CC BY
20Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 27 (66). 2014. № 2. С. 150-156.
УДК 502.171; 504.054; 631.618
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЦЕНКА ДЕСТРУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ, УТИЛИЗИРУЮЩИХ АКРИЛОВЫЕ ПОЛИМЕРЫ
Сипулинов Р.Б., Карагайчева Ю.В., Козулина Т.Н., Рогачева С.М., Отраднова М.И.
Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А., Саратов, Российская Федерация Е-mail: smro13@land.ru
Исследована деструктивная активность коллекционных культур и бактериальных штаммов, выделенных из контаминированного бурового раствора, в отношении полиакриламида и полиакрилата натрия. Определены наиболее перспективные культуры.
Ключевые слова: буровой раствор, полиакриламид, полиакрилат, микроорганизмы, деструктивная активность.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время на территории России происходит активное освоение нефтяных месторождений. Добыча и транспортировка нефти, а также хранение выбуренных шламов оказывают негативное влияние на окружающую среду, приводящее к изменению ландшафтов, деградации почв, загрязнению поверхностных и подземных вод [1, 2]. При бурении одной скважины образуется около 500-800 м3 отходов, 10% которых приходится на долю компонентов буровых растворов, содержащих полиакриламид и полиакриловую кислоту [3].
Таким образом, одной из проблем при восстановлении нарушенных и загрязненных шламами территорий является утилизация полимеров. Их деструкцию могут осуществлять различные микроорганизмы, в частности, бактерии из родов Rhodococcus и Bacillus, и микромицеты, например, представители из рода Fusarium [4, 5]. Хорошо известны штаммы-деструкторы акриламида и акриловой кислоты -исходных мономеров для получения акриловых полимеров, например, Fusarium sp. N56, Bacillus subtilis 1742Д, Rhodococcus erythropolis E84. [6, 7]. Всесторонне исследованы метаболические пути деструкции акриловой кислоты и ее производных [8, 9]. Но в доступной литературе ограничены сведения о путях деструкции акриловых полимеров и микробных штаммах, способных использовать эти полимеры в качестве единственного источника углерода и энергии.
Целью данной работы явилось выделение из образцов бурового раствора микроорганизмов и оценка их деструктивной активности в отношении акриловых полимеров, а также скрининг штаммов-деструкторов среди коллекционных культур. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи: - выделить из проб бурового раствора доминирующие группы микроорганизмов в чистую культуру;
- оценить способность коллекционных и вновь выделенных бактериальных штаммов к деградации акриловых полимеров.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе исследованы штаммы бактерий родов Brevibacterium species 13ПА, Alcaligenes faecalis KSV-21, Pseudomonas alcaligenes 6n, Pseudomonas pseudoalcaligenes 5г, Rhodococcus rhodochrous М8, Arthrobacter species 1-CM, Kurtia species 2-14 - деструкторы акриламида и акриловой кислоты. В качестве источника выделения микроорганизмов-деструкторов использовали буровой раствор на основе частично гидролизованного полиакриламида (ПАА) и полиакрилата натрия (ПАН), подвергшийся микробной контаминации.
Выделение изолятов из бурового раствора проводилось методом прямого высева на плотную питательную среду. Способность использовать ПАА в качестве единственного источника углерода и энергии определяли методом посева исследуемых культур на агаризированную среду М9, содержащую 1 г/л ПАА [10]. Культивирование осуществляли при температуре 280С в течение 7 суток. Обильный рост культур на голодной среде с ПАА, свидетельствовал об их способности утилизировать данное соединение.
Для изучения процессов биодеградации мономеров и полимеров производили посев выделенных изолятов и коллекционных штаммов в жидкую модифицированную среду М9, содержащую исследуемые соединения. Акриламид (АА) и акриловую кислоту (АК) вносили в концентрации 2 г/л, ПАА - 1 г/л, модельный буровой раствор - 0,725 г/л. Буровой раствор готовили из расчета 10 г/л ПАА и 4,5 г/л ПАН. Культивирование проводили в течение 6 суток при температуре 280С и постоянном перемешивании.
