CC BY
20
УДК 577.15.1
ЭКСПРЕССИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТНЫХ ФОРМ
ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ Alcaligenes faecalis
А.В. Степашкина1'2, С.С. Савин2'3, О.Е. Скиргелло12' В.И. Тишков12'3
( кафедра химической энзимологии химического факультета МГУ, 2ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН; e-mail: vitishkov@gmail.com)
Секвенирование шести плазмид с геном пенициллинацилазы из Alcaligenes faecalis VKM B1518 (АША) показало наличие в гене случайных мутаций' возникших при проведении полимеразной цепной реакции. Проведена экспрессия в клетках E. coli шести мутантных АША и фермента дикого типа. Анализ активности мутантных АША в клетках E. coli свидетельствует о влиянии ряда аминокислотных замен на уровень экспрессии гена АША' а также на скорость роста клеток. Очищены четыре мутантных АША' изучены их каталитические свойства и температурная стабильность. Показано' что исследованные аминокислотные замены не влияют на величину каталитической эффективности. Замены ßQ133R и ßK184E (мутант АША М2) на термостабильность фермента в пределах ошибки эксперимента не влияли' а в случае мутантов АША М4 (ßY90H)' М5 (aD132G' ßR97C) и М6 (aV5E' aN183S и ßE439G) константа скорости инактивации по сравнению с ферментом дикого типа увеличилась в 2'4' 2'75 и 8'3 раза соответственно.
Ключевые слова: пенициллинацилаза, Alcaligenes faecalis, неупорядоченный мутагенез, экспрессия, каталитические свойства, термостабильность.
Пенициллинацилаза G (ПА, КФ 3.5.1.11) катализирует реакцию гидролиза пенициллина G до фенилук-сусной и 6-аминопенициллановой кислоты. ПА принадлежит к суперсемейству гидролаз с N-концевым нуклеофилом и содержит каталитический остаток серина на N-конце Р-субъединицы. ПА (в основном фермент из E. coli) используется в промышленности для получения полусинтетических Р-лактамных антибиотиков. Ген ПА был клонирован из бактерий Achromobacter xylosoxidans [1], Alcaligenes faecalis [2, 3], Arthrobacter viscosus [4], Bacillus megaterium [5], Bacillus badius [6], Escherichia coli [7], Kluyvera criocrescens [8], Providencia rettgeri [9]. Среди перечисленных пенициллинацилаз G большой интерес как с практической, так и с фундаментальной точки зрения представляет фермент из бактерии Alcaligenes faecalis. По сравнению с ПА из E. coli он обладает более высокой термостабильностью [2] и широким рН-профилем активности [3, 10, 11], а также характеризуется наивысшей каталитической эффективностью по отношению к бензилпенициллину среди всех изученных ПА [10]. В дополнение к двум известным ПА из разных штаммов A. faecalis в нашей лаборатории был клонирован ген пенициллинацилазы G из бактерии A. faecalis VKM B1518 (АША) и создана система экспрессии этого фермента в клетках E. coli [11]. А£ПА была экспрессирована в клетках E. coli в
активной форме, выделена в гомогенном виде и охарактеризована. Было показано, что данный фермент по аминокислотной последовательности отличается от ранее клонированных ПА из других штаммов A. faecalis [11]. В результате дальнейшей работы было выделено шесть плазмид, секвенирование которых показало наличие в гене ПА из A. faecalis VKM B1518 случайных мутаций, возникших при проведении полимеразной цепной реакции. Мы решили исследовать, как эти мутации влияют на экспрессию и свойства фермента. В данной работе проведена экспрессия шести мутантных АША и фермента дикого типа. Четыре мутанта выделены в высокоочищенном виде, изучены их каталитические свойства и термостабильность.
Экспериментальная часть
Выделение плазмидной ДНК
Плазмиды выделяли из 10 мл ночной культуры клеток E. coli DH5a с помощью коммерческого набора реагентов GeneJet™ Plasmid Miniprep Kit («Fermentas», Литва).
