FACTOR- ALPHA RELEASE BY HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS TREATED IN VITRO WITH ANTICANCER DRUG ETOPOSIDE
'Belarusian State Medical University, 220116, Minsk, Belarus;
2Belarasian Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology, 223053, Minsk Region, Belarus; 3Belarusian Research and Production Center for Transfusiology and Medical Biotechnologes, 220053, Minsk, Belarus Mononuclear cells (MNCs) from human peripheral blood were cultured for 20 hours with or without etoposide (5.0, 50.0 or 250.0 |jg per ml). Dying MNCs (in a stage of secondary necrosis) as propidium iodide (PI) — positive cells and a level of tumor necrosis factor — alpha (TNF-а) in cell supernatant were counted after termination of culture period. It was shown that high (250.0 jig per ml), but not low doses of etoposide induced substantial increase the number of PI-positive cells and the level of TNF-а in the supernatant of cultured MNCs of healthy people and oncological patients. We concluded that TNF-а release is an indication of cell necrotic death, induced by anticancer chemotherapeutic agent etoposide.
Keywords: peripheral blood mononuclear cells, etoposide, secondary necrosis, tumor necrosis factor-alpha
For citation: Potapnev M. P, Vashkevich K.P., Petyovka N.V., Belevtsev M.V. Tumor necrosis factor- alpha release by human peripheral blood mononuclear cells treated in vitro with anticancer drug etoposide. Immunologiya.2016; 37(5): 253-255. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-5-253-255
For correspondence: Potapnev Mikhail Petrovich, dr. med. sci., prof., chief researcher of the laboratory of biochemical methods of research research of the Belarusian state medical. University, E-mail: mpotapnev@yandex.by
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Funding. This work was done with financial assistance from the Ministry of health of the Republic of Belarus (grant No.
20022584). The authors Express their gratitude to Savitsky V.P. for assistance in research usingflow cytometry.
Received 13.05.16 Accepted 07.06.16
Для корреспонденции: Потапнев Михаил Петрович, д-р мед. наук, проф., гл. науч. сотр. лаб. биохимических методов исследования научно-исследовательской части Белорусского гос. мед. университета, E-mail: mpotapnev@yandex.by
Противоопухолевые химиотерапевтические лекарственные препараты (химиопрепараты) оказывают прямое цитотоксическое или проапоптотическое действие на опухолевые клетки [1], повышают их чувстви-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
тельность к иммунному воздействию [2, 3], а также сами влияют на иммунные клетки [4]. Химиопрепара-ты снижают функциональную активность иммунных клеток либо оказывают цитотоксическое действие, вызывая их апоптоз или некроз [4—7]. По сегодняшним представлениям, апоптотические и некротические клетки играют разную роль в формировании антиген-неспецифического иммунного ответа, формируя иммунологическую толерантность (или ^2-тип ответа) и провоспалительный иммунный ответ (Thl-тип ответа) соответственно [8, 9]. Поляризация иммунного ответа предполагает различия в профиле выделяемых цитоки-нов. Целью нашего исследования было изучение возможности выделения фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-а), ассоциированного с Thl-типом иммунного ответа, лимфоидными клетками человека in vitro в результате прямого воздействия противоопухолевого лекарственного препарата этопозида.
Материал и методы
Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) получали от здоровых людей: 6 доноров крови Республиканского научно-практического центра трансфузиологии и медицинских биотехнологий (Минск, Беларусь), а также от 5 онкологических больных из Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии (Минск, Беларусь) после получения информированного согласия. Клетки выделяли на градиенте плотности, как описано ранее [4]. Полученные МПК ресуспендировали в питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед. пенициллина/100 мкг стрептомицина на 1 мл, 200 мМ L-глутамина) (все реагенты Sigma, США), высевали в 96-луночные микропланшеты (Sarstedt, Германия) в конечном объеме 0,2 мл в концентрации 1 млн клеток/мл. МНК культивировали в триплетах в течение 20 ч в условиях 5% CO2 95% влажности, +37 °С, без или с добавлением препарата этопозид (TEVA, Израиль) в конечных концентрациях 5; 50 или 250 мкг/мл.
