Почвенные актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие высокой амидазной активностью

Демаков В.А.; Павлова Ю.А.; Максимов А.Ю.; Кузнецова М.В.

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2009 Биология Вып. 10 (36)

УДК 579.26:579.222.4

ПОЧВЕННЫЕ АКТИНОБАКТЕРИИ РОДА RHODOCOCCUS, ОБЛАДАЮЩИЕ ВЫСОКОЙ АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

В.А. Демакова,ь, Ю.А. Павловаа,ь, А.Ю. Максимова,ь, М.В. Кузнецоваь

а Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15 ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Исследованы почвенные культуры актинобактерий рода Rhodococcus, обладающие термостабильной амидазной активностью. Проведен ПЦР-анализ и секвенирование генов амидаз. Выявлены последовательности, гомологичные известным генам амидаз из R. erythropolis ^епБапк, М88614), R. erythropolis ^епБапк, Е12517) и R. rhodochrous N774.

Амидазы (КФ 3.5.1.4) - ферменты, катализирующие реакции гидролиза амидосоединений, участвуют в метаболизме азота и широко распространены в природе: они обнаружены у прокариот и эукариот (Fournand, 2001). У бактерий присутствие амидазной активности нередко ассоциировано с метаболизмом нитрилов. Микроорганизмы, активно использующие амиды и нитрилы в качестве ростового субстрата, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Agrobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Pseudomonas, Rhodococcus и др (Забазная, 1998, Кузнецова, 1997; Максимов, 2003; Моисеева, 1991, Banerjee, 2002; Cowan, 2000; Kotlova, 1999, Yanenko, 1995).

Амидазы, выделенные из различных источников, характеризуются различной субстратной специфичностью (Banerjee, 2002). Некоторые из них преимущественно гидролизуют амиды алифатических кислот, другие расщепляют ароматические соединения, в то время как остальные трансформируют амиды а- или ю-аминокислот. Некоторые амидазы обладают стереоселективностью (Four-nand, 2001). Однако распространение ферментных систем разных типов, способных трансформировать различные виды субстратов, не является видоспецифическим признаком (Перцович, 2005).

Данная работа посвящена исследованию почвенных микроорганизмов, обладающих высокой амидазной активностью, и анализу генов амидаз.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования являлись полученные в результате селекции на ацетонитриле штаммы Rhodococcus erythropolis, активно трансформирующие амиды и нитрилы карбоновых кислот. Культуры выращивали на минеральной безазотной

солевой среде N содержащей ацетонитрил в концентрации 10 мМ .

Трансформацию амидов и нитрилов с использованием активной биомассы проводили в 1 мл 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7.2, при начальной концентрации субстрата 2% параллельно при 25 и 50°С в течение 10 мин. Реакцию останавливали добавлением концентрированной НС1 до концентрации 2%. Пробы центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 5 мин. Продукты реакции анализировали методами газовой хроматографии и ВЭЖХ.

Газовую хроматографию продуктов трансформации нитрилов проводили на хроматографе СЬгот 5d ('ЪР", Чехословакия), оснащенном плазменно-ионизационным детектором. Хроматографическая колонка длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм была заполнена носителем полисорб-1, фракция 0,25-0,5 мм ("Реахим", Россия). В газ-носитель азот подавался с объемным расходом 35 см3/мин. Температура термостата 190+3°С, температура испарителя 220+10°С. В качестве стандартов использовали растворы чистых нитрилов, амидов и карбоновых кислот.

Удельную активность ферментов - амидазы и нитрилгидратазы - выражали в мкмоль продукта реакции (кислоты или амида), образуемого за 1 мин, в пересчете на 1 мг веса сухих клеток (мкмоль/мг/мин).

Хромосомную ДНК получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из актиномицетов (Клонирование ДНК, 1988).