Культивирование
4 мл среды 2YT (триптон 16 г/л, дрожжевой экстракт 10 г/л, NaCl 5 г/л, pH 7,5), содержащей хлорам-феникол в концентрации 34 мкг/мл, инокулировали
культурой клеток из музея (-750Q E. coli TGi, несущих плазмиду с геном AfD^, и инкубировали при 370С и 180 об/мин в шейкере «Innova 44» (New Brunswick Scientific, США) в течение i3 ч. Затем отбирали 200 мкл культуральной среды и переносили в колбы объемом 100 мл, содержащие 20 мл среды 2YT, хлорам-феникол 34 мкг/мл (370С, 180 об/мин). При достижении поглощения A600 = 0,8-1,0 проводили пересев в колбы объемом i л с i00 мл среды YE (дрожжевой экстракт 30 г/л, NaCl 5 г/л, хлорамфеникол 34 мкг/ мл, pH 7,5). В среду добавляли дополнительно CaCl2 (до конечной концентрации 2 мМ) и глицерин (до 5 г/л). Концентрация антибиотика (хлорамфеникола) в среде для культивирования составляла 34 мкг/мл. При достижении поглощения A600 = 0,2-0,5 добавляли индуктор (изопропил^^-тиогалактопиранозид, ИПТГ) до конечной концентрации 0,1 мМ и продолжали культивирование в течение ~65 ч при температуре 150С и скорости перемешивания 100 об/мин в шейкере «Infors» («Multitron», Швейцария). Клетки осаждали на центрифуге «Eppendorf 5804R» (Герма -ния) при 6000 об/мин и 40С в течение 5 мин.
Выделение и очистка фермента
Клетки разрушали методом осмотического шока. Осажденные клетки из i00 мл культуры ресуспен-дировали в i0 мл буфера А (20% сахароза, i00 мМ Tris-HCl, 10 мМ ЭДТА ; 40С, рH 8,0) и центрифугировали i0 мин при 5000 об/мин и 40С. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 10 мл буфера В (1 мМ ЭДТА ; 40С, рH 8,0). Затем смесь центрифугировали 15 мин при 7000 об/мин и 40С в центрифуге «Eppendorf 5804R» (Германия). Периплазматический экстракт обессоливали гель-фильтрацией на колонке с носителем Sephadex G25.
Измерение активности ПА
Активность фермента определяли на спектрофотометре «UV-1800» («Shimadzu», Япония) на длине волны 400 нм по поглощению окрашенного продукта - п-нитро-м-аминобензойной кислоты (NABA), образующейся при гидролизе п-нитро-м-карбоксианилида фенилуксусной кислоты (NIPAB). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализировало образование 1 мкмоль NABA за 1 мин при 300С и рH 8,0 (0,01 M KH2PO4, 0,1 M KCl). Стандартная концентрация NIPAB в реакционной смеси составляла 2,4^ 10-4 М.
Кинетические параметры
Для определения значений Кмакс и Km измеряли начальную скорость реакции гидролиза субстра-
та NIPAB при концентрации субстрата в диапазоне 5-50 мкМ. Все измерения проводили в двух повторах. Полученные данные из десяти точек аппроксимировали нелинейной регрессией с помощью программы OriginPro 7,0.
Титрование активных центров
Титрование активных центров фермента AfflA необратимым ингибитором фенилметансульфонилфто-ридом (PMSF) проводили при pH 6,0 в калий-фосфатном буферном растворе (0,01 M KH2PO4, 0,1 M KCl; рН 6,0). Смесь фермента с разным количеством ингибитора инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего измеряли остаточную активность. Все измерения проводили в двух повторах. Полученные данные были аппроксимированы по десяти экспериментальным точкам методом линейной регрессии с помощью программы OriginPro 7,0.