По окончании культивирования клеточный супер-натант собирали для определения ФНО-а, как описано ранее [10]. Нижний предел определения ФНО-а составлял 15 пкг/мл.
МПК, культивированные в присутствии или без этопозида, собирали, отмывали, окрашивали пропи-диумом иодидом (ПИ) и методом проточной цитоме-трии определяли количество клеток, находящихся на стадии позднего апоптоза/вторичного некроза, как описано ранее [4].
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Prism 5.0. (GraphPad Software, США). Данные представляли как средние значения ± ошибка средней. Достоверными считали различия приp < 0,05.
результаты и обсуждение
При культивировании in vitro в течение 20 ч в отсутствие этопозида МПК здоровых людей (кон-
в
I
0
1
е
1500-,
1000 -
500-
50
250
M±SEM (%) 2,08±0,57 2,9±0,37 15,24±4,33 68,94±13,79
Р Контроль >0,05 0,032 0,0037
Влияние 20-часовой инкубации мононуклеаров периферической крови (МПК) здоровых лиц (п = 6) с этопозидом в концентрации 5; 50; 250 мкг/мл на уровень фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-а) в культуральной среде (а) и количество МПК, окрашиваемых про-пидиумом иодидом (б).
По оси абсцисс — концентрация этопозида (мкг/мл) в культуре МПК, по оси ординат — содержание ФНО-а в супернатанте. Обозначения: *** — р < 0,001
троль) не содержали (или содержали в минимальном количестве) клетки, находящиеся на стадии позднего апоптоза/вторичного некроза (см. рисунок). Добавление минимальной концентрации этопозида (5 мкг/мл) не приводило к изменению жизнеспособности культивируемых клеток. При этом в суперна-тантах контрольных и МПК, культивированных в присутствии 5 мкг/мл этопозида, ФНО-а не определялся. Внесение этопозида в дозировке, близкой к терапевтической (50 мкг/мл), приводило к повышению в 7,3 раза количества клеток, окрашенных ПИ, а также увеличению в 3,5 раза содержания ФНО-а в культуральном супернатанте. Дальнейшее повышение концентрации этопозида до 250 мкг/мл приводило к увеличению (по сравнению с контролем без этопозида) в 33,1 раза уровня некротических клеток и в 46,6 раза — содержания ФНО-а в культуральном супернатанте.
Дополнительно проведенные исследования с образцами крови онкологических больных (n = 5) выявили аналогичную тенденцию. Высокие концентрации это-позида (250 мкг/ мл) вызывали значительное повышение количества культивированных in vitro МПК, окрашенных ПИ (31,6 ± 8,8% в сравнении с 2,4 ± 0,5% в контроле без этопозида; p = 0,004), и уровня ФНО-а (885,2 ± 221,7 пкг/мл в сравнении с 33,2 ± 8,4 пкг/мл в контроле; p = 0,018) в культуральном супернатанте.
Заключение
Таким образом, нами показано, что в процессе лекарственно-индуцированной клеточной смерти на стадии позднего апоптоза/вторичного некроза МПК периферической крови человека выделяют ФНО-а,
который вместе с другими биологически активными веществами формирует стерильное воспаление и иммунный ответ на поврежденные клетки [11]. Ранее аналогичное высвобождение цитокинов клетками в процессе некротической гибели показано для IL-1 [11, 12] и IL-6 [13]. Дозозависимость действия этопозида на индукцию процесса клеточной смерти и высвобождение клетками ФНО-а соответствуют представлениям о том, что цитостатические противоопухолевые препараты в низких дозах вызывают клеточную смерть путем аутофагии, в средних (терапевтических) — путем апоптоза, в высоких дозах — путем некроза [14]. Полученные данные развивают новые представления о роли цитостатических лекарственных препаратов в высвобождении цитокинов в процессе индуцированной клеточной гибели.
