Выделение штамма inonotusobliquus и интенсификация роста культуры при твердофазном культивировании Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Оригинальная статья / Original article

УДК 15.012.6: 615.339: 579.017.8: 579.24

DOI: https://doi.org/10.21285/2227-2925-2020-10-1 -95-106

Выделение штамма Inonotus obliquus и интенсификация роста культуры при твердофазном культивировании

© М.А. Сысоева, Л.Н. Уразлина, В.Р. Хабибрахманова, Т.В. Григорьева, Е.В. Сысоева

Казанский национальный исследовательский технологический университет, г. Казань, Российская Федерация

Резюме: В настоящее время повысился спрос на извлечения из гриба Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilat (чага), которые широко используют в медицине и косметике благодаря их высоким антиоксидантным свойствам. Поскольку природные ресурсы этого гриба ограничены, актуален поиск новых высокопродуктивных штаммов Inonotus obliquus и разработка способов его культивирования с накоплением им высоких концентраций основного действующего компонента - меланина. Целью настоящего исследования являлось выделение нового штамма Inonotus obliquus из природной чаги, введение его в культуру с регистрацией в международной базе данных, определение оптимальной среды культивирования для его лучшего роста и накопления меланинов с высокими антиоксидантными свойствами. Выделен новый штамм гриба Inonotus obliquus SUB2092728. Для его роста подобрана агаризованная питательная среда. Показано, что Inonotus obliquus SUB2092728 имеет максимальную скорость роста 2,18 мм/сут. на глюкозо-картофельной среде с началом пигментации на 8-е сутки роста. Введение в среду лекарственного препарата полифепан, содержащего гидролизованный лигнин, позволило интенсифицировать рост гриба и увеличить скорость его роста до 3,60 мм/сут. Установлено, что полученные меланины отличаются от меланина природной чаги меньшей степенью ароматичности, более высокой степенью алифатичности и проявляют антиоксидантные свойства на 16 % выше по сравнению с природным меланином, что позволит использовать их для разработки биологически активных добавок с антиоксидантными свойствами.

Ключевые слова: Inonotus obliquus, твердофазное культивирование, питательные среды, лигнин, биомасса, меланин, антиоксидантные свойства

Благодарности: Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках федеральной программы УМНИК «Хелснет НТИ», учрежденной Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере. Госконтракт № 13182ГУ/2018 от 31.05.2018 г. Тема НИОКР: «Разработка биотехнологии получения меланина».

Информация о статье: Дата поступления 13 октября 2019 г.; дата принятия к печати 25 февраля 2020 г.; дата онлайн-размещения 31 марта 2020 г.

Для цитирования: Сысоева М.А., Уразлина Л.Н., Хабибрахманова В.Р., Григорьева Т.В., Сысоева Е.В. Выделение штамма Inonotus obliquus и интенсификация роста культуры при твердофазном культивировании. Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2020. Т. 10. N 1. С. 95-106. https ://doi.org/10.21285/2227-2925-2020-10-1 -95-106

Isolation of the Inonotus obliquus chaga mushroom strain and intensification of a culture growth during solid-phase cultivation

Maria A. Sysoeva, Lyaysyan N. Urazlina, Venera R. Khabibrakhmanova, Tatyana V. Grigoryeva, Elena V. Sysoeva

Kazan National Research Technological University, Kazan, Russian Fédération

Abstract: The extracts from fungus Inonotus obliquus (Pers.:Fr.) Pilat (chaga), which have been widely used in medicine and cosmetics due to their high antioxidant properties, are in evergrowing demand currently. Since fungus natural resources are limited, the search for new highly productive Inonotus obliquus strains and the methods for its cultivation development with the high production ability of the main active component - melanin, are relevant. The aim of the present study was to isolate a new Inonotus obliquus strain from natural chaga, introduce it into a standard culture registered in an international database, as well as determine the optimal cultivation environment for the procurement of melanins with high antioxidant properties. A new strain of the fungus Inonotus obliquus SUB2092728 was isolated. For its growth, an agar nutrient medium was selected. It was shown that Inonotus obliquus SUB2092728 has a maximum growth rate of 2.18 mm/day in a glucose-potato medium with the onset of pigmentation on the 8th day of growth. The introduction of the hydrolysed lignin-containing drug Polyphepan into the environment made it possible to intensify the growth of the fungus and increase its growth rate up to 3.60 mm/day. It was established that the obtained melanins differ from the natural chaga melanin in terms of a lower degree of aromaticity and a higher degree of aliphaticity, as well as exhibiting antioxidant properties 16 % higher than natural melanin, making them suitable for use in the development of biologically active additives having antioxidant properties.

Keywords: Inonotus obliquus, solid-phase cultivation, growth media, lignin, biomass, melanin, antioxidant properties

Acknowledgements: The work was performed under the Russian Federation Ministry of Education and Science financial support within the federal program UMNIK «Helsnet NTI» produced by the «Fund for the Small Forms of Enterprises Promotion Development in the Scientific and Technical Sphere». The State contract N 13182GU/2018 dated 05.31.2018. R&D theme: «Development of biotechnology for obtaining melanin».

Information about the article: Received October 13, 2019; accepted for publication February 25, 2020; available online March 31, 2020.

For citation: Sysoeva MA, Urazlina LN, Khabibrakhmanova VR, Grigoryeva TV., Sysoeva EV. Isolation of the Inonotus obliquus chaga mushroom strain and intensification of a culture growth during solid-phase cultivation. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya = Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2020;10(1):95-106. (In Russian) https://doi.org/10.21285/2227-2925-2020-10-1-95-106

ВВЕДЕНИЕ

Березовый гриб Inonotus obliquus ^ге.: Fr.) Pilat - чага, и экстракты на его основе широко применяют в терапии и профилактике желудочно-кишечных, онкологических и ряда других заболеваний [1-5]. Среди метаболитов, которые чага накапливает в процессе естественного роста на березе, наибольшую фармацевтическую ценность представляет меланин. Известно, что он является активным действующим компонентом ряда лекарственных средств, в том числе бефунгина [5, 6]. Рост гриба в природных условиях и накопление им целевых продуктов происходит в течение длительного периода времени - более 4-5 лет [7]. В связи с этим актуальной задачей является поиск и выделение новых высокопродуктивных штаммов гриба Inonotus obliquus в культуру, а также подбор субстратов, которые позволят обеспечить более высокие показатели роста и наибольшее накопление меланина.

В настоящее время известно большое количество штаммов Inonotus obliquus, используемых для выделения из них меланина и других биологически активных веществ (БАВ) [8-18]. Выход меланина при культивировании различных штаммов на агаризованных средах в течение

30-35 дней составляет 5,9-13,8 % от биомассы гриба [19].

