CC BY
77
УДК 577.152.232, 577.112.083, 577.151.042, 579.234, 579.873.21
Выделение, очистка и характеристика ¿,0-транспептидазы 2 Mycobacterium tuberculosis
С. М. Балдин1,2, Т. А. Щербакова1, В. К. Швядас1,2*
'Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической
биологии им. А.Н. Белозерского, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет,
119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3
*E-mail: vytas@belozersky.msu.ru
Поступила в редакцию 21.11.2016
Принята в печать 13.12.2016
РЕФЕРАТ Ь,0-транспептидаза типа 2 Mycobacterium tuberculosis играет ключевую роль в формировании неклассических 3-3-поперечных сшивок пептидогликана в клеточной стенке патогена, обуславливая его устойчивость к широкому спектру антибиотиков пенициллинового ряда. Нами оптимизированы условия экспрессии, выделения и очистки рекомбинантной Ь,0-транспептидазы 2 из M. tuberculosis. Важным фактором, вызывающим инактивацию фермента, является окисление SH-групп каталитического остатка цисте-ина Cys354 как в процессе экспрессии, так и при хранении препарата. Определены биохимические свойства очищенной Ь,0-транспептидазы 2 - как полной, так и без домена А, а также кинетические характеристики катализируемой ферментом реакции превращения нитроцефина.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА Ь,0-транспептидаза, Mycobacterium tuberculosis, очистка фермента, рекомбинантный фермент, реактивация фермента.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Ac - ацетил; Ldt - Ь,0-транспептидаза; LdtMtl и LdtMt2 - Ь,0-транспептидазы Mycobacterium tuberculosis первого и второго типа; m-DAP - мезо-диаминопимелиновая кислота; IG -иммуноглобулин; Amp - ампициллин; IPTG - изопропил-Р-О-1-тиогалактопиранозид; LEW - Lysis/ Equilibration/Wash-буфер; ПААГ-электрофорез - электрофорез в полиакриламидном геле; DTT - дити-отреитол.
ВВЕДЕНИЕ
Туберкулез - опасное инфекционное заболевание, возбудителем которого является Mycobacterium tuberculosis. Число случаев туберкулеза с множественной и широкой лекарственной устойчивостью ежегодно возрастает [1]. Терапия туберкулеза заключается в комбинированном применении четырех основных препаратов первого эшелона, в который входят: рифампицин - ингибитор ДНК-зависимой РНК-полимеразы; изониазид и пиразинамид - бло-каторы синтеза миколовых кислот, необходимых для формирования клеточной стенки M. tuberculosis; этамбутол - ингибитор арабинозилтрансферазы, фермента, участвующего в синтезе арабиногалакта-на. Лечение больных в активной фазе может длиться более 6 месяцев. В некоторых случаях M. tuberculosis может сохраняться в легких в так называемой стационарной фазе, когда рост бактерий замедлен, не наблюдается иммунного ответа и проявляется устойчивость к различным антибиотикам [2]. В этой связи
большой интерес представляет поиск лекарственных средств, действующих на ранее не известные молекулярные мишени, связанные с особенностями жизнедеятельности и структурной организацией возбудителя туберкулеза. В последнее время понятными стали особенности формирования клеточной стенки ряда опасных патогенов, в том числе M. tuberculosis. В то время как у большинства бактерий главную роль в синтезе поперечных сшивок в пептидогли-кане играют пенициллинсвязывающие ферменты DD-транспептидазы, которые катализируют перенос 3-го остатка мезо-диаминопимелиновой кислоты (m-DAP) или L-Lys на 4-й остаток D-Ala (4-3-сшив-ки), образование большей части поперечных сшивок у M. tuberculosis осуществляют LD-транспептидазы, катализирующие перенос 3-го остатка m-DAP на аналогичный остаток другой цепи пептидоглика-на (3-3-сшивки) [3, 4], содержание которых в возбудителе туберкулеза достигает 80%. Первоначально LD-транспептидазы обнаружили у таких микро-
организмов, как Escherichia coli [5], Bacillus subtilis [6] и Enterococcus faecium [7], а о присутствии этих ферментов и их исключительной роли в формировании клеточной стенки у таких патогенов, как M. tuberculosis [8] и Helicobacter pylori [9], стало известно сравнительно недавно. Это открытие помогло понять причины низкой эффективности ß-лактамных антибиотиков при туберкулезе и ряде других инфекционных заболеваний: LD-транспептидазы, в отличие от DD-транспептидаз, не чувствительны к широко используемым пенициллинам и цефалоспоринам [10, 11]. Важность этих ферментов в функционировании микобактерий делает их одной из наиболее привлекательных мишеней для поиска ингибиторов с целью создания новых антибиотиков, обладающих противотуберкулезной активностью.