О степени биодеградации акриловых полимеров и мономеров судили по уменьшению их количества, а также косвенно по увеличению биомассы. Концентрацию АК и АА определяли на спектрофотометре UNICO 2800 (США) при X=255 нм для АК, и X=260 нм для АА, толщина оптического слоя составляла 10 мм.
Содержание ПАА определялось спектрофотометрическим методом (при X = 480 нм), основанным на измерении оптической плотности окрашенного комплексного соединения, образованного акриловыми полимерами и спиртовым раствором дитизона по предварительно построенному калибровочному графику. Рост бактерий оценивали по величине оптической плотности клеточной суспензии, измеряемой на том же приборе при X = 540 нм и толщине оптического слоя 10 мм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе исследований среди коллекционных культур проводился поиск микроорганизмов, способных к деструкции акриловых полимеров. Основанием для выбора вышеперечисленных бактериальных штаммов послужила их способность использовать в качестве единственного источника углерода и энергии различные поллютанты, в том числе, акриламид и акриловую кислоту [6, 7]. Для скрининга использовали агаризованную среду, не содержащую никаких других источников углерода и азота, кроме АА, АК или акриловых полимеров. После культивирования
штаммов в течение 7 суток отмечали наличие или отсутствие роста колоний на агаре. Из результатов исследований, представленных в табл. 1, видно, что большинство исследуемых коллекционных культур способны утилизировать АА и АК, и только три штамма разрушали ПАА. Максимальную деструктивную активность проявили культуры Brevibacterium species 13ПА и Arthrobacter species 1-CM, которые были использованы для дальнейших исследований.
Таблица 1.
Деструктивная активность исследуемых микроорганизмов
Исследуемая культура Деструктивная активность
АА АК ПАА
Brevibacterium species 13ПА ++ - ++
Alcaligenes faecalis KSV-21 ++ - ±
Pseudomonas alcaligenes 6n ± + -
Pseudomonas pseudoalcaligenes 5г ± + -
Rhodococcus rhodochrous М8 ± - -
Arthrobacter species 1-CM ++ ± ++
Kurtia species 2-14 + + -
Учитывая незначительную деструктивную активность коллекционных культур в отношении ПАА, был проведен скрининг природных штаммов-деструкторов. В качестве источника выделения микроорганизмов-деструкторов использовали контаминированный буровой раствор, из которого был выделен консорциум микроорганизмов, представленный штаммами-деструкторами и их природными бактериями-спутниками. Консорциум состоял из шести изолятов, которые в дальнейшем были выделены в чистую культуру (БР-1 - БР-6).
Деструктивную активность коллекционных штаммов и полученных изолятов в отношении ПАА определяли по уменьшению концентрации полимера в культуральной среде, результаты исследований представлена на рисунке 1а. Косвенным подтверждением способности выделенных культур использовать ПАА в качестве единственного источника углерода и энергии является наличие роста микроорганизмов на данной среде, что проявляется в увеличении оптической плотности культуральной жидкости (рис. 1 б).
Из данных, представленных на рис. 1а и 1б, видно, что наибольшей деструктивной активностью в отношении ПАА обладают штаммы БР-1 и БР-4, о чем свидетельствует снижение концентрации ПАА в среднем на 35% и скорости роста культур более, чем в 2 раза. Активность штаммов БР-2 и БР-6 была значительно ниже - 23%, что согласуется с данными по увеличению в 1,5 раза плотности культуральной жидкости.
Контроль БР-1 БР-2 БР-3 БР-4 БР-5 БР-6 1 СМ 13 ПА
а 3-й день ПАА и 6-й день ПАА
Рис. 1а. Относительное изменение концентрации ПАА в процессе его деструкции.
и 3-й день ПАА в 6-й день ПАА
Рис. 1б. Относительное изменение оптической плотности культуральной жидкости в процессе деструкции ПАА.
Изучение деструктивной активности коллекционных культур и выделенных изолятов в отношении модельного бурового раствора подтвердило эффективность использования штаммов БР-1 и БР-4. Незначительную активность в отношении компонентов бурового раствора проявил коллекционный штамм 1-СМ, что объясняется способностью данной культуры утилизировать АК. Данные экспериментов представлены на рис. 2а и 2б.
Рис. 2а. Относительное изменение концентрации компонентов бурового раствора в процессе их деструкции.