79

Праймеры для амплификации генов нитрилгидратазы (А) и нитрилазы (Б)

Выявляемый тип гена Праймер Последовательность

Амидаза, гомологичная ферментам из R. erythropolis (Е12517) и R. rhodochrous N-774 (Х54074) AmiRhd-1 AmiRhd-2 5' -ATGGCGACAATCCGACCTGACGACA 5'-CTAGGCGGGGCTGAGTTGTGGTGCAGA

Амидаза, гомологичная ферменту из R. erythropolis (М88714) АтіЯеЯ-1 АтіЯеЯ-2 5'-ATGCGACACGGTGACATCTCCTCGA 5'-TTACGCTTCGACGGTCTTCTCGAC

Амидаза, гомологичная ферменту из R. erythropolis (AY026386) АтіЯеХ-1 АтіЯеХ-2 5'-GTGCGACCCAATCGCCCATTCGGCC 5'-CTACCGCAGCACCGGTGCGCTCGG

Амидаза, гомологичная ферментам из R. rhodochrous Л (838270) АтШ-1 АтШ-2 5'-ATGTCTTCGTTGACTCCCCCCAATT 5'-TTATGTCAGGGTGCCGGCTGCAGC

Rhodococcus sp. (BD061400) AmiBD-2 5'-TCAGGACGGCACCGAGGGTCGCGG

Амидаза, гомологичная ферменту Rhodococcus sp. (А19131) AmiRsp-1 AmiRsp-2 5'-ATGGGCTTGCATGAACTGACGCTCG 5'-TCAAAGCGGCGCCAGTCGCGGCCA

а-субъединица Со-нитрилгидратазы ^. rhodochrous И) < < Рч р4 5'-GTGATACATATGAGCGAGCACGTCAAT 5'-ATGCATCATACGATCACTTCCTG

в- субъединица Со-нитрилгидратазы ^. rhodochrous И) F АМ2 Я АМ7 5'-GTGATACATATGGATGGTATCCACGAC 5'-ATGCATCACGCAGAGATCAGGTA

а- субъединица Fe-нитрилгидратазы ^. rhodochrous N-774, Х54074) § § АА Рч р4 5'-СATATGTCAGTAACGATCGAC 5'-ATGCATCAGACGGTGGGAACCTG

в- субъединица Fe-нитрилгидратазы ^. rhodochrous N-774, Х54074) ^ 1 АА Рч Р4 5'-СATATGGATGGAGTACACGAT 5'-ATGCATCAGGCCGCAGGCTCGAG

Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taq-SE ДНК-полимеразы (ООО «СибЭнзим», Новосибирск) на термоциклере Т3 (Вютейа, Германия). Олигонуклеотидные праймеры разработаны с использованием базы данных GenBank (таблица).

Режим амплификации включал начальный цикл денатурации - 1 мин при 94°С; денатурацию, 94°С - 40 с; отжиг, 55-63° - 30 с; элонгацию, 72°С -60 с; (35 циклов) и завершающий этап - 60 с при 72°С.

Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,5 % агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности электрического поля 6 В/см.

Результаты и их обсуждение

Выделено более 400 клонов бактерий, способных к быстрому росту при использовании ацетонитрила или изобутиронитрила в качестве единственного источника углерода и азота. Для дальнейшего исследования отобраны 25 клонов, активно утилизирующих амиды и нитрилы и различающихся по морфологическим характеристикам.

Проведена идентификация бактерий по совокупности культурально-морфологических, биохимических, хемотаксономических свойств. Видовая принадлежность представителей рода Rhodococ-cus была подтверждена методом ПЦР-анализа генов 16Б РНК с видоспецифическими праймерами.

Рис. 1. Идентификация штаммов R. erythropolis по генам 16Б РНК

Рис. 2. Идентификация штаммов R. rhodochrous

по генам 168 РНК Основная часть активных изолятов была представлена нокардиоподобными микроорганизмами,

в основном относящимися к роду Rhodococcus (рис. 1, 2).

В ходе селекционного процесса при постепенным повышении концентрации субстрата (нитрила) получены культуры R. erythropolis П4-1, П6-2-1, П11-2, П11-1-3 и R. rhodochrous П-11-8, П-11-85, проявляющих амидазную активность более 6 Ед. при 25°С и более 30 Ед. при 50°С, а также активность нитрилгидратазы более 10°С. Установлено, что наилучшими субстратами для ферментов большинства штаммов являются ацетамид и пропионамид. Никотинамид и бензамид гидролизовались с меньшей скоростью.

