CC BY
63
Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, №3, стр 477-482 © 2002, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА И АКТИВНОСТЬ ЕГО ИНДУКТОРОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ
Белевцев М.В., Петевка Н.В.*, Буглова С.Е., Мигаль Н.В., Потапнев М.П.
Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии,
*НИИ гематологии и переливания крови М3 РБ, Минск, Беларусь
Резюме. У 38 детей 3-17 лет с В-линейным острым лимфобластным лейкозом (OJIJI) изучена связь уровня TNF-a и активности его индукторов в плазме крови с абсолютным содержанием лейкозных клеток в периферической крови и наличием инфекционных осложнений у больных. Показано, что содержание в плазме крови TNF-a индукторов спонтанной продукции TNF-a моноцитами доноров крови у больных OJIJI не отличается от такового у 32 детей контрольной группы. Активность индукторов ЛПС-стимулированной продукции TNF-a моноцитами доноров крови была выше в группе больных детей. Не выявлена зависимость уровня TNF-a в плазме крови от наличия инфекционных осложнений. Обнаружена достоверная положительная корреляционная связь (Р=0,008) уровня TNF-a с абсолютным содержанием бластных (лейкозных) клеток в периферической крови больных с OJIJI.
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, плазма крови, фактор некроза опухолей альфа, индукторы.
Belevtsev М., Petyovka N.. Buglova S., Mygal N.. Potapnev M.
TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA AND ITS INDUCERS ACTIVITY IN PERIPHERAL BLOOD
OF CHILDREN WITH ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA
Abstract. The levels of TNF-a and its inducers were determined in plasma of 38 children from 3 to 17 years of age with B-lineage acute lymphoblastic leukemia (ALL) prior to any therapy. Plasma samples of 32 healthy children of the same age were used as control. It was found that the levels of TNFa and its spontaneous production inducers activity in culture of monocytes from healthy adult subjects (blood donors) in ALL patients did not significantly differ from control children. The activity of plasma inducers of TNF-a production by LPS-activated monocytes was higher in ALL patients as compared with control children. There were no association of infectious complications with the level of TNF-a in plasma of ALL patients. A significant positive correlation (P=0,008) was found between the level of TNF-a and absolute blast (leukemic) cell count in peripheral blood of children with ALL. (MedJmmunol., 2002, vol.4, N 3,pp 477-482)
Введение низма пациента на опухолевые клетки. Среди них
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) у детей, интересен фактор некроза опухолей альфа (TNF-a),
как и другие онкологические/онкогематологические являющийся цитокином первой волны . Он опре-
заболевания, вызывает реакции клеточного и гумо- Деляет тяжесть заболевания, кахексию у онкологи-
рального иммунитета. Цитокины являются важным ческих больных [1, 4, 8], воспалительный ответ у
компонентом гуморального иммунного ответа орга- онкологических больных [11, 13], стимуляцию про-
тивоопухолевого клеточного иммунного ответа [10], Адрес для переписки: апоптотическую гибель опухолевых клеток [14].
Потапнев Михаил Петрович, Уровень TNF-a является одним из факторов прогно-
Республиканский НПЦ детской онкологии и за заболевания [6, 12]. При острых лейкозах цито-
гематологии М3 РБ, кин синтезируется преимущественно моноцитами
223052, Минский район, п.о. Лесное больных [5,9,10,15], хотя и другие клетки, включая
Тел.: (10-17) 202-48-61, факс (10-17) 202-42-22 опухолевые, могут участвовать в этом процессе. Кли-
E-mail: [email protected]; ническое значение изменения уровня TNF-a в кро-
pOtü,pyieV@77lS.?ÏSyS.by ПрИ ОСТрЫХ ЛеИКОЗЭ.Х ОСТЭ.6ТСЯ Н6ЯСНЫМ [3]. По-
стоянно дебатируется вопрос о том, связано ли повышение уровня TNF-a у больных с острыми лейкозами с основным заболеванием или с инфекционными осложнениями, сопровождающими его [7, 11, 13]. Целью нашего исследования было выяснение того, связано ли появление TNF-a в крови детей, страдающих ОЛЛ, - с инфекционными осложнениями или с уровнем лейкозных клеток в периферической крови.