Температурная стабильность
Кинетику термоинактивации измеряли в калий-фосфатном буферном растворе (0,01 M KH2PO4, 0,1 M KCl; рН 8,0) при температуре 54°С. Серию из десяти тонкостенных пластиковых пробирок, содержащих раствор фермента объемом 50 мкл, инкубировали в водном термостате и через определенные промежутки времени вынимали пробирку и охлаждали во льду в течение 5 мин. Остаточную активность измеряли, как описано выше. Все измерения проводили в двух повторах.
Результаты и их обсуждение
Известно, что при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) термостабильная ДНК-полимераза может делать ошибки, в результате чего в амплифицируемом фрагменте появляются случайные нуклеотидные замены. Этот эффект был использован при разработке метода неупорядоченного мутагенеза, который получил названий «направленная эволюция» (directed evolution), когда ПЦР проводится в неоптимальных условиях. Однако и в случае рутинных ПЦР могут возникать случайные мутации, что мы и наблюдали при проведении ПЦР гена пе-нициллинацилазы из A. faecalis VKM B-1518 (AfflA). Было обнаружено шесть клонов, содержащих мутации, которые приводят к замене аминокислот. Ген ПА кодирует неактивный белок-предшественник, в котором на N-конце расположен сигнальный пептид, обеспечивающий транспорт этого пробелка в перплазму, а также две субъединицы, которые соединены спейсе-ром. В табл. 1 представлен список мутантных AfflA с указанием типа и положения аминокислотных замен в
Т а б л и ц а 1
Аминокислотные замены в последовательности пенициллинацилазы из А./авеа№ УКМ В-1518, возникшие в результате случайных мутаций в гене фермента
Мутантная форма Af^ Аминокислотные замены Локализация и характер мутации
Aim М1 sV2A аминокислотная замена в спейсере
ßQ12stop стоп-кодон в начале ß-субъединицы
Aim М2 ßQ133R петля в ß-листе, на поверхности, в основании конуса активного центра, замена полярной аминокислоты (Gln) на положительно заряженный остаток (Arg)
ßKmE ß-лист, внутри глобулы, замена положительно заряженного остатка (Lys) на отрицательно заряженный (Glu)
Aim МЗ aM43L а-спираль, внутри глобулы, замена полярной аминокислоты (Met) на неполярную (Leu)
ßY137H ß-лист, внутри глобулы, у входа в конус активного центра, замена полярной аминокислоты (Tyr) на положительно заряженный остаток (His)
Aim М4 ßY90H ß-лист, внутри глобулы, замена неполярной аминокислоты (Tyr) на положительно заряженный остаток (His)
Aim М5 aD132G а-спираль, внутри глобулы, замена отрицательно заряженного остатка (Asp) на Gly
ßR97C ß-лист, внутри глобулы, замена положительно заряженной аминокислоты (Arg) на полярный остаток (Cys)
Aim Мб aVSE ß-лист, поверхность глобулы, замена неполярного остатка (Val) на отрицательно заряженный остаток (Glu)
aN1S3S поверхность глобулы, замена полярного остатка (Asn) на Ser
ßE439G ß-лист, поверхность глобулы, замена отрицательно заряженного остатка (Glu) на Gly
белке-предшественнике. У всех шести мутантов в сигнальном пептиде наблюдалась замена signGlylOVal. В мутанте AfflA М1 имеется одна замена в спейсере sVаl2Ala. Во всех остальных случаях замены находятся в а- и ß-субъединицах. На рис. 1 представлено расположение этих замен в структуре фермента. Как видно из этого рисунка, аминокислотные замены локализованы как внутри белковой глобулы, так и на ее поверхности. Кроме того, в случае мутанта AfflA М1 в гене фермента имеется нуклеотидная замена C829T, которая приводит к замене остатка ßGln12 на стоп-кодон (cag^tag). Такая замена в литературе известна как амбер-мутация.