Молекулярный анализ генов амидаз и нитрил-гидратаз

Для идентификации генов, кодирующих ферменты гидролиза амидов и нитрилов, проведен ПЦР-анализ с применением набора праймеров, специфичных для известных в настоящее время видов амидаз и нитрилгидратаз.

Показано, что геномы изолятов Rhodococcus содержат преимущественно последовательности, родственные ранее известным генам амидаз R. erythropolis, GenBank, Е12517, R. rhodochrous N 771, Х54074 и R. erythropolis, GenBank, М88614 (рис.3). Гены других видов амидаз встречались со значительно меньшей частотой.

Большинство штаммов также содержали последовательности, родственные генам а- и в- субъединиц Fe-содержaщей нитрилгидратазы штаммов R. rhodochrous N-774, Rhodococcus sp. R312.

Рис. 3. Амплификация последовательностей, гомологичных генам амидазы R. erythropolis, GenBank, М886142.

Проведено секвенирование полученных ПЦР-фрагментов с помощью ДНК-секвенатирующей системы MegaBase1000.

Установлено, что гомология известной последовательности Е12517 составляет от 94 до 99% (рис. 4, 5,А). У некоторых штаммов обнаружен ряд нуклеотидных замен, что, очевидно, обуславливает различия субстратной специфичности ферментов.

Последовательности, полученные в ПЦР-реакции с праймерами AmiReR, на 82-99% гомологичны гену амидазы R. erythropolis, приведенному в базе данных GenBANK под номером М88614 (рис.5,Б), относящемуся к структурному семейству нитрилаз-цианидгидратаз (Перцович, 2005).

Пб-2-1 AmiRhd fr П11-2 Е12517 fr П4-1 П11-8-5 К17р Consensus

1

.10

as

ц

ТСС GAAACCGT ТСС GAAACCGT ТСС GAAACCGT ТССGAAACCGT ТСС GAAACCGT ТССGAAACCGT ТССGAAACCGT ТСС GAAACCGT

CGAAC

CAAAC

TAGTGGCCCT

TGGTGGCCCT

TGGTGGCTCT

T.GGTGGCTCT

TGGTGGCTCT

GACCGGC

CACCAC

JO_________

GGCATCAC GGCATCAC GGCATCAC GGCATCAC GGCATCAC GGCATCAC GGCATCAC GGCATCAC

50

CGCC С ACC CACC С ACC CACC CACC CACC CACC

CTCGGC

------Section 1

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

_____________66

GGCGCGAGC GGCGCGAGC GGCGCGAGC GGCGCGAGC GGCGCGAGC GGCGCGAG-GGCGCGAGC GGCGCGAGC

------Section 2

132

(67)

ПБ-2-1 CoV 1

AmiRhd fir (Б7)

П11-2 <67)

Е12517 fir ■(671

П4-1 (67)

П11-8-5 (6(5)

К17р (67)

Consensus (6/)

67

80

90

100

110

120

TAC GGCAAAGC TAC GGCAAAGC TACGGCAAAGC TACGGCAAAGC TACGGCAAAGC TACGGCAAAGC TAC GGCAAAGC TACGGCAAAGC

CCGGAAC

CTCGTACC

GCTCGCC

GCTTGCC

GCTCGCC

CGCGCCGC CGCGCCGС CGCGCAGC CGCGCCGC CGCGCCGC CGCGCAAC CGCGCAGC CGCGCCGC

СТАС

GACAAT

GACACT

GCCTT

GCCGT

GCCTT

GAGACAATT С GAGACAATTC GAGACAATTС GAGACAATTC GAGACAATTC GAGACAATTN GAGACAATTC GAGACAATTC

-------Section 3

198

133)

ПБ-2-1 133)

AmiRhd fr 133)

П11-2 133)

E12517 fr 133)

П4-1 133)

П11-8-5 132)

K17p 133)

Consensus 133)

133

140

150

160

170

180

GACGT

CCTGGT

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

CCTGGT

GATGC

CCACAC

CAACGC

CCACAC

TGCC

CTACGTC

GCATCC

GAAGTTCC

GAATTGCC

GAACTACC

GAATTGCC

GGCGAAGGAC GGCGAAGGAC GGCGAAGGAC GGCGAAGGAC GGCGAAGGAC GGCGAACGAC GGCGAAC GAC