Цель работы: выделить из природной чаги, ввести в культуру, зарегистрировать в международной базе данных новый штамм Inonotus obliquus и выявить среды с различными источниками углеводов и лигнина для его лучшего роста и накопления им меланинов с высокими антиоксидантными свойствами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выделение культуры Inonotus obliquus. Плодовые тела чаги были собраны в республике Марий Эл, Россия. Выделение чистой культуры проводили тканевым методом [20]. Для устранения контаминации плодовые тела чаги перед посевом на питательную среду обрабатывали дезинфицирующим раствором -0,5 % перманганата калия. Культивирование проводили на агаризованной среде при температуре 27±2 °С в течение 10 суток. Хранили культуру при температуре 4±2 °С, пересеивали каждые 3 месяца.

Идентификация домена ITS. Определение первичных нуклеотидных последовательностей ДНК проводили с помощью секвенирования по методу Сэнгера1.

1 Соловьева В.В., Моров А.Р., Ризванов А.А., Сабиров Р.М. Молекулярно-генетический анализ беспозвоночных животных по нуклеотидной последовательности гена 18S рибосомной РНК: учеб. пособие. Казань: Изд-во Казанского федерального ун-та, 2011. 52 c.

Постановку сиквенсной реакции проводили с использованием ген-специфических праймеров ITS1 (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3) и ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3), а также набора реактивов Big Dyе Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Использовали 2-5 мкл очищенного ПЦР-про-дукта в количестве от 10 до 50 нг, в зависимости от длины ПЦР-продукта, добавляли 1 мкл 3,2 пико Моль праймера, 0,8 мкл Ready Reaction Mix, 1,6 мкл 5X Sequencing Buffer и воду до объема 10 мкл. Для подтверждения мутации прочтение осуществляли с обоих праймеров (прямого и обратного). Реакцию проводили с использованием амплификатора Veriti (Applied Biosystems, США) по следующему температурному протоколу: предварительная денатурация при 96 °С - 1 мин; 26 циклов при 96 °С по 10 с, 50 °С - 5 с, 60 °С - 4 мин. Секвенирование продуктов ПЦР осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems, США) на базе Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета.

Подбор питательной среды для культивирования. Штамм Inonotus obliquus SUB2092728 выращивали в чашках Петри на глюкозо-картофельной агаризованной (ГКА) среде при температуре 27±2 °С в течение 5-7 дней. Затем из зоны роста культуры вырезали высечку диаметром 5-9 мм и помещали ее в центр чашки Петри со средой другого состава:

1) глюкозо-пептонная агаризованная (ГПА) среда. Состав, г/л: глюкоза - 30,0; пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,0; KH2PO4 - 1,0; MgSÜ4 -0,5; объем доведен до 1 л [21];

2) овсяный отвар агаризованный (ООА). Зерна овса массой 30 г помещали в 970 мл водопроводной воды, кипятили в течение 1 ч, настаивали 12-15 ч, фильтровали. Фильтрат доводили до 1 л добавлением к нему 20 г агара [20];

3) ГКА среда. Картофель массой 200 г измельчали и варили 30 мин в 1 л воды, фильтровали. Фильтрат доводили до оъема 1 л водой и добавляли к нему 20 г глюкозы и 20 г агара [20].

Культивирование штамма Inonotus obliquus SUB2092728 на всех средах проводили при температуре 27±2 °С в течение 30 суток.

Подготовка лигнинсодержащих добавок. Полифепан - лекарственный препарат, состоящий из гидролизованного лигнина древесины, растирали в ступке и вносили в среду в количестве 0,1 и 1,0 г/л. Кору дуба измельчали до размера частиц меньше 0,85 мм (20 mesh), добавляли воду в соотношении 1:10, кипятили в течение 15 мин и фильтровали. Полученный отвар коры дуба вносили в среду в количестве 1 мл. Древесину березы измельчали до размера частиц меньше 0,85 мм (20 mesh) и вносили в среду в количестве 10 г/л. Все добавки вводили в среду перед ее стерилизацией.

Определение ростового коэффициента. Через каждые двое суток культивирования определяли высоту, плотность и диаметр колонии [20]. Плотность колонии оценивалась по трехбалльной системе: 1 - редкая, мицелий редкий, плохо различимый невооруженным глазом; 2 - средняя, субстрат различим; 3 -плотная, субстрат не виден. Ростовой коэффициент (РК) рассчитывали по формуле:

PK = (D ■ h ■ g) /t,

где D - диаметр колонии, мм; h - высота колонии, мм; g - плотность колонии, баллы; t - возраст колонии, сут.

Определение выхода биомассы. Мицелий снимали с агаризованной среды с помощью скальпеля и пинцета. Для отделения остатков агаризованной среды от биомассы к снятому мицелию добавляли дистиллированную воду в соотношении 1:10 и кипятили в течение 1-2 мин. Биомассу отфильтровывали через двойной тканевый шелковый фильтр на воронке Бюхнера с использованием водоструйного насоса и высушивали при комнатной температуре. Выход биомассы определяли гравиметрически [19].

Определение содержания меланина. Экстракцию меланина из биомассы осуществляли в течение 2 ч на кипящей водяной бане 2%-м раствором NaOH с коэффициентом разбавления 1:100 [21]. Полученный экстракт охлаждали и подкисляли 25%-м раствором HCI до рН = 2,0. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 6000 g в течение 15 мин и растворяли в 2%-м растворе NaOH. Измерение проводили на спектрофотометре UNICO 2800 UV/VIS при длине волны 490 нм. Содержание меланина определяли по калибровочной кривой, в качестве стандарта использовали меланин, выделенный из природной чаги, в диапазоне концентраций 0,02-0,2 мг/мл.

Содержание фенольных соединений определяли спектрофотометрическим методом Фолина - Чокальтеу. Оптическую плотность растворов определяли при длине волны 735 нм [22]. Для построения калибровочной кривой использовали галловую кислоту в диапазоне концентраций 25-200 мкг/мл.

Определение антиоксидантной активности. Определение суммарного содержания анти-оксидантов в исследуемых образцах проводили амперометрическим методом на приборе Цвет Яуза 01-AAA (НПО «Химавтоматика», Россия) по методике, представленной в работе [23]. Калибровочную кривую строили по кверцетину в диапазоне концентраций 0,2-4,0 мг/л.