Результаты культивирования рекомбинантных штаммов E. coli (продуцентов мутантных AfflA и фермента дикого типа) представлены в табл. 2. Как видно
из этой таблицы, во всех случаях очень близки значения выхода биомассы и наблюдается синтез активных ферментов, однако уровни активности сильно отличаются. На рис. 2 представлены результаты аналитического электрофореза полученных препаратов. Из этого рисунка видно, что во всех препаратах имеются две полосы, соответствующие а- и Р-субъединице фермента (23,8 и 62,7 кДа соответственно). Сравнение данных табл. 2 и рис. 2 показывает, что наблюдается четкая корреляция между интенсивностью окраски полос субъединиц в электрофорезе и величиной активности - самые высокие уровни экспрессии и активности наблюдаются для фермента дикого типа (^-А1ПА) и мутантов АИА М2, М5 и М6. Особый интерес вызывают результаты культивирования мутанта А1ПА М1, в гене которого имеется замена Р01п1281ор. Поэтому
Рис. 1. Пространственное расположение аминокислотных замен в трехмерной структуре А1РА. Каталитический остаток Р8ег1 расположен в центре и указан шариком большего размера
ся самым эффективным. В литературе имеется много примеров, когда в присутствии соответствующих су-прессоров такой кодон не приводит к остановке синтеза рекомбинантных белков в клетках E. coli. Причины низкого уровня биосинтеза в случае мутанта AfflA М3 неизвестны.
Поскольку выход активного фермента в случае мутантов А£ПЛ М1 и М3 более, чем в 10 раз ниже по сравнению с ферментом дикого типа, для дальнейшей очистки и изучения свойств были использованы только 4 мутанта AfflA: М2, М4, М5 и М6. Поскольку в случае AfflA для исследования термостабильности и каталитических свойств не требуется использования гомогенных препаратов, из процедуры очистки исключили стадию гидрофобной хроматографии на butyl-Toyopearl. Тем не менее чистота полученных препаратов составляла не менее 86%.
Кинетические параметры ^макс и Km для мутант-ных AfflA и фермента дикого типа определены из зависимости начальной скорости реакции гидролиза NIPAB от концентрации субстрата. Для расчета величины каталитической константы определяли концентрацию активных центров фермента титрованием необратимым ингибитором фенилметан-сульфонилфторидом (PMSF). На рис. 3 в качестве
в случае этого мутанта следует ожидать синтез пептида, состоящего главным образом из а-субъединицы и спейсера, и отсутствие активности в полученной биомассе. В то же время данные аналитического электрофореза свидетельствуют о том, что а- и ß-субъединицы синтезируются в равных молярных количествах. По-видимому, такой результат связан с тем, что стоп-кодон tag в клетках E. coli не являет-
кДа
200 -> 85
М1 2-^3 М 4 5 6
Рис. 2. Аналитический электрофорез в присутствии ДДС-№ образцов wt-AfПА и мутантных АЕПА по окончании культивирования. М - маркеры молекулярной массы, дорожки 1- 6 соответствуют мутантам М1-М6
Т а б л и ц а 2
Экспрессия АША дикого типа и ее мутантов в клетках E. coli TG1
Клон Выход биомассы, г/л Активность в периплазматическом экстракте, Ед/л среды Удельная активность, Ед/г биомассы Активность в культуральной жидкости, Ед/л среды
wt-AfflA 25,6 11540 451 349
AfflA M1 27,9 950 34,0 288
AfflA M2 29,7 10060 339 259
AfflA M3 26,5 990 37,4 144
AfflA M4 28,7 1680 58,5 104
AfflA M5 30,8 7580 246 213
AfflA M6 29,2 9485 323 247
Т а б л и ц а 3
Значения каталитических параметров и констант скорости инактивации АША
Фермент Каталитические параметры Константа скорости термоинактивации кин, 104 c-1
k , c-1 кат' K , мкМ im k / K , мкМ-1-с-1 кат m'
wt-Af^ 138±5 5,2±0,4 27±3 3,97±0,08
Affl^ М2 104±4 3,6±0,3 29±3 4,21±0,07
Affl^ M4 152±5 5,5±0,2 28±2 9,59±0,16