LD-транспептидазы относятся к классу амино-ацилтрансфераз [КФ 2.3.2]. Они принадлежат к суперсемейству белков с YkuD-доменами, название которому дала LD-транспептидаза (YkuD-фермент) B. subtilis - первый фермент с известной кристаллической структурой [6]. Геном M. tuberculosis кодирует пять белков, содержащих домен, обладающий L,D-транспептидазной активностью (участки Rv0116c, Rv0192, Rv0483, Rv1433 и Rv2518c) [11]. Наиболее активно экспрессируется LD-транспептидаза второго типа (LdtMt2) [8], с которой связывают высокое содержание «неклассических» 3-3-сши-вок в пептидогликане клеточной стенки патогена. Определены аминокислотные последовательности LD-транспептидаз возбудителя туберкулеза, однако структуры установлены лишь у ферментов первого и второго типа (LdtMt1 и LdtMt2). Предшественник LdtMt2 состоит из 408 аминокислотных остатков, образующих сигнальный пептид (Met1-Ala34) и цепь самого фермента (Cys35-Ala408), которую можно разделить на три домена: два некаталитических IG-подобных домена А и В (остатки Ala55-Ser147 и Pro148-Gly250 соответственно), а также каталитический домен С (остатки Asp251-Ala408), обладающий транспептидазной активностью. Ключевыми для катализа остатками LdtMt2 являются Cys354, His336 и Ser337, составляющие цепь переноса протона [8]. Активный центр LdtMt2 не экспонирован непосредственно в раствор, а расположен под так называемой «крышкой» Tyr298-Trp324 [12], формирующей три канала (A, B и C), по двум из которых (B и С) возможна доставка субстрата в активный центр.
Определена структура комплекса LdtMt2 с ди-пептидным фрагментом (N-Y-D-глутамил-т^АР) пептидогликана в активном центре фермента, PDB 3TUR [11], получены также структурные данные для ковалентных комплексов LdtMt2 с меропене-мом и LdtMt1 с имипенемом [12, 13]. С использова-
Канал С
Рис. 1. Объединенные кадры из молекулярно-дина-мических траекторий, в которых фрагменты пепти-догликана связаны с активным центром через разные каналы (В и С) [16]
нием методов предстационарной кинетики изучена инактивация LdtMtl различными Р-лактамными соединениями, такими, как меропенем, имипенем, дорипенем и эртапенем [14]. Показано [15], что эффективным ингибитором LdtMt могут быть не только карбапенемы, но и Р-лактамный антибиотик пене-мового ряда - фаропенем. Проведенное нами исследование взаимодействия фермента с тетрапептид-ным фрагментом пептидогликана клеточной стенки, а также с известными Р-лактамными ингибиторами при помощи методов молекулярного моделирования [16] позволило выявить особенности связывания N- и C-концевых фрагментов растущей цепи пептидогликана под действием LdtMt2 при образовании поперечных 3-3-сшивок и построить адекватную полноатомную модель LdtMt2 для скрининга и оптимизации структуры ингибиторов (рис. 1). Особенность действия Ь,0-транспептидаз заключается в том, что эти ферменты связывают в активном центре две молекулы субстрата - одну в качестве ацильного донора, которая в дальнейшем образует промежуточный ацилфермент, другую - в качестве нуклеофила, которая после связывания с ацилфер-ментом и переноса ацильной группы L-центра остатка m-DAP одной цепи пептидогликана на аминогруппу D-центра остатка m-DAP другой цепи формирует поперечную 3-3-сшивку пептидогликана клеточной стенки. Молекулярное моделирование показало, что связывание N-концевого фрагмента растущей цепи пептидогликана (ацильного донора), а также Р-лактамных соединений, способных инактивиро-вать фермент в результате образования стабильного ацилфермента, происходит в канале С, в то время как C-концевой (нуклеофильный) фрагмент растущей цепи связывается в канале В.