Элементный состав меланинов определяли на автоматическом CHNS-анализаторе РЕ 2400 Series II. Содержание кислорода рассчитывали по разнице C, H и N. Для анализа готовили образцы с влажностью не более 8 %.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы Statistica 10.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и идентификация Inonotus obliquus SUB2092728. Проведено определение последовательности и филогенетическая оценка выделенной культуры (рис. 1-3). Получен качественный сиквенс длинной в 729 последовательностей олигонуклеотидов. Культура зарегистрирована в базе данных Genbank Overview с присвоением номера SUB2092728 и учетного номера MH918775.1.

»ЧН918775 1 Inonotus obliquus »train SUB2092728 internal transcribed »рас»- \J partial

sequence. 5.8S ribosomal R'l- gen« and internal transcribed spacer 2, complete sequence,

and la-ge subunix ribosomal gene, partial sequence

б^ТТТАТТГТйАМТСОАЗв<5йССТОТвСТббСАСООАА^бТ^бСАТОТбСАСвКСТТТСОТбСТС

AAATCCAACTCTCMACCCCTGTGCACCTATACAAGTTGAAGGTCTTAGTAGTTTCTGTMTCGAACGGC

AAG TCAAGTAC GTC6AGT AATCAAGT AC GA GGG ~ TTCGGCCCT TGGAAAGT G7GAAДДО TGQAAAGG CAA

GCTTCAGMACAAGGdGACGAAAAGGCTTTTGGCTTCATTACAAACACCAATATAATTGTTAT6TGAATG

AAATGCTtCTTGTGGGCbft ГAATAAAT4CAACTITCAACAACC-GATCTCTftGCCTCTCGCATCGATGAAG

AACGCAGCGAAA"GCGATAA6TAATGTGAATT6CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCT

TQC6CCCCTTG6TATTCCGi66GGCATGCCT6TTTGAGTG^CAT<rrrAATCTCAAATCGCTCQTCTATTT

TTAjiT^GAAGTGGCTT^CSi^TTSGACTTSGASSTTTTGCTiJSCCCSSiKGACTTTGCTTeCCCTTCSTT

TSTCGGCTCCTC^CAAATACATTi^GGACTTTG^^

ААаХбСТТОСГГААСААаТСТОСТТСТААТТбТССТТДАб^бОАСАЛе^ TTGACACCTTT6ACC TCAAATCAGGTAGG

Рис. 1. Последовательность олигонуклеотидов Inonotus obliquus SUB2092728

Fig. 1. Oligonucleotide sequence of Inonotus obliquus SUB2092728

С помощью программного пакета BLAST NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) установлены наиболее близкие к SUB2092728 штаммы Inonotus obliquus: IOSF373816, NAAS02305, F1501, MDJCBS88, зарегистрированные в базе данных GenBank (рис. 2).

In or otas cbnauus siren 5Ua2WZ .¿8 ntt'ivsl moscnbe: space-1 Mrtai апнвж. i3S eobcnai fthA gen ' CD OC'4 MMilKI5J InwobULsHKUA »iranlOS£373a!Ojilf!T:atyan»;r'Ji«d»»c»i 1 patta мрмп» ' 55 i-Di-tojualflHAg«« 99564 М»,150Э2Д < Ircrous аЫиш» во ale HUU841I № nboxxrai RNA ere poriai хсдегсе rta-аэ япжявса apocc 1 69 56N KW12W7 1

1го*оы» о&вии» iso«tt c&e$SiM iBStoowmaifiNAeene eeown»; namanra^eer»« «оемт i. W4S% GuWJOOO.l

Inonutj» вЫиш*»Ban F15QI intarnd «era space- 1 t»tal secant.« S Ц гЬистЫ IttiA 9«na ana n 59 45% КУН9235 '

Iro-ou; ct>i3uj! no ale ' К» -емсна) xnt. свод sequtnse pf.ena 1гаг»згэев »cacer' i.bi 0944% FJIW41

Inoootiis abuoujLalietiJH&iC35Sa 1SS rfccaomal ftHA atfc иШяЬециепсе rtenuilumtJtBSjpacciI 69Э1Ч QC 10303.1

iro^orj: jOraujt eoaw nar • *ЯЛа1 :rarscew swear i ojirw: wwprcs s 'Wow чыа geis вгч: 69 17N "ЛМЙССЙ

Рис. 2. Сравнение идентичности генетической последовательности Inonotus obliquus SUB2092728 с базой данных NCBI

Fig. 2. Inonotus obliquus SUB2092728 genetic sequence comparison with the NCBI database

Полученные результаты анализа культу-рально-морфологических признаков, а также ДНК-секвенирования выделенной культуры подтверждают, что она действительно является штаммом базидиального гриба Inonotus obliquus.

'Inonotus obliquus 18S ribosomal RNA gene, partial scquencc; internal transcribed spacer 1,5,8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Г"

^■baeidiomycetes 13 leaves <»

ainoaotus obliquus isolate ENEF19 I llnonoUKobliquus isolateENEF18 i 'lno:»otui obliquus isolate ENEF17

|-i ^Lwootus obliquus isolate ENEF15

i »Inonotus obliquus isolate ENEF12

-^basidiomycete! I 2 leaves

; laonotus obliquus strain 39415DRJ I Inonotus obliquus strain 34915JDRJ i inonotus obliquus strain 3?715aDRJ i »Inonotus obliquus strain 37215bDRJ < inonotus obliquus strain 36715bDRJ * »Inonotus obliquus strain 36515DRJ ' ►Iaonotus obliquus strain 38915DRJ inonotus obliquus strain 37C15DRJ Inonotus obliquus strain 36115DRJ

Inonotus obliquus isolate J V 0408/36 Inonotus obliquus strain LE-BIN 2616 f Inonotus obliquus strain Pi 501

n-^Inonotus obliquus isolate inon-1

_tf Inonotus obliquus isolate B2_13064168 clone 1

* Inonotus Obliquus isolate B2_l 3064168 clone 2 r—Inonotus obliquus strain MDJCBS88 Inonotus obliquut strain NAASO2305

-"*TnojioniS obliquus strain TFO Kivftl

luouotus obliquus strain IOSF373816 ? IriumHus obliquus isolate SH5

' -a Inonotus obliquus strata HAI1253

Inonotus obliquus isolate HLJTJS418

-»Inonotus obliquus isolate FK7696 voucher F323S3

Inonotus obliquus isolate FS656163

¡0.01

Рис. 3. Филогенетическое древо Inonotus obliquus SUB2092728 Fig. 3. Phylogenetic tree analysis of 18 Basidiomycota ITS nucleotide sequences 98 ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICOCHEMICAL BIOLOGY