Работа выполнена при финансовой помощи Министерства здравоохранения Республики Беларусь (грант № 20022584). Авторы выражают признательность Савицкому В.П. за содействие в проведении исследований методом проточной цитометрии.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
4. Потапнев М.П., Вашкевич Е.П., Савицкий В.П., Белевцев М.В., Исмаил-заде Р.С., Конопля Н.Е. Действие интерлейкина-2 на апоптоз и функциональную активность лимфоцитов человека в условиях воздействия цитостатиков in vitro. Вопросы онкологии. 2005; 51(6): 697—702.
9. Потапнев М.П. Аутофагия, апоптоз, некроз клеток и иммунное распознавание своего и чужого. Иммунология. 2014; 35(2): 95—102.
references
1. Dartsch D.c., Schaefer A., Boldt S., Kolch W., Marquardt H. Comparison of anthracycline-induced death of human leukemic cells: programmed cell death versus necrosis. Apoptosis. 2002; 7: 537—48.
ORIGINAL ARTICLE
2. Kim H.R., Lee M.W., Kim D.S., Jo H.Y., Chueh H.W., Jung H.L. et al. Etoposide sensitizes neuroblastoma cells expressing caspase 8 to TRAIL. Cell Biol. Intern. Rep. 2012: 19: art. 00017.
3. Lauber K., Ermst A., Orth M., Herrmann M., Belka C. Dying cells clearance and its impact on the outcome of tumor radiotherapy. Front. Oncol. 2012; 2: art. 116.
4. Potapnev M.P., Vashkevich K.P., Savitsky V.P., Belevtsev M.V., Izmail-zade P.S., Konoplya N.Ye. Interleukin-2 effect on apoptosis and function of human lymphocytes in in-vitro cytostatics culture. Voprosy onkologii. 2005; 51(6): 697—702. (in Russian)
5. Grossman S.A., Ye X., Lesser G., Sloan A., Carraway H., Desideri S. et al. NABTT CNS Consortium. Immunosuppression in patients with high-grade gliomas treated with radiation and temozolomide. Clin. Cancer Res. 2011; 17: 5473—80.
6. Stahnke K., Fulda S., Friesen C., Strauß G., Debatin K.-M. Activation of apoptosis pathways in peripheral blood lymphocytes by in vivo chemotherapy. Blood. 2001; 98: 3066—73.
7. Tohyama N., Tanaka S., Onda K., Sugiyama K., Hirano T. Influence of anticancer agents on cell survival, proliferation, and CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell-frequency in human peripheral-blood mononuclear cells activated by T cell-mitogen. Intern. Im-munopharm. 2013; 15: 160—6.
8. Ferguson T.A., Choi J., Green D.R. Armed response: how dying cells influence T-cell functions. Immunol. Rev. 2011; 241: 77—88.
9. Potapnev M.P. Autophagy, apoptosis, necrosis and immune recognition of self and non self. Immunologiya. 2014; 35 (2): 95—102. (in Russian)
10. Petyovka N., Lyach L., Voitenok N.N. Homologous ELISA for detection of oligomeric human TNF: properties of the assay. J. Immunol. Meth. 1995; 186: 161—70.
11. Chen G.Y., Nunes G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 2010; 10: 826—37.
12. Eigenbrod T., Park J.-H., Harder J.,Iwakura Y., Nunez G. Critical role for mesothelial cells in necrosis-induced inflammation through the recognition of IL-1, released from dying cells. J. Immunol. 2008; 181: 8194—8.
13. Vanden Berghe T., Kalai M., Denecker G., Meeus A., Saelens x., Vandenabeele P. Necrosis is associated with IL-6 production but apoptosis is not. Cell Sign. 2006; 18: 328—35.
14. Bursch W., Karwan A., Mayer M., Dornetshuber J., Frohwein U., Schulte-Hermann R. et al. Cell death and autophagy: Cytokines, drugs, and nutritional factors. Toxicology. 2008; 254: 147—57.
Поступила 13.05.16 Принята в печать 07.06.16