Задача данной работы состояла в выделении, очистке и характеристике LdtMt2 из M. tuberculosis с целью получения препаратов фермента для экспе-
риментального изучения ингибиторной способности соединений, отобранных в результате компьютерного скрининга.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Экспрессия LdtMt2 и LdtMt2_cut в E. coli, выделение и очистка
Наряду с препаратом «полноразмерной» LdtMt2 при выполнении работы был также получен препарат фермента, не содержащего в своей структуре домена А (мы назвали такой препарат LdtMt2_cut). Сравнительное изучение двух препаратов (LdtMt2 и LdtMt2_cut) могло помочь ответить на вопрос
0 влиянии домена А на каталитическую активность фермента. Для экспрессии фермента использовали плазмиду pET-19b, несущую либо ген Rv2518c (LdtMt2), не содержащий участка, кодирующего сигнальный пептид (остатки Phe54-Ala408), либо ген Rv2518c_cut (LdtMt2_cut), в котором отсутствовал не только участок, кодирующий сигнальный пептид, но и домен А (остатки Pro148-Ala408). В обоих случаях на N-концах белка располагался концевой пептид, состоящий из 24 аминокислотных остатков: MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHM с декагисти-диновым концевым фрагментом (His-tag). Колонии E. coli BL21(DE3) с трансформированной плазмидой pET-19b выращивали в среде LB в течение ночи. В дальнейшем переносили 100 мкл полученной культуры в колбу с отбойниками со средой LB, содержащей ампициллин (Amp) в концентрации 100 мкг/мл. Среду инкубировали при 37°С и 180 об/мин в течение 6-7 ч до достижения оптической плотности 0.6-0.8 при к = 600 нм.
Экспрессию фермента начинали, снижая температуру до 15°С и добавляя водный раствор CaCl2 до концентрации 2 мМ, изопропил-ß-D-l-тиогалактопиранозид (IPTG) до концентрации 0.5 мМ и глицерин до 2% (по объему), и продолжали в течение 4, 24 и 48 ч. Все операции по выделению фермента проводили во льду, образцы центрифугировали при 4°С. Выделение проводили по стандартной методике использования колонок Protino Ni-TED 1000 (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co) для очистки белков, содержащих His-tag [17]. Клетки осаждали в центрифуге при 4000 об/мин и 4°С в течение 15 мин, сырую клеточную массу взвешивали, затем ресу-спендировали в 3 мл LEW-буфера (50 мM NaH2PO4 pH 8.0, 0.3 М NaCl), добавляли лизоцим до концентрации
1 мг/мл, инкубировали в течение 30 мин и разрушали под действием ультразвука в ледяной воде в течение 10 мин. Полученный лизат центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин при 4°С, суперна-тант фильтровали через 0.2-мкм фильтр и наносили
на колонку Ргойпо Ni-TED 1000, уравновешенную 2 мл LEW-буфера. Клеточные белки смывали двумя порциями (по 2 мл) LEW-буфера, LdtMt2 элюировали тремя порциями (по 1.5 мл) буфера для элюции (50 мМ ^Н2Р04, 0.3 М ШС1, 0.25 мМ имидазол, рН 8.0). Общую концентрацию белка и выход фермента контролировали на всех этапах очистки с использованием микробиуретового метода [18].
Определение концентрации SH-групп
Свободные SH-группы титровали, используя реактив Эллмана 5,5'-дитиобис-2-нитробензойную кислоту (DTNB) в концентрации 10 мМ (4 мг/мл) в денатурирующем буфере (0.1 М Трис-НС1, содержащем 6 М гуанидинхлорид, рН 8.0). В качестве модельного соединения для построения калибровочной прямой использовали ^ацетилцистеин (N-Ac-L-Cys). Готовили 0.2 мМ раствор N-Ac-L-Cys, в денатурирующий буфер добавляли 7 мкл реактива Эллмана в концентрации 10 мМ (4 мг/мл) и 5-55 мкл раствора N-Ac-L-Cys (2-22 мкМ), чтобы общий объем смеси составлял 500 мкл. Полученную смесь инкубировали в течение 5 мин и определяли поглощение при 412 нм. Концентрацию SH-групп рассчитывали, используя значение коэффициента экстинкции образующейся 2-нитро-5-тиобензойной кислоты при 412 нм и рН 8.0, равное 14150 М-1см-1 [19].