Рис. 4. Начало пигментирования колонии штамма гриба Inonotus obliquus SUB2092728 на агаризованных средах: а - ГКА; b - ГПА; c - ООА

Fig. 4. Colony pigmentation beginning of Inonotus obliquus SUB2092728 strain on agar culture media: a - Glucose-potato; b - Glucose-peptone; c - Oat Decoction

Выбор среды культивирования для Inonotus obliquus SUB2092728. Место и условия произрастания гриба Inonotus obliquus оказывают существенное влияние на метаболизм выделяемого гриба. При этом для каждого штамма необходимо подбирать индивидуальные условия и стимулирующие компоненты для его лучшего роста и накопления целевых продуктов. Согласно литературным данным, для культуры Inonotus obliquus в качестве базовой питательной среды используют различные агаризованные среды: глюкозо-пеп-тонную среду, картофельно-глюкозный агар, солодово-пептонный агар, а также среды с овсяным экстрактом или мукой, соломой и т.д. В качестве источников углерода обычно используют глюкозу, азота - пептон или природные экстракты (кукрузный, дрожжевой, овсяный и др.), а также неорганические соединения ((N44)2804, N^N03, N440!, ^Н4)2НР04, NH4H2P04, №N03, ^Оз) [8-19, 21]. В данной работе для выбора базовой среды для культивирования Inonotus obliquus 8иВ2092728 исследовались три агаризованные питательные среды: ГКА, ГПА, ООА. Показано, что на 2-е сутки выращивания штамма на всех питательных средах наблюдается рост мицелия, при этом колонии были белого цвета. Гриб Inonotus obliquus образовывал на средах ГКА и ГПА плотные пушистые войлочные колонии, а на ООА они были рыхлыми и ватообразными. Их окрашивание в светло-желтый цвет начиналось на среде ГКА на 8-й день, на среде ГПА - на 11-й день, а на среде ООА - лишь на 20-й день культивирования. В ходе дальнейшего роста колонии приобретали коричневую окраску (рис. 4).

Характер роста культуры на средах ГКА, ГПА и ООА представлен на рис. 5.

Как видно из графиков, представленных на

Продолжительность культивирования, сут.

Рис. 5. Ростовые коэффициенты Inonotus obliquus SUB2092728 на агаризованных средах

Fig. 5. Growth coefficients of Inonotus obliquus UB2092728 on agar culture media

рис. 5, использование среды ГКА позволяет сократить лаг-фазу на 2-е сутки по сравнению с использованием других сред. Ростовые показатели культуры Inonotus obliquus SUB2092728 на среде ГКА в 3 раза выше по сравнению с показателями на ГПА и в 15 раз больше по сравнению с ООА.

Из данных, приведенных в табл. 1, видно, что применение среды ГКА позволяет увеличить скорость роста Inonotus obliquus SUB2092728 в 1,5-3 раза по сравнению с использованием других сред. Культура, выра -щенная на среде ГКА, имеет высокий выход биомассы и меланина, что соответственно в 1,5 и 2 раза больше по сравнению с использованием среды ГПА. Штамм Inonotus obliquus SUB2092728, выращенный на среде ООА, имел редкий мицелий, поэтому полученного количества продукта было недостаточно для определения выхода биомассы и накопленного ею меланина.

Таблица 1

Выход биомассы и накопление меланина у гриба Inonotus obliquus SUB2092728, выращенного на агаризованных

питательных средах, на 30-е сутки культивирования

Table 1

Biomass yield and melanin accumulation by Inonotus obliquus SUB2092728 fungus, grown on agarized culture media at the 30th day of cultivation

Среда Скорость роста, мм/сут. Выход биомассы, мг/см2 Содержание меланина,

мг/см2 %*

ГКА 2,13 2,38±0,22 0,15±0,003 6,67±0,09

ГПА 1,50 1,59±0,09 0,06±0,002 4,59±0,12

ООА 0,64 - - -

Примечание. * - от абсолютно сухой биомассы.

Для объяснения лучшего роста штамма Inonotus obliquus SUB2092728 на среде ГКА проанализирован углеводный состав исполь-зованных в работе сред (табл. 2).

По содержанию моносахаридов наилучшие показатели, способные удовлетворить рост гриба, имеют среды ГПА и ГКА, допол -нительным источником питания в последней среде может служить сахароза.

Таблица 2

Содержание углеводов в питательных средах2

Table 2

Carbohydrate content in culture media2

Источник углерода Содержание, г/л

Среда

ГКА ГПА ООА

Моносахариды:

глюкоза 2,14 3 0,02

фруктоза 0,02 - -

арабиноза - - 0,01

галактоза - - 0,01

ксилоза - - 0,02

Олигосахариды:

сахароза 0,12 - 0,27

раффиноза - - 0,02

Полисахариды: крахмал 3,0 - 11,0

Наряду с простыми углеводами большинство штаммов Inonotus obliquus могут использовать в качестве источника углерода крахмал [5, 16, 19]. Кроме того, в крахмале в следовых количествах могут содержаться стимулирующие

рост гриба вещества. Однако увеличение содержания крахмала в среде с уменьшением количества глюкозы, как, например, в среде ООА, не приводит к улучшению показателей роста и выхода биомассы. По-видимому, предпочтительным источником энергии для Inonotus obliquus SUB2092728 является глюкоза, которая содержится в достаточном количестве в среде ГКА. Так, один из новых штаммов Inonotus obliquus, полученный китайскими учеными [10], по генетическим характеристикам наиболее близкий к штамму F1501, а, следовательно, и к SUB2092728, показывает значительное увеличение биомассы при добавлении в питательную среду раствора глюкозы на 5-8-е сутки культивирования.

Исследование влияния источников лигнина в питательной среде на рост гриба Inonotus obliquus SUB2092728 и накопление им меланина. Для увеличения выхода биомассы и БАВ при культивировании Ino-notus obliquus исследовалось добавление к базовой питательной среде самых разных компонентов: аминокислот, витаминов [8], органических растворителей (метанол, этанол, ацетон, хлороформ, толуол), жирных кислот (линолевая, олеиновая, пальмитиновая, стеариновая), поверхностно-активных веществ (Твин 20, Твин 80, CHAPS, Тритонкс-100, ПЭГ 4000) [11], гидролизованной лигнинце-ллюлозы [12], эктрактов бересты и древесины березы [13]. В работе [14] показано, что для биоконверсии Inonotus obliquus может использовать лигнин-целлюлозное сырье (пшеничные отруби, пшеничную и рисовую солому, скорлупу арахиса, жмых сахарного трост -ника, кожуру маниоки, ветви березы и бука).