Материалы и методы
Была обследована группа из 38 детей, поступивших на лечение в Республиканский научно-практи-ческий центр детской онкологии и гематологии Минздрава Республики Беларусь (РНПЦДОГ) с января
1999 по октябрь 2000 года с первичным диагнозом В-линейный острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ). Обследование проводили до начала лечения по протоколу ALL-BFM-90-M. Возраст детей - от 3 до 17 лет (медиана - 10 лет), соотношение девочек и мальчиков -1:1,3. Больные дети имели следующие иммунологические субтипы лейкоза: у 5 больных - про-В ОЛЛ, у 18 больных - common-B ОЛЛ, у 15 больных
- пре-В ОЛЛ. Контрольную группу составили 32 практически здоровых ребенка, проживающих в детской деревне Kinder SOS Минского района и обследованных в рамках ежегодных диспансерных наблюдений в РНПЦДОГ. Возраст здоровых детей - от 5 до 15 лет (медиана - 9 лет), соотношение девочек и мальчиков - 1,1:1.
Все исследования проводили с образцами плазмы крови, взятой утром натощак у больных при поступлении в стационар для обследования и лечения. Кровь объемом 2-3 мл забиралась в стеклянные пробирки, содержащие ЭДТА, калиевая соль (Vacutainer, Becton Dickinson, США). После отстаивания при комнатной температуре в течение 1-2 часов пробирки центрифугировали при 1500 об./ мин., плазму стерильно переносили в пластмассовые пробирки Eppendorf объемом 1,5 мл, хранили при -80°С.
Для определения TNF-a в плазме крови (и супернатантах культур клеток) использовали «сэндвич»-метод иммуноферментного анализа (ИФ А) как описано ранее [2]. Концентрацию TNF-a в исследуемых образцах рассчитывали с помощью компьютерной программы Microcal Origin 3.5 по калибровочной кривой. Чувствительность определения составила 15 пг/мл. В качестве стандарта использовали рекомбинантный TNF-a фирмы Fermentas (Литва). При определении концентрации TNF-a в плазме крови ниже уровня чувствительности для расчета среднестатистических значений использовали расчетные (при их значении выше 0 пг/мл). При получении отрицательных расчетных значений (в группе больных ОЛЛ) мы их расценивали как 0 пг/мл.
Для определения индукторов TNF-a в плазме крови больных и детей контрольной группы использовали культуру моноцитов крови здоровых людей (доноров крови). Для этого в градиенте плотности фиколл-верографина(Б = 1,077 г/см3) выделяли мо-нонуклеарные клетки периферической крови, отмывали средой RPMI-1640 с 10% АВ (IV) сыворотки. Затем взвесь клеток (5 млн./мл) вносили по 1 мл в 24-луночные микропланшеты (Costar, Голландия). Клетки культивировали 1 час при +37°С. Неприлипшие клетки убирали трехкратным отмыванием средой RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, фирмы HyClone, США). К прилипшим клеткам (70-80% которых составляют CD14+ моноциты) добавляли среду RPMI-1640 с 10% ЭТС. В культуру моноцитов не вносили или вносили липополисахарид (ЛПС из E.coli 0111 В4, фирмы Sigma, США) в оптимальной конечной концентрации 20 нг/мл и исследуемые образцы плазмы в 10% конечной концентрации. Все варианты эксперимента ставили в дуплетах. Моноциты в конечном объеме 1 мл культивировали 18 часов при 37° С в атмосфере воздуха с 5% С02. Затем супернатанты собирали для оценки уровня продукции TNF-a. К окончанию культивирования при визуальной оценке клеток выявлен одинаковый уровень их жизнеспособности во всех вариантах.
Статистическая обработка данных проводилась с помощью прикладных программ Microsoft Excel
2000 и Statistica 5.0. Для подсчета достоверности различий групп данных и корреляционных взаимосвязей использовался Mann-Whitney U-test (Р) и корреляционный тест Спирмена (R) для непараметрических выборок.