Рис. 2б. Относительное изменение оптической плотности культуральной жидкости в процессе деструкции компонентов бурового раствора.
Микроскопические исследования наиболее перспективных культур БР-1 и БР-4 показали, что штамм БР-1 представлен грамположительными мелкими коккобацилами, штамм БР-4 - грамположительными кокками.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Коллекционные штаммы Brevibacterium species 13ПА и Arthrobacter species 1-CM, вызывающие биодеградацию акриламида и акриловой кислоты, обладали сравнительно низкой деструктивной активностью в отношении гидролизованного полиакриламида.
2. Из контаминированного бурового раствора выделен консорциум микроорганизмов, представленный шестью изолятами, способными к разложению ПАА.
3. Среди изолятов из бурового раствора выявлено два перспективных штамма бактерий, с лабораторными шифрами БР-1 (грамположительные коккобактерии) и БР-4 (грамположительные кокки), использующие полиакриламид в качестве единственного источника углерода и энергии.
Список литературы
1. Мазлова Е.А. Проблемы утилизации нефтешламов и способы их переработки / Мазлова Е.А. - М.: Изд. дом «Ноосфера», 1997. - 128 с.
2. Бондалетова Л.И. Промышленная экология: учеб. пособие / Л.И. Бондалетова, В.Г. Бондалетов. -Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2008. - 247 с.
3. Мстиславская Л.П. Основы нефтегазового производства / Мстиславская Л.П., Павлинич М.Ф., Филиппов В.П. - М.: 1996. - 248 с.
4. Ягафарова Г.Г. Локальная очистка сточных вод производства акриловой кислоты и ее производных / Г.Г. Ягафарова, С.В. Леонтьева // Нефтегазовое дело. - 2005. - Т. 3. - С. 281-284.
5. Демаков В.А. Утилизация нитрилов и амидов штаммом Rhodococcus erythropolis E84 / В.А. Демаков, А.Ю. Максимов, М.В. Кузнецова, Г.В. Овечкина // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. - 2008. - Вып 9 (25). - С. 48-52.
6. Wang C.C. Isolation of the acrylamide denitrifying bacteria from a wastewater treatment system manufactured with polyacrylonitrile fiber / C.C. Wang, C.M. Lee / Curr Microbiol. - 2007. - Vol.55. -№4. - Р.339-343
7. Nawaz M.S. Influence of selected physical parameters on the biodegradation of acrylamide by immobilized cells of Rhodococcus sp./ M.S. Nawaz, S.M. Billedeau, C.E. Cerniglia // Biodegradation. -1998. - Vol. 9. - № 5. - Р.381-387.
8. Shanker P. Microbial degradation of acrylamide monomer / P. Shanker, C. Ramakrishna, P.K. Seth // Arch. Microbiol. - 1990. - Vol.154, № 2. - P. 192-198.
9. Andreoni V. Microbial degradation of acrylic cid / V. Andreoni, S. Bernaseoni, C. Sorlini, M. Villa // Ann. Microbiol. Ed. Enzimol. - 1990. - Vol. 40, № 2. - P. 279-286.
10. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. - М.: Издательство МГУ. - 1983. - 210 с.
Видшення i оцшка деструктивно!" активност MiKpoopraHi3MiB, утилiзуючих aKpMOBi полiмери /
// Вчеш записки Тавршського нащонального ушверситету iм. В.1. Вернадського. Серiя „Бюлопя,
^я". - 2014. - Т. 27 (66), № 2. - С. 150-156.
Дослщжено деструктивна актившсть колекцшних культур i бактерiальних штамiв, видшених з
контаминированного бурового розчину, щодо полiакриламiду i полiакрилату натрто. Визначено
найбшьш перспективы культури.
Ключовi слова: буровий розчин, полiакриламiд, полiакрилат, мжрооргашзми, деструктивна актившсть.
SCREENING AND EVALUATION OF THE DESTRUCTIVE ACTIVITY OF MICROORGANISMS, UTILIZING ACRYLIC POLYMERS
Sipulinov R.B., Karagaicheva Y. V, Kozulina T.N., Rogacheva S.M., Otradnova M.I.