Выращивание культуры рода inonotus может довольно успешно осуществляться и непосредственно на березовых блоках [24]. При добавлении в питательную среду гидроли-зованной лигнинцеллюлозы при культивировании штамма Inonotus obliquus CBS314.39 наблюдается существенное увеличение содержания белка, углеводов, а также повышение антиоксидантной активности экзополисахарид-ной фракции [12].

В данной работе с целью увеличения выхода биомассы и меланина при культивировании Inonotus obliquus SUB2092728 к питательной среде добавляли опилки березы, отвар коры дуба и полифепан. Опилки березы выбраны как лигнинсодержащий субстрат, используемый грибом в природных условиях [6, 7].

Полифепан представляет собой гидроли-зованный лигнин древесины и может облегчить его усвоение грибом.

2 Скурихин И.М. Химический ДеЛи принт, 2002. 236 с.

состав российских пищевых продуктов: справочник. М.:

Отвар коры дуба содержит дубильные, фенольные и другие биологически активные вещества, которые гриб может использовать в своем метаболизме, и, возможно, они могут оказать стимулирующее воздействие на рост биомассы и синтез меланина.

Рассчитано содержание фенольных соединений и лигнина в мг на 1 см2 поверхности среды на основе ГКА (табл. 3).

Таблица 3

Содержание лигнина и фенольных соединений в питательной среде на основе ГКА

Table 3

Lignin and phenolic compounds content of Glucose-potato based nutrient media

Источник лигнина и фенольных соединений Содержание лигнина, мг/см2 Содержание фенольных соединений, мг/мл

Опилки березы 10 % 0,62* 0,143±0,02

Отвар коры дуба 1 мл - 1,419±0,18

Полифепан 0,01 % 0,31** 0,0004±0,00001

Полифепан 0,10 % 3,13** 0,0049±0,0001

Примечание. * - литературные данные [25];

** - содержание в лекарственной форме

«Полифепан».

Как видно из представленных в табл. 3 данных, содержание лигнина в средах отличается на порядок. При этом наблюдаются более высокие концентрации фенольных соединений в среде с отваром коры дуба и низкие - в среде с гидролизованным лигнином.

Проведено исследование влияния лигнин-содержащих добавок в среду на рост гриба Inonotus obliquus 8иВ2092728 при твердофазном

культивировании на среде ГКА (рис. 6).

80

0 5 10 15

Продолжительность культивирования, сут.

Рис. 6. Ростовые коэффициенты Inonotus obliquus SUB2092728 в процессе культивирования на средах с различными источниками лигнина

Fig. 6. Growth coefficients changes of Inonotus obliquus SUB2092728 during cultivation on media with different lignin sources

При использовании всех добавок к ГКА на 8-е сутки наблюдается пигментация мицелия. При добавлении к среде опилок березы и полифепана в разных концентрациях наблюдается лучший рост штамма Inonotus obliquus SUB2092728 по сравнению с его культивированием на других средах (табл. 4, см. рис. 6). В отличие от контроля у колоний, выращенных на средах с полифепаном и опилками, переход в стационарную фазу наблюдается уже на 7-е сутки. Установлено, что рост гриба Inonotus obliquus SUB2092728 стимулирует наличие в среде от 0,31 до 3,13 мг/см2 лигнина.

Результаты выращивания штамма гриба на среде ГКА с добавлением отвара коры дуба оказалось неэффективным, возможно, из-за высокого содержания в нем фенольных веществ и практически отсутствия лигнина (см. табл. 3). Это также подтверждается данными по накоплению грибом биомассы и меланина (табл. 4).

Таблица 4

Выход биомассы и накопление меланина на тридцатые сутки культивирования Inonotus obliquus SUB2092728 на питательных средах с внесением различных источников лигнина

Table 4

Biomass yield and melanin accumulation on the 30th day of Inonotus obliquus SUB2092728 cultivation on nutrient media with a various lignin sources addition

Среда Средняя скорость роста, мм/сут Выход биомассы, г/см2 Содержание меланина,

мг/см2 %*

Контроль 2,13 2,38±0,22 0,15±0,0032 6,67±0,09

Опилки березы 10% 3,17 5,87±0,32 0,58±0,0040 14,53±0,16

Полифепан 1,0% 3,50 5,71±0,15 0,55±0,0033 15,78±0,34

Полифепан 0,1% 3,60 5,08±0,24 0,53±0,0035 13,70±0,28

Примечание. * - от абсолютно сухой биомассы.

Согласно полученным данным, использование гидролизованного лигнина (полифепана) в составе среды культивирования позволяет увеличить скорость роста Inonotus obliquus SUB2092728 в 1,5 раза по сравнению с контролем.

Независимо от источника лигнина, внесенного в питательную среду, выход биомассы, а также содержание в ней меланина выше в 2 раза по сравнению с контролем.

Из литературных данных известно, что штамм Inonotus obliquus В-26 на среде ГПА образует меланин в количестве 13,8 % от абсолютно сухой биомассы [19], в то время как Inonotus obliquus SUB2092728 накапливает меланин до 15,8 % на среде ГКА с добавлением полифепана в концентрации 1,0 %.

Для оценки качества полученного меланина проведено сравнение физико-химических харак-

теристик меланинов, выделенных из биомассы штамма Inonotus obliquus SUB2092728, с природным меланином чаги.

Анализ элементного состава исследуемых образцов (табл. 5) показал, что в меланинах, выделенных из культивируемой чаги, содержание углерода в 1,5 раза ниже, чем в меланинах, выделенных из природной чаги. Количество азота в меланинах, выделенных из культивируемой чаги, выше по сравнению с меланином из природной чаги в 2 раза. Кроме того, они имеют в 3 раза более высокое отношение О/С по сравнению с меланином природной чаги. Это свидетельствует о меньшей степени их ароматичности - в 2 раза ниже. Значения мольных отношений С/Н и Н/С указывают на более высокую степень алифатичности меланинов из культивируемых штаммов в сравнении с выделенными из природной чаги.

Таблица 5

Элементный состав и антиоксидантная активность меланинов чаги

Table 5

Chaga melanins antioxidant activity and elemental composition

Меланин С,% Н,% N,% О,% О/С Н/С С/Н Антиоксидантная активность меланина, мг/г *

Из природной чаги 53,6±1,0 4,2±0,2 0,29±0,05 41,8±0,2 Q,59 Q,Q7 12,76 88,79±0,79

В-26 ** 38,2±0,1 5,5±0,2 5,8±0,1 50,4±0,2 1,32 Q,15 6,89 -

Контроль 38,6±0,3 6,3±0,2 1,4±0,1 53,5±0,4 1,38 Q,16 6,Q8 42,37±0,60

Опилки березы 10% 36,7±0,5 6,3±0,0 2,2±0,1 54,6±0,7 1,48 Q,17 5,8Q 64,93±0,097

Полифепан Q,1% 33,9±0,1 6,1±0,2 1,9±0,1 57,7±0,0 1,7Q Q,17 5,48 88,64±2,88

Полифепан 1 ,Q% 34,3±0,8 6,1±0,3 1,2±0,1 58,3±1,2 1,7Q Q,17 5,43 102,96±0,70

Примечание. * - в пересчете на кверцетин; ** - литературные данные [26].