Таким же образом титровали свободные SH-группы в препаратах LdtMt2 и LdtMt2_cut. Образец объемом 62-125 мкл с известной концентрацией фермента добавляли в денатурирующий буфер с 7 мкл реактива Эллмана, чтобы конечный объем смеси составлял 500 мкл, инкубировали в течение 5 мин и определяли поглощение при 412 нм. Концентрацию SH-групп в ферменте рассчитывали аналогично N-Ac-L-Cys.
Определение активности LdtMt2 и LdtMt2_cut с использованием нитроцефина
В настоящее время низкомолекулярные аналоги фрагмента клеточной стенки, которые могли быть удобными субстратами для определения активности фермента, не известны, поэтому активность LdtMt2 и его кинетику принято изучать с использованием хромогенного субстрата нитроцефина (рис. 2) [11].
Рис. 2. Структурная формула нитроцефина - субстрата ^,0-транспептидазы
Таблица 1. Результаты культивирования, выделения и очистки препаратов LdtMt2 и LdtMt2_cut
Препарат Время экспрессии, ч Масса клеток после центрифугирования, г Концентрация белка в клеточных экстрактах, мг/мл Масса очищенного фермента, мг
LdtMt2 4 - - 1.2
24 0.62 3.7 2.4
48 0.86 4.1 2.4
LdtMt2_cut 4 - - 0.8
24 0.71 3.1 1.9
48 0.95 3.8 1.9
Активность ферментных препаратов по отношению к нитроцефину определяли по величине абсорбции продукта гидролиза ß-лактамного кольца при 486 нм в 0.02 M буфере HEPES рН 7.5 в присутствии 0.1 M KCl. Значение коэффициента экстинкции продукта принимали равным 20500 М-1см-1 [11].
Культивирование в восстанавливающих условиях для предотвращения инактивации фермента
Проведенные нами опыты по выделению и очистке LdtMt2 показали, что для получения активных препаратов фермента необходимо использовать восстанавливающие условия, которые препятствуют окислению каталитического остатка цистеина. С этой целью при культивировании продуцента за 3 ч до окончания экспрессии в среду добавляли дити-отреитол (DTT) до концентрации 6 мМ. Выделение фермента также проводили в присутствии DTT.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В процессе получения препаратов LdtMt2 и LdtMt2_ cut для выявления оптимальных условий по выходу целевого фермента проводили экспрессию в течение различных промежутков времени: 4, 24 и 48 ч. В табл. 1 представлены результаты выделения и очистки препаратов LdtMt2 и LdtMt2_ cut. Оптимальным для препаративного выделения и очистки препаратов было культивирование в течение 24 ч: при сравнении с культивированием в течение 48 ч имеется не только выигрыш во времени, но и более высокий выход очищенного фермента по белку.
С помощью ПААГ-электрофореза показано, что посторонние белки не связываются на Ni-TED-колонках, а полученные препараты по молекулярной массе соответствуют LdtMt2 40.9 кДа (Ala55-Ala408 + His-tag) и LdtMt2_cut 31.3 кДа (Pro148-Ala408 + His-tag) и обладают высокой степенью чистоты (рис. 3). В то же время активность препарата LdtMt2, выделенного без добавления восстанавливающих агентов, по отношению к нитроцефину была существенно ниже ожидаемой.
Mw, кДа
LdtMt2 LdtMt2 LdtMt2 ...... xLdtMt2 cut LdtMt2 cut
97 LdtMt2 cut — —
несвяз. экстракт 97 — экстракт несвяз.