Результаты и обсуждение
За последние годы оценка уровня TNF-a в крови больных ОЛЛ проводилась неоднократно. Большинство авторов отмечало повышение в разной степени уровня цитокина в крови детей с острыми лейкозами [8, 12]. По нашим данным (рис.1), в плазме крови больных ОЛЛ (п=38) и детей контрольной группы (п=30) определялся низкий уровень TNF-a ( 38,4 ± 8 и 30,7 ± 3 пг/мл соответственно, Р > 0,05). В группе больных ОЛЛ 15 из 38 пациентов имели расчетный уровень TNF-a ниже уровня чувствительности, в группе детей контроля - 4 из 30. Обращает на себя внимание более значительная индивидуальная вариабельность уровня TNF-a у больных ОЛЛ. В отличие от контрольной группы, у части больных ОЛЛ расчетное содержание цитокина в плазме крови было ниже “нулевого” значения. Это свидетельствует о наличии нескольких подгрупп больных ОЛЛ, различающихся по уровню циркулирующего TNF-a в плазме крови. Другими авторами также показано существование подгрупп больных
OJIJI с различной продолжительностью ремиссии заболевания, у которых уровень продукции TNF-a клетками (моноцитами) существенно различался [5].
Уровень TNF-a в крови пациентов зависит от присутствия в ней ингибиторов и индукторов цито-кина. Поэтому мы оценили в экспериментах in vitro влияние образцов плазмы крови больных ОЛЛ и здоровых детей на продукцию TNF-a моноцитами здоровых людей (доноров крови). Нами не было обнаружено различий влияния плазмы здоровых детей (п = 32) и больных ОЛЛ (п = 37) на уровень спонтанной продукции TNF-a (рисунок 2). В то же время образцы плазмы больных ОЛЛ оказывали стимулирующее действие (Р < 0,05) на продукцию TNF-a моноцитами, активированными ЛПС, по
сравнению с образцами плазмы крови здоровых детей. В присутствии образцов плазмы здоровых детей уровень продукции цитокина моноцитами был несколько ниже (Р > 0,05), а в присутствии образцов плазмы крови больных ОЛЛ был несколько выше (Р > 0,05), чем в культурах моноцитов, куда образцы плазмы детей не добавляли. По-видимому, в плазме крови больных ОЛЛ имеются индукторы, а в плазме крови здоровых детей - ингибиторы продукции Т№-а моноцитами доноров крови.
С помощью корреляционного анализа мы оценили наличие связи между уровнем спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции моноцитами доноров крови в присутствии плазмы здоровых и детей с ОЛЛ. Как показали расчеты, у больных ОЛЛ име-
180
150
120
г
О)
a
а"
I
Ц.
90
60
30
О 0^0 -5^%-
% О -с&хяхооо-
-О—
-0-0-
п □ D
О—
□ □п
о Больные ОЛЛ □ Контроль
Рис.1. Содержание ТЫР-а (пг/мл) в плазме крови больных с ОЛЛ (п=38) и здоровых детей контрольной группы (п=32)
1600
1200
2
Моноциты
Моноциты + ЛПС
Рис.2. Влияние индукторов плазмы крови больных ОЛЛ (п=37) и здоровых детей ОЛЛ (п=32) на уровень спонтанной продукции ТИР-а моноцитами и индуцированной продукции Т№-а моноцита-ми, активированными ЛПС. Контроль -(■) ~ культуры моноцитов крови здоровых людей (п=9) без внесения образцов плазмы крови.
Примечание: * Р<0,05
ется высокодостоверная положительная связь между этими показателями (R = 0,709; Р < 0,0001), у здоровых детей - нет (R = 0,142; Р>0,05). Это свидетельствует о синхронизации синтеза цитокина в различных условиях in vitro модуляторами (преимущественно индукторами), находящимися в плазме крови больных с ОЛЛ. Исследования других авторов были преимущественно направлены на выявление содержащихся в крови больных раком легких [14] и
желудочно-кишечного тракта [15] ингибиторов продукции Т№-а в культуре аутологичных моноцитов. Очевидно, в крови больных с онкологическими заболеваниями появляются как ингибиторы, так и индукторы продукции ТОТ-а, суммарная активность которых зависит от условий их определения.
Как отмечалось выше, повышение уровня ТЫБ-а в крови онкогематологических больных может быть связано как с основным заболеванием, так и с ин-
А
OI
О
S
*
ф
5
ф
2
X
о
со
LQ
70 > 60 ; 50 I 40 i
R=0,432
Ps0,008
TNFa, пг/мл
с;
S
о>
о
S
*
ф
S
Ф
2
х
н
о
Я
е;
ш
70 • 60 1
i R=0»221 !