Несмотря на существенные отличия элементного состава меланинов, полученных при добавлении в среды полифепана и выделенных из природной чаги, они имеют близкие значения антиоксидантной активности, в 2 раза превышающие контроль (см. табл. 5).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, выделен, идентифицирован и введен в культуру еще один высокопродуктивный по биомассе и меланину штамм гриба Inonotus obliquus. Показано, что Inonotus obliquus SUB2092728 имеет максимальную скорость роста - 2,18 мм/сут., на среде ГКА с началом пигментации на 8-е сутки

роста. Подбор источника лигнина позволил интенсифицировать рост гриба и увеличить скорость его роста до 3,60 мм/сут. Установлено, что меланины, выделенные из культивируемого штамма на 30-й день культивирования, близки между собой и отличаются от меланина природной чаги. Для них показана в 2 раза более низкая степень ароматичности и в 2 раза более высокая степень алифатичности по сравнению с меланином природной чаги. Установлено, что меланин, полученный при добавлении в среду полифепана в концентрации 1,0 г/л, имеет более высокую антиоксидантную активность - на 16 % большую, чем у природного меланина, и в 2 раза превышающую контроль.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК

1. Zheng W., Miao K., Liu Y., Zhao Y., Zhang M., liquus and submerged culture strategies for

Pan S., et al. Chemical diversity of biologically upregulating their production // Applied Microbio-

active metabolites in the sclerotia of Inonotus ob- logy and Biotechnology. 2010. Vol. 87. Issue 4.

P. 1237-1254. https://doi.org/10.1007/s00253-010-2682-

2. Szychowskia K.A., Rybczynska-Tkaczykb K., Tobiasza J., Yelnytska-Stawasza V., Pomianekc T., Gminskia J. Biological and anticancer properties of Inonotus obliquus extracts // Process Biochemistry. 2018. Vol. 73. P. 180-187. https://doi.org/10.1016/ j.procbio.2018.07.015

3. Seo H-K., Lee S-C. Antioxidant activity of subcritical water extracts from chaga mushroom (Inonotus obliquus) // Separation Science and Technology. 2010. Vol. 45. Issue 2. P. 198-203. https://doi.org/10.1080/01496390903423899

4. Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarov V.G., Wagner H., Verpoorte R., Heinrich M. Medicinal plants of the Russian Pharmacopoeia; their history and applications // Journal of Ethnopharmacology.

2014. Vol. 154. Issue 3. P. 481-536. https://doi.org/ 10.1016/j.jep.2014.04.007

5. Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидомицеты в чистой культуре: монография. Пенза: РИО ПГСХА, 2013. 222 с.

6. Сысоева М.А. Высокодисперсные коллоидные системы и меланин чаги: монография. Казань: Изд-во КНИТУ, 2013. 226 c.

7. Огарков Б.Н., Огаркова Г.Р., Самусенок Л.В. Лекарственные грибы из экосистем Южного Байкала. Иркутск: ООО Изд-во «Время странствий», 2012. 104 c.

8. Cho N.-S., Shin Y.-S. Optimization of in vitro cultivation of Inonotus obliquus // Journal of the Korean Wood Science and Technology. 2005. Vol. 33. Issue 5. P. 92-98.

9. Jalc D., Siroka P., Ceresnakova Zb. Effect of six species of white-rot basidiomycetes on the chemical composition and rumen degradability of wheat straw // The Journal of General and Applied Microbiology.1997. Vol. 43. Issue 3. P. 133-137.

10. Wei Z.-H., Chen N., Li Y.-J., Fan Q.-L., Yu T.-F., Wang K.-X., et al. Glucose fed-batch integrated dissolved oxygen control strategy enhanced polysaccharide, total triterpenoids and ino-todiol production in fermentation of a newly isolated Inonotus obliquus strain // Process Biochemistry. 2018. Vol. 66. P. 1-6. https://doi.org/10.1016/ j.procbio.2018.01.006

11. Xu X., Quan L., Shen M. Effect of chemicals on production, composition and antioxidant activity of polysaccharides of Inonotus obliquus // International Journal of Biological Macromolecules.

2015. Vol. 19. Issue 77. P. 143-150. https://doi.org/ 10.1016/j.ijbiomac.2015.03.013

12. Xiang Y., Xu X., Li J. Chemical properties and antioxidant activity of exopolysaccharides fractions from mycelial culture of Inonotus obliquus in a ground corn stover medium // Food Chemistry. 2012. Vol. 134. Issue 4. P. 1899-1905. https:// doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.03.121

13. Wang L.-X., Lu Z.-M., Geng Y., Zhang X.-M., Xu G.-H., Shi J.-S., et al. Stimulated production of steroids in Inonotus obliquus by host factors from birch // Journal of Bioscience and Bioengi-

neering. 2014. Vol. 118. Issue 6. P. 728-731. https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2014.05.022

14. Xu X., Lin M., Zang Q., Shi S. Solid state bioconversion of lignocellulosic residues by Inono-tus obliquus for production of cellulolytic enzymes and saccharification // Bioresource Technology. 2018. Vol. 247. P. 88-95. https://doi.org/10.1016/ j.biortech.2017.08.192

15. Гашникова Н.М., Балахнин С.М., Тепля-кова Т.В., Ананько Г.Г., Косогова Т.А., Сухих А.С. Антиретровирусная активность меланинов из природной и культивируемой чаги (Inonotus obliquus) // Успехи медицинской микологии. 2014. Т. 12. С. 299-301.

16. Пат. № 10670, Республика Беларусь. МПК C 12N 1/14, C 12P 19/00. Штамм гриба Inonotus obliquus БИМ F-350 Д - продуцент меланина, обладающий антимутагенными свойствами / В.Г. Бабицкая, В.В. Щерба, Н.В. Иконникова, Т.А. Пучкова, Т.В. Филимонова; патентообладатель Государственное научное учреждение «Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси»; N а 20060292; заявл. 03.04.2006; опубл. 30.06.2008.

17. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В., Бардаше-ва А.В., Ильичева Т.Н. Меланины из глубинной культуры Inonotus obliquus и их противовирусная активность в отношении вируса простого герпеса 2 типа // Успехи медицинской микологии. 2015. Т. 14. С. 384-388.

18. Огарков Б.Н., Огаркова Г.Р., Самусенок Л.В. Технологические культуры лекарственных грибов и их биологическая активность // Успехи медицинской микологии. 2015. Т. 14. С. 446-454.

19. Иконникова Н.В., Щерба В.В. Накопление меланиновых пигментов у штаммов Phellinus robustus и Inonotus obliquus при поверхностном культивировании // Известия Национальной академии наук Беларуси. 2009. N 2. С. 43-47.

20. Бухало А.С., Дудка И.А. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. Киев: Наукова думка, 1988. 144 с.

21. Poyedinok N., Mykhaylova O., Tugay T., Tugay A., Negriyko A., Dudka I. Effect of light wavelengths and coherence on growth, enzymes activity and melanin accumulation of liquid-cultured Inonotus obliquus (Ach.:Pers.) Pilat. // Applied biochemistry and biotechnology. 2015. Vol. 176. Issue 2. P. 333-343. https://doi.org/10.1007/s12010-015-1577-3

22. Денисенко ТА, Вишникин А.Б., Цыганок Л.П. Спектрофотометрическое определение суммы фенольных соединений в растительных объектах с использованием хлорида алюминия, 18-молиб-додифосфата и реактива Фолина-Чокальтеу с фенольными соединениями // Аналитика и контроль. 2015. T. 19. N 4. C. 373-380. https://doi.org/ 10.15826/analitika.2015.19.4.012

23. Яшин Я.И., Рыжнев В.Ю., Яшин А.Я., Черноусова Н.И. Природные антиоксиданты. Содержание в пищевых продуктах и влияние их на

здоровье и старение человека. М.: ТрансЛит, 2009. 212 с.

24. Горностай Т.Г., Оленников Д.Н., Пензина ТА. Полякова М.С., Боровский Г.Б. Перспектива использования мицелия грибов рода Inonotus в качестве источника биоантиоксидантов // Биоантиок-сидант: тезисы докладов IX Международной конференции (Москва, 29 сентября - 02 октября 2015 г.). М.: Изд-во РУДН, 2015. С. 42.

25. ВаЬИэкауа У.С., 8оЬегЬа У.У., 1коптко-уа ^У., В1эко ^А., Мйгоро^кауа ^Уи. Ме!а-

nin complex from medicinal mushroom Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilat (Chaga) (Aphyllo-phoromycetideae) // International Journal of Medicinal Mushrooms. 2002. Vol. 4. Issue 2. P. 139-145. https://doi.org/10.1615/IntJMedMushr. v4.i2.70

26. Сушинская Н.В., Курченко В.П. Меланины трутовых грибов // Труды Белорусского государственного университета. Серия: физиологические, биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем. 2006. Т. 1. N 1. С. 144-155.

REFERENCES

1. Zheng W, Miao K, Liu Y, Zhao Y, Zhang M, Pan S, et al. Chemical diversity of biologically active metabolites in the sclerotia of Inonotus obliquus and submerged culture strategies for upregulating their production. Applied Microbiology and Biotechnology. 2010;87(4):1237-1254. https:// doi.org/10.1007/s00253-010-2682-4

2. Szychowskia KA, Rybczynska-Tkaczykb K, Tobiasza J, Yelnytska-Stawasza V, Pomianekc T, Gminskia J. Biological and anticancer properties of Inonotus obliquus extracts. Process Biochemistry. 2018;73:180-187. https://doi.org/10.1016Zj.procbio. 2018.07.015

3. Seo H-K, Lee S-C. Antioxidant activity of subcritical water extracts from chaga mushroom (Inonotus obliquus). Separation Science and Technology. 2010;45(2):198-203. https://doi.org/ 10.1080/01496390903423899

4. Shikov AN, Pozharitskaya ON, Makarov VG, Wagner H, Verpoorte R, Heinrich M. Medicinal plants of the Russian Pharmacopoeia; their history and applications. Journal of Ethnopharmacology. 2014; 154(3):481-536. https://doi.org/10.1016/j.jep.2014.04.007

5. Ilyina GV, Ilyin DYu. Xylotrophic basidomy-cetes in a pure culture. Penza: Penza State Agricultural Academy; 2013. 222 p. (In Russian)

6. Sysoeva MA. Highly dispersive colloidal systems and chaga melanin. Kazan: Kazan National Research Technical University; 2013. 226 p. (In Russian)

7. Ogarkov BN, Ogarkova GR, Samusenok LV. Medicinal mushrooms from Southern Baikal ecosystems. Irkutsk: Vremya stranstvii; 2012. 104 p. (In Russian)

8. Cho N-S, Shin Y-S. Optimization of in vitro cultivation of Inonotus obliquus. Journal of the Korean Wood Science and Technology. 2005; 33(5):92-98.

9. Jalc D, Siroka P, Ceresnakova Zb. Effect of six species of white-rot basidiomycetes on the chemical composition and rumen degradability of wheat straw. The Journal of General and Applied Microbiology.1997;43(3):133-137.

10. Wei Z-H, Chen N, Li Y-J, Fan Q-L, Yu T-F, Wang K-X, et al. Glucose fed-batch integrated dissolved oxygen control strategy enhanced polysaccharide, total triterpenoids and inotodiol production in fermentation of a newly isolated Inonotus obliquus

strain. Process Biochemistry. 2018;66:1-6. https:// doi.org/10.1016/j.procbio.2018.01.006

11. Xu X, Quan L, Shen M. Effect of chemicals on production, composition and antioxidant activity of polysaccharides of Inonotus obliquus. International Journal of Biological Macromolecules. 2015;19(77):143-150. https://doi.org/10.1016/j. ijbiomac.2015.03.013

12. Xiang Y, Xu X, Li J. Chemical properties and antioxidant activity of exopolysaccharides fractions from mycelial culture of Inonotus obliquus in a ground corn stover medium. Food Chemistry. 2012;134(4):1899-1905. https://doi.org/10.1016/ j.foodchem.2012.03.121

13. Wang L-X, Lu Z-M, Geng Y, Zhang X-M, Xu G-H, Shi J-S, et al. Stimulated production of steroids in Inonotus obliquus by host factors from birch. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2014;118(6):728-731. https://doi.org/10.1016/j.jbiosc. 2014.05.022