Affl^ M5 154±4 5,7±0,3 27±2 11,0±1,4
Affl^ M6 159±7 6,2±0,5 26±3 33,1±6,2
примера приведены результаты титрования активных центров для мутанта АША М5. Как видно из рис. 3, вплоть до величины остаточной активности менее 10% наблюдается линейная зависимость от количества добавленного РМ8Б. Полученные значения ккат и Кт приведены в табл. 3, откуда видно, что в случае мутанта АША М2 введение замен приводит к одновременному уменьшению и £ и К а в случае трех остальных мутантов АША (М4, М5 и М6) эти параметры одновременно увеличиваются. Следует отметить два момента. Во-первых, все замены в исследованных мутантах не являются важными (и тем более критическими). В случае мутанта АША М2 уменьшение кинетических параметров составляет 25%, а в случае увеличения - не более 10-15%. Во-вторых, величина каталитической эффективности полученных мутантов и фермента дикого типа в пределах ошибки эксперимента остается одной и той же. Анализ положения аминокислотных замен в глобуле АША (рис. 1) показывает, что они расположены достаточно далеко от активного центра. Слабое влияние
на каталитические свойства свидетельствует, что вводимые замены не приводят к сильному изменению структуры фермента.
Рис. 3. Титрование активных центров АША М5 необратимым ингибитором РМ8Б
Рис. 4. Зависимости остаточной активности мутантных AfflA и фермента дикого типа (wt-AfflA) от времени в обычных (а) и полулогарифмических (б) координатах (0,01 M KH2PO4, 0,1 M KCl; рН 8,0, 54°С)
Для мутантных АША (М2, М4, М5, М6) и фермента дикого типа была изучена кинетика термоинактивации при температуре 54°С (рис. 4, а). В полулогарифмических координатах зависимости остаточной активности от времени представляют собой прямые (рис. 4, б). Это свидетельствует о том, что кривые термоинактивации можно аппроксимировать экспоненциальной функцией, а сам процесс инактивации протекает в соответствии с кинетикой реакции первого порядка. Для характеристики термостабильности фермента можно использовать величину наблюдаемой константы скорости инактивации первого порядка. Величины наблюдаемых констант скорости инактивации kшi представлены в табл. 3.
Из табл. 3 и рис. 4 видно, что в случае мутанта А£ПА М2 введение замен PQ133R и РК184Б не влияет на термостабильность фермента, в то время как в случае остальных трех мутантов ААПА (М4, М5 и М6) наблюдается хорошо заметная корреляция - чем больше величины kкат и Km, тем ниже стабильность. ферментов. В случае мутанта ААПА М6 с самой большой величиной стабильность фермента падает более, чем
в 8 раз. В настоящее время установить роль каждой из аминокислотных замен в стабильности AfflA не представляется возможным. Для этого необходимо провести дополнительные эксперименты. Однако по ряду замен можно сказать следующее. В AfflA М3 аминокислотная замена PY137H локализована в центре Р-листа, внутри глобулы. Вероятно, замена неполярного остатка Tyr на полярный остаток His внутри белковой глобулы является причиной дестабилизации в этом ферменте. Замена PE439G в случае мутанта AfflA М6 находится в а-спирали, и здесь возможны два механизма дестабилизации - повышение гибкости и, как следствие, снижение стабильности а-спирали за счет остатка введенного Gly и (или) удаление отрицательного заряда с поверхности белковой глобулы.
Таким образом, нами были экспрессированы шесть мутантных AfflA. Результаты свидетельствуют о влиянии ряда нуклеотидных замен на уровень биосинтеза белка. Исследование кинетических параметров и температурной стабильности фермента дикого типа и четырех мутантных AfflA показало, что мутации могут оказывать существенное влияние на свойства фермента.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 13-04-01907-а).