66
40.9 кДа 45
31.3 кДа
Рис. 3. ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях препаратов LdtMt2 40.9 кДа (Ala55-Ala408 + His-tag) и LdtMt2_cut 31.3 кДа (Pro148-Ala408 + His-tag), очищенных на Protino Ni-TED 1000, а также клеточных экстрактов и фракций, не связавшихся со смолой
Как показано ранее [11], каталитический остаток цистеина Cys354 способен подвергаться окислению, что может приводить к необратимой инактивации LdtMt2. Когда для предотвращения окисления каталитического остатка цистеина культивирование клеток E. coli, а также выделение фермента проводили в восстанавливающих условиях с добавлением в среду дитиотреитола (DTT), выход белка существенно не изменился и составил 1.8 ± 0.2 мг с 50 мл культу-ральной среды, однако каталитическая активность фермента оказалась существенно выше. Степень окисления SH-групп в препаратах LdtMt2 и LdtMt2_ cut, полученных при культивировании и выделении фермента в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях, оценивали с использованием титрования SH-групп по методу Эллмана. Полученные результаты представлены в табл. 2. Добавление DTT в культуральную среду и выделение фермента в восстанавливающих условиях позволило предотвратить окисление каталитического Cys354 и получить препарат LdtMt2 с почти в 2 раза более высокой удельной активностью.
[Нитроцефин], мкМ
Рис. 4. Зависимость начальных скоростей катализируемой LdtMt2 реакции раскрытия Р-лактамного кольца нитроцефина от концентрации нитроцефина. Точками представлены экспериментальные данные. При построении кривой использованы значения кинетических параметров, приведенные в тексте
Таблица 2. Доля свободных SH-групп в препаратах LdtMt2, полученных без добавления и с добавлением 6 мМ DTT в среду во время культивирования
DTT, мМ Доля свободных SH-групп [SH]/[LdtMt2], %
0 42 ± 2
6 72 ± 7
Таблица 3. Удельная активность препаратов LdtMt2 и LdtMt2_cut в реакции превращения нитроцефина в расчете на содержание белка в ферментном препарате и на содержание активных центров, учитывающее присутствие свободных SH-групп
Препарат Удельная активность
на мг белка, мкмоль/(мин х мг) на мкмоль SH-групп, мкмоль/(мин х мкмоль)
LdtMt2 (Ala55-Ala408) 0.65 30.6
LdtMt2 cut (Pro148-Ala408) 0.03 2.6
Стоит также отметить, что очищенные препараты фермента были достаточно стабильными при хранении (4°С, pH 7.5, 20 мМ HEPES, 0.1 М KCl) и практически не теряли активности в течение месяца. Этот факт в значительной степени способствует использованию полученных ферментных препаратов для изучения их каталитических свойств и тестирования потенциальных ингибиторов.
Важной частью работы было получение ответа на вопрос о влиянии домена А на каталитическую активность фермента. Сравнение активностей LdtMt2 и LdtMt2_cut показало, что после удаления домена А удельная активность препарата полноразмерного фермента снижается более чем на порядок (см. табл. 3). Значения KM и V реакции гидролиза нитроцефина, катализируемого LdtMt2 и LdtMt2_cut, определяли при анализе зависимости начальных скоростей от концентраций субстрата в интервале 5-160 мкМ (рис. 4). При определении значений каталитических констант ферментативной реакции и расчете концентрации активных центров фермента в препаратах LdtMt2 и LdtMt2_cut учитывали концентрацию свободных SH-групп. Падение активности полноразмерного фермента при удалении домена А в основном обусловлено снижением каталитической константы, которая при переходе от LdtMt2 к LdtMt2_cut в реакции превращения нитроцефина снижается от 0.98 ± 0.05 с-1 до 0.08 ± 0.03 с-1, в то время как значение константы Михаэлиса ухудшается незначительно - от 85 ± 7 до 102 ± 10 мкМ соответственно.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенная оптимизация условий экспрессии и очистки LdtMt2 показала, что наиболее продуктивным путем получения активных ферментных препаратов является культивирование клеток E. coli в течение 24 ч в среде LB в присутствии 0.2 мМ IPTG, 2 мМ CaCl2 и своевременное добавление восстанавливающих агентов (DTT) для предотвращения окисления каталитического Cys354. Получен высокоочищенный препарат LdtMt2 M. tuberculosis, не теряющий активности как минимум в течение месяца при хранении в буферном растворе 20 мМ HEPES, pH 7.5 при 4°С, который можно использовать для экспериментального изучения потенциальных ингибиторов фермента, отобранных в результате компьютерного скрининга. Охарактеризованы биохимические и кинетические свойства препаратов полноразмерной LdtMt2 и LdtMt2_cut без домена А. Показано, что при удалении домена А, непосредственно не связанного с каталитическим доменом С, активность полноразмерного фермента существенно снижается (более чем на порядок), в основном из-за снижения каталитической константы превращения нитроцефина. Взаимодействие между доменами и их роль в проявлении функциональных свойств полноразмерного фермента требует дальнейшего изучения.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 15-14-00069).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Global tuberculosis report 2016. // World Health Organization. 2016.