14. Xu X, Lin M, Zang Q, Shi S. Solid state bioconversion of lignocellulosic residues by Inonotus obliquus for production of cellulolytic enzymes and saccharification. Bioresource Technology. 2018;247:88-95. https://doi.org/10.1016/j.biortech. 2017.08.192

15. Gashnikova NM, Balakhnin SM, Teplya-kova TV, Ananko GG, Kosogova TA, Sukhikh AS. Antiretroviral activity of melanins from natural and cultivated chaga (Inonotus obliquus). Uspekhi meditsinskoi mikologii = Advances in Medical Mycology. 2014;12:299-301. (In Russian)

16. Babitskaya VG, Shcherba VV, Ikonniko-va NV, Puchkova TA, Filimonova TV. BIM F-350 D strain of fungus Inonotus obliquus - a producer of melanin with antimutagenic properties. Patent of the Belarus Republic, no. 10670, 2008. (In Russian)

17. Ananko GG, Teplyakova TV, Bardashe-va AV, Ilicheva TN. Melanins of inonotus obliquus from submerged culture and their antiviral activity against type 2 herpes simplex virus. Uspekhi meditsinskoi mikologii = Advances in Medical Mycology. 2015;14:384-388. (In Russian)

18. Ogarkov BN, Ogarkova GR, Samuse-nok LV. Technological cultures of medicinal mushrooms and their biological activity. Uspekhi medi-tsinskoy mikologii = Advances in Medical Mycology. 2015;14:446-454. (In Russian)

19. Ikonnikova NV, Shcherba VV. Accumulation of melanin pigments in strains of Phellinus robustus and Inonotus obliquus during surface cultivation. Izvestiya natsionalnoi akademii nauk Belarusi = Bulletin of the National Academy of Sciences of Belarus. 2009:2:43-47. (In Russian)

20. Bukhalo AS, Dudka IA. Higher edible basi-diomycetes in a pure culture. Kiev: Naukova Dumka, 1988; 144 p. (in Russian)

21. Poyedinok N, Mykhaylova O, Tugay T, Tugay A, Negriyko A, Dudka I. Effect of light wavelengths and coherence on growth, enzymes activity and melanin accumulation of liquid-cultured Inonotus obliquus (Ach.:Pers.) Pilat. Applied biochemistry and biotechnology. 2015;176(2): 333-343. https://doi.org/10.1007/s12010-015-1577-3

22. Denisenko TA, Vishnikin AB, Tsiganok LP. Spectrophotometric determination of sum of phenolic compounds in plants using aluminum chloride, 18-molybdodiphosphate and Folin-Ciocalteu reagents. Analitika i kontrol = Analytics and Control. 2015;19(4):373-380. (In Russian) https://doi.org/10. 15826/analitika.2015.19.4.012

Критерии авторства

Сысоева М.А., Уразлина Л.Н., Хабибрахманова В.Р., Григорьева Т.В, Сысоева Е.В. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Сысоева М.А., Уразлина Л.Н., Хабибрахманова В.Р., Григорьева Т.В., Сысоева Е.В. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Сысоева Мария Александровна,

д.х.н., доцент, заведующая кафедрой

пищевой биотехнологии,

Казанский национальный исследовательский

технологический университет,

420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68,

Российская Федерация,

И e-mail: [email protected]

Уразлина Ляйсян Наилевна,

аспирант,

Казанский национальный исследовательский технологический университет, 420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68, Российская Федерация, e-mail: [email protected]

23. Yashin YaI, Ryzhnev VYu, Yashin AYa, Chernousova NI. Natural antioxidants. Content in foods and their impact on human health and aging. Moscow: TransLit; 2009. 212 p. (In Russian)

24. Gornostay TG, Olennikov DN, Penzina TA, Polyakova MS, Borovskiy GB. The prospect of using of inonotus genus as a source of bioantioxidants. In: Bioantioxidant: Proseedings of the IX International Conference. 29 September -02 October, Moscow. Moscow: RUDN University; 2015, p. 42. (In Russian)

25. Babitskaya VG, Scherba VV, Ikonnikova NV, Bisko NA, Mitropolskaya NYu. Melanin complex from medicinal mushroom Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilat (Chaga) (Aphyllopho-romycetideae). International Journal of Medicinal Mushrooms. 2002;4(2):139-145. https://doi.org/10. 1615/IntJMedMushr.v4.i2.70

26. Sushinskaya NV, Kurchenko VP. Melanins of tinder fungi. Trudy Belorusskogo gosuda-rstvennogo universiteta = Scientific works of the Belarusian State University 2006;1(1):144-155. (In Russian)

Contribution

Maria A. Sysoeva, Lyaysyan N. Urazlina, Venera R. Khabibrakhmanova, Tatyana V. Grigoryeva, Elena V. Sysoeva have carried out the experimental work, analyzed the experimental results and prepared the text of the manuscript. Maria A. Sysoeva, Lyaysyan N. Urazlina, Venera R. Khabibrakhmanova, Tatyana V. Grigoryeva, Elena V. Sysoeva have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.

Conflict interests

The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.

The final manuscript has been read and approved by all the co-authors.

INFORMATION ABOUT THE AUTHORS

Maria A. Sysoeva,

Dr. Sci. (Chemistry), Associate Professor, Head of the Food Biotechnology Department, Kazan National Research Technological University,

68 Karl Marx St., Kazan 420015, Russian Federation, И e-mail: [email protected]

Lyaysyan N. Urazlina

Postgraduate Student,

Kazan National Research Technological

University,

68 Karl Marx St., Kazan 420015,

Russian Federation,

e-mail: [email protected]

Хабибрахманова Венера Равилевна,

к.х.н., доцент,

Казанский национальный исследовательский технологический университет, 420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68, Российская Федерация, e-mail: [email protected]

Григорьева Татьяна Владимировна,

к.б.н, старший научный сотрудник, Казанский национальный исследовательский технологический университет, 420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68, Российская Федерация, e-mail: [email protected]

Сысоева Елена Владиславовна,

к.х.н., доцент,

Казанский национальный исследовательский технологический университет, 420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68, Российская Федерация, e-mail: [email protected]

Venera R. Khabibrakhmanova,

Cand. Sci. (Chemistry), Associate Professor, Kazan National Research Technological University,

68 Karl Marx St., Kazan 420015, Russian Federation,

e-mail: [email protected]

Tatyana V. Grigoryeva,

Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, Kazan National Research Technological University,

18 Kremlevskaya St., Kazan 420008, Russian Federation, e-mail: [email protected]

Elena V. Sysoeva,

Cand. Sci. (Chemistry), Associate Professor, Kazan National Research Technological University,

68 Karl Marx St., Kazan 420015, Russian Federation, e-mail: [email protected]