; р=одю I
TNFa, пг/мл
в
S
о>
о
X
ф
2
х
¡3
С9
с;
Ш
1000
2000
3000 4000
TNFa, пг/мл
6000
Рис.З. Зависимость абсолютного содержания лейкозных (бластных) клеток в периферической крови больных ОЛЛ от уровня TNF-a (А) и ТМР-а - стимулирующей активности индукторов плазмы крови в культуре интактных (Б) и ЛПС-активированных (В) моноцитов здоровых людей.
фекционными осложнениями. При этом одновременное повышение уровней С-реактивного белка, (3-2-микроглобулина, интерлейкина-6 (1Ь-6), интер-лейкина-1Р (1Ь-1Р), гранулоцитарно-макрофагаль-ного колониестимулирующего фактора (СМ-С5Р), растворимого рецептора к ТЫР-а (эТКРИ) в крови, наличие лихорадки (повышение температуры тела более +38°С) свидетельствуют о воспалительной природе ответа организма больного на лейкозный процесс, осложненный или не осложненный инфекцией [4, 7, 9, И]. Исчезновение лихорадки и воспалительных процессов в органах и тканях больного через 7 дней после начала лечения ОЛЛ по протоколу АЬЬ-ВРМ-90 (“преднизолоновая профаза”) рассматривается как признак симптомов воспаления при ОЛЛ, в то время как при наличии инфекционных осложнений они сохраняются. На этом основании мы выделили две группы детей с ОЛЛ. Одна из них (п = 27) характеризовалась наличием воспалительного синдрома, характеризующегося такими инфекционноподобными “масками”, как артриты, периоститы, неревматоидный кардит, фурункулез, грипп, ОРВИ, лимфаденит, энтерит, гастрит, колит. Другая группа больных с ОЛЛ (п = 10) имела инфекционные осложнения различного генеза, документированные микробиологически и сохраняющиеся на фоне индуктивной фазы лечения ОЛЛ. По нашим данным, уровень 'ШР-сс у больных этих групп был соответственно 35±10 и 46±18 пг/мл. При оценке активности индукторов ТКР-а в плазме крови больных этих групп нами не выявлено достоверных различий показателей спонтанной продукции цито-кина в культуре моноцитов здоровых доноров (493±67 и 544±110 пг/мл соответственно). В то же время обнаружено некоторое повышение их активности у больных ОЛЛ с инфекционными осложнениями для показателей продукции цитокина ЛПС-стимулиро-ванными моноцитами (986±140 и 1674±617 пг/мл соответственно, Р>0,05). Другие авторы [4,9,11] также не выявили различий между уровнями ТЫР-а в сыворотке крови больных с ОЛЛ, имеющих или не имеющих инфекционные осложнения.
Наконец, нами была проанализирована связь концентрации Т№-а с уровнем бластных клеток в периферической крови - важным диагностическим и прогностическим фактором при ОЛЛ. Полученные данные показали наличие достоверной положительной корреляционной зависимости между уровнем ТЫР-а и абсолютным содержанием лейкозных (бластных) клеток в периферической крови больных ОЛЛ (К = 0,432; Р = 0,008; рис. ЗА). Исследования других авторов по оценке клинического значения уровня ТЫР-а в крови обнаружили прямую зависимость между этим показателем и состоянием обострения острого лейкоза у больных [7,8]. У больных ОЛЛ высокий уровень ТКР-а в крови ассоциировался с плохим ранним
ответом на терапию [6] или неблагоприятным отдаленным прогнозом заболевания [12]. Рядом авторов отмечается, что если повышенный уровень TNF-a в крови больных больше связан с прогрессией лейкозного процесса, то повышенный уровень IL-1, IL-6 - с инфекционными процессами [7, 11]. Дополнительно проведенный нами анализ не выявил зависимости активности индукторов TNF-a, вызывающих спонтанную или ЛПС-индуцирован-ную продукцию цитокина моноцитами доноров крови, с абсолютным количеством лейкозных клеток в периферической крови больных ОЛЛ (рис. ЗБ и ЗВ соответственно).
Таким образом, проведенные нами исследования выявили возможность как повышения, так и понижения уровня TNF-a, а также повышение активности индукторов TNF-a в плазме крови детей с ОЛЛ по сравнению с таковыми у контрольной группы. Анализ клинических и лабораторных данных выявил положительную достоверную корреляционную связь уровня TNF-a в плазме крови с абсолютным содержанием лейкозных клеток в периферической крови, но не с наличием сопутствующих инфекционных осложнений у детей с ОЛЛ.