Saratov State Technical University named after Gagarin Y.A., Saratov, Russia Email: smro13@land.ru
Production and transportation of oil, as well as storage of oil sludge have a negative impact at the environment. During the drilling of one well about 500-800 m3 of waste is produced, 10 % of which are the components of drilling fluids containing polyacrylamide and polyacrylic acid. Thus, polymers utilization is one of the problems when restoring areas contaminated by the sludge. Their destruction may be carried out by bacteria and fungi. The aim of this work was to select microorganisms from the samples of drilling fluid and evaluate their destructive activity towards acrylic polymers, as well as screening of strains-destructors among collection cultures.
Initially there was conducted the search for microorganisms capable to degrade acrylic polymers among the collection cultures - Brevibacterium species 13ПА, Alcaligenes faecalis KSV-21, Pseudomonas alcaligenes 6n, Pseudomonas pseudoalcaligenes 5г, Rhodococcus rhodochrous М8, Arthrobacter species 1-CM, Kurtia species 2-14. For this purpose the agar medium containing acrylamide, acrylic acid or acrylic polymers as the only source of carbon and nitrogen were used. After culturing the strains for 7 days there was noted the growth of colonies. It has been found out that the most of studied collection cultures can utilize acrylamide and acrylic acid, and only three strains can utilize polyacrylamide. The cultures Brevibacterium species 13ПА and Arthrobacter species 1-CM have showed the maximal destructive activity.
The consortium of microorganisms was isolated from the contaminated drilling fluid, afterwards six isolates were obtained in pure culture (BR-1 - BR-6). The destructive activity of collection strains and isolates towards acrylic polymers was determined by the reduction of polyacrylamide concentration and by the microbial growth in culture medium. It has been found out that bacteria BR-1 and BR-4 possessed the most destructive activity, since there was observed the decrease of polymer concentration by nearly 35 % and more than 2-fold growth of the cultures.
The study of destructive activity of collection cultures and isolates towards model drilling fluid confirmed the effectiveness of the strains BR-1 and BR-4. Arthrobacter species 1-CM showed small activity towards the components of drilling fluid, probably due to the ability of the given culture to utilize acrylic acid.
Microscopic studies showed that bacteria of the strain BR-1 are small Gram-positive cocco-bacilli, the cells of the strain BR-4 are Gram-positive cocci. The obtained results allow us to consider the selected bacterial strains promising targets for further experimental studies.
Keywords: drilling fluid, polyacrylamide, polyacrylic acid, microorganisms, destructive activity.
References
1. Mazlova Е.А., Problems of utilization of oil sludge and ways of their processing, 128 p. («Noosfera», Moscow, 1997).
2. Bondaletova L.I., Bondaletov V.G., Industrial ecology, 247 p. (Tomsk, 2008).
3. Mstislavskaya L.P., Pavlinich M.F., Fillipov V.P., Fundamentals of oil production, 248 p. (Moscow, 1996).
4. Yagafarova G.G., Leont'eva S.V., Local treatment of wastewater of acrylic acid and its derivatives production, Oil and gas production, 3, 281 (2005).
5. Demakov V.A., Maksimov A.Y., Kuznetsova M.V., Ovechkina G.V., Nitriles and amides utilization by Rhodococcus erythropolis E84, Perm University Herald, Ser. Biology, 9, 25, 48 (2008).
6. Wang C.C., Lee C.M., Isolation of the acrylamide denitrifying bacteria from a wastewater treatment system manufactured with polyacrylonitrile fiber, Curr. Microbiol., 55, 4, 339 (2007).
7. Nawaz M.S., Billedeau S.M., Cerniglia C.E., Influence of selected physical parameters on the biodegradation of acrylamide by immobilized cells ofRhodococcus sp., Biodegradation., 9, 5, 381 (1998).
8. Shanker P., Ramakrishna C., Seth P.K., Microbial degradation of acrylamide monomer, Arch. Microbiol., 154, 2, 192 (1990).
9. Andreoni V., Bernaseoni S., Sorlini C., Villa M., Microbial degradation of acrylic аcid, Ann. Microbiol. Ed. Enzimol, 40, 2, 279 (1990).
10. Egorova N.S., Manual for practical training in microbiology, 210 p. (Moscow, 1983).
Поступила в редакцию 10.05.2014 г.