СПИСОК ЛИТЕРAТУРЫ
1. Gang Cai, Songcheng Zhu, Sheng Yang, Guoping Zhao, Weihong Jiang // Appl. Environ. Microbiol. 2004. 70. N 5. P. 2764.
2. R. M. D. Verhaert, A. M. Riemens, J.-M. Van der Laan, J. van Duin, W. J. Quax // Appl. Environ. Microbiol. 1997. 63. N 9. P. 3412.
3. Zhou Zheng, Zhou Li-Ping, Chen Mei-Juan, Zhang Yan-Li-ang, Li Ren-Bao, Yang Sheng, Yuan Zhong-Yi // Acta Biochim. Biophys. Sinica. 2003. 35. N 5. P. 416.
4. Hiroshi Ohashi, Yumiko Katsuta, Terutaka Hashizume, Shin-Nosuke Abe, Hiroko Kajiura, Hiroyuki Hattori, Toshio Kamei, Mitsuo Yano // Appl. Environ. Microbiol. 1988. 54. N 11. P. 2603.
5. Laura Martín, María A. Prieto, E. Cortés, José L. García // FEMS Microbiology Letters. 1995. 125. N 2-3. P. 287.
6. Jeyaprakash Rajendhran, Paramasamy Gunasekaran // J.Biosc.Bioeng. 2007. 103. N 5. P. 457.
7. Gümü§el F, Kiremit N, I§sever S, Ogras TT, Bermek E. // Bio-
chem Mol Biol Int. 1996. 38. N 2. P. 315.
8. Varshney NK, Ramasamy S, Brannigan JA, Wilkinson AJ, Suresh CG. // Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 2013. 69. N 8. P. 925.
9. Ljubijankic G, KonstantinovicM, Glisin V. // DNA Seq. 1992. 3. N 3. P. 195.
10. Svedas V, Guranda D, van Langen L, van Rantwijk F, Sheldon R. // FEBS Lett. 1997. 417. N 3. P. 414
11. Ясная А. С. // Клонирование и экспрессия в E. coli пени-циллинацилаз для получения мутантных форм с улучшенными свойствами. Дис. ... канд. хим. наук, М., 2009.
Поступила в редакцию 11.11.13
EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF MUTANT FORMS OF PENICILLIN ACYLASE FROM Alcaligenes faecalis
A.V. Stepashkina1,2, S.S. Savin2,3, O.E. Skirgello1,2 and V.I. Tishkov1,2,3*
(Department of Chemical Enzymology, Faculty of Chemistry, Moscow State University, Moscow, Russia, 2Innovations and High Technologies MSU Ltd., Moscow, Russia, 3A.N. Bakh Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; e-mail: vitishkov@gmail.com)
Sequencing of six plasmids with gene of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis VKM B1518 (AfPA) revealed presence of random nucleotide mutations resulted aroused after polymerase chain reaction. Six mutant AfPAs as well as wild-type enzyme were expressed in E.coli cells. Data obtained showed that some amino acid changes influenced on enzyme activity and level of expression of the mutants as well as on speed of cell growth. Four mutant AfPAs were purified and characterized. It was found that studied amino acid replacements did not change catalytic efficiency Amino acid changes PQ133R and PK184E (mutant AfPA М2) are not essential for thermal stability while in the case of mutants AfPA М4 (PY90H), М5 (aD132G, PR97C) and М6 (aV5E, aN183S and PE439G) inactivation rate constant in comparison with wild-type enzyme increased 2.4, 2.75 and 8,3 fold, respectively.
Key words: penicillin асукзеа, Alcaligenes faecalis, random mutagenesis, expression, catalytic properties, thermal stability.
Сведения об авторах: Степашкина Анастасия Владимировна - аспирант химического факультета МГУ; Савин Святослав Сергеевич - науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН; ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. биол. наук; Скиргелло Ольга Евгеньевна - науч. сотр. кафедры химической энзимологии МГУ; ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. хим. наук; Тишков Владимир Иванович - профессор кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, докт. хим. наук (е-mail: vitishkov@gmail.com).