Список литературы
1. Володько H.A., Былинский Б.Т., Кидар О.В. Оценка активности фактора некроза опухолей (ФНО) у онкологических больных // Вопросы он-кол,- 1994,- Т.40, № 4-6,- С.181 - 185.
2. Оганезов В.К., Майоров A.B., Панютич A.B., Пе-тевка Н.В., Лях Л.А., Пинегин Б.В., Порошина Ю.А. Продукция фактора некроза опухолей альфа при тяжелом атопическом синдроме // Иммунология. -1991.-,№.6.-С.75-76.
3. Урмаева М.М. , Митюшкина Т.А., Тимаков А.М. Инфекционные осложнения у детей с гемобла-стозами // Гематол. и трансфузиол. - 1999,- Т.44. -№.1,- С.38-39.
4. Abrahamsson J., Carlsson В., Mellander L. Tumor necrosis factor - alpha in malignant disease // Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol- 1993.-Vol.15.- P.364 - 369.
5. Aiso M., Iizuka Y., Kang HI., Sawada S., Ohshima T„ Horie T. The monocyte tumor necrosis factor alpha production in patient with leukemia in complete remission// Med. Oncol. Tumor Pharmacother. -1992.
- V.9. -P. 191-197.
6. Beksac M., Erturk S., Akan H., Кос H., Ilhan О. The clinical correlation of serum tumor necrosis factor alpha in acute leukemias: a predictor of response and relapse? // Leukemia. - 1993. - Vol. 7.
- P.1773-1776.
7. Catriu D., Hatzistilianou M., Agguridaki Ch., Athanassiadou F. Clinical correlations of serum TNF-a, IL- 1b, IL-6 and IL-8 in ALL in children // HAEMA. -1998.-Vol. l.-P. 177- 183.
8. Cetingul N., Yener E., Oztop S., Nisli G. Serum soluble interleukin-2 receptors and tumor necrosis factor-alpha in hematological malignancies of childhood // Acta Pediatric Jpn. - 1994. - V. 36. - P. 49 - 52.
9. Duru F., Ertem U., Tacyildiz N., Kirazli S. Production of granulocyte colony stimulating factor, granulocyte macrophage colony stimulating factor, and tumor necrosis factor alpha during remission and infections in patients with acute leukemia //J. Med. -1995. -Vol. 26.-P. 241-252.
10. Flieger D., Emmerich B„ Meyer N., Riethmuller G., Ziegler-Heitbrock H.W. Deficient production of tumor necrosis factor by peripheral blood monocytes in chronic lymphocytic leukemia // Int. T. Cancer. - 1990.
- Vol. 45. - P. 280 - 286.
11. shii E., Ohga S., Ueda K., Akazawa K. Serum IL-
1 and tumor necrosis factor activities in febrile children with acute leukemia. // Int. Journal Hematology. -1991.
- Vol. 54. - P. 79- 84.
12. Kalmanti M., Karamolengou K., Dimitriou H., Tosca A., Vlachonikolis I., Perki M., Georgoulias V.,
Kalmantis T. Serum levels of tumor necrosis factor and soluble IL-2 receptor as markers of disease activity and prognosis in childhood leukemia and lymphoma // Int. J. Hematol. - 1993. - Vol. 57. - P. 147-152.
13. Minamishima I., Ohra S., Ishii E., Matsuzaki A., Kai T., Akazawa K., Ueda K. Serum IL-6 and fever at diagnosis in children with acute leukemia // Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol. - 1993. - Vol. 15. - P. 239-244.
14. Martinet N., Charles T., Vaillant P., Vignaud J.M., Lambert J., Martinet Y. Characterization of a tumor necrosis factor-alpha inhibitor activity in cancer patients // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 1992. - Vol.
6.-P. 510-515.
15. Nara K„ Odagiri H., Fujii M., Yamanaka Y., Yakoyama M., Morita T., Sasaki M., Kon M., Abo T. Increased production of tumor necrosis factor and prostaglandin E2 by monocytes in cancer patients and its unique modulation by their plasma // Cancer Immunol. Immunother. - 1987. - Vol. 25. - P. 126-132.
поступила в редакцию 15.10.2001 принята к печати 04.12.2001