2. Betts J.C., Lukey P.T., Robb L.C., McAdam R.A., Duncan K. // Mol. Microbiol. 2002. V. 43. № 3. P. 717-731.
3. Fisher J.F., Meroueh S.O., Mobashery S. // Chem. Rev. 2005. V. 105. № 2. P. 395-424.
4. Jankute M., Cox J.A.G., Harrison J., Besra G.S. // Annu. Rev. Microbiol. 2015. V. 69. № 1. P. 405-423.
5. Magnet S., Dubost L., Marie A., Arthur M., Gutmann L. // J. Bacteriol. 2008. V. 190. № 13. P. 4782-4785.
6. Bielnicki J., Devedjiev Y., Derewenda U., Dauter Z., Joachim-iak A., Derewenda Z.S. // Proteins Struct. Funct. Genet. 2006. V. 62. № 1. P. 144-151.
7. Biarrotte-Sorin S., Hugonnet J.E., Delfosse V., Mainardi J.L., Gutmann L., Arthur M., Mayer C. // J. Mol. Biol. 2006. V. 359. № 3. P. 533-538.
8. Böth D., Steiner E.M., Stadler D., Lindqvist Y., Schnell R., Schneider G. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2013. V. 69. № 3. P. 432-441.
9. Kim H.S., Im H.N., An D.R., Yoon J.Y., Jang J.Y., Mobashery S., Hesek D., Lee M., Yoo J., Cui M., et al. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. № 41. P. 25103-25117.
10. Gupta R., Lavollay M., Mainardi J.L., Arthur M., Bishai
W.R., Lamichhane G. // Nat. Med. 2010. V. 16. № 4. P. 466-469.
11. Erdemli S.B., Gupta R., Bishai W.R., Lamichhane G., Amzel L.M., Bianchet M.A. // Structure. 2012. V. 20. № 12. P. 21032115.
12. Kim H.S., Kim J., Im H.N., Yoon J.Y., An D.R., Yoon H.J., Kim J.Y., Min H.K., Kim S.J., Lee J.Y., et al. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2013. V. 69. № 3. P. 420-431.
13. Correale S., Ruggiero A., Capparelli R., Pedone E., Berisio R. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2013. V. 69. № 9. P. 1697-1706.
14. Dubee V., Triboulet S., Mainardi J.L., Etheve-Quelquejeu M., Gutmann L., Marie A., Dubost L., Hugonnet J.E., Arthur M. // Antimicrob. Agents Chemother. 2012. V. 56. № 8. P. 4189-4195.
15. Dhar N., Dubee V., Ballell L., Cuinet G., Hugonnet J.E., Signorino-Gelo F., Barros D., Arthur M., McKinney J.D. // Antimicrob. Agents Chemother. 2015. V. 59. № 2. P. 1308-1319.
16. Ba^flMH C.M., MMcropa H.M., mBHflac B.K. // Acta Naturae. 2017. V. 9. № 1. P. 47-54.
17. Purification of His-tag proteins. // MACHEREY-NAGEL. 2014. V. Rev.06.
18. Itzhaki R.F., Gill D.M. // Anal. Biochem. 1964. V. 9. № 4. P. 401-410.
19. Ellman G.L. // Arch. Biochem. Biophys. 1959. V. 82. № 1. P. 70-77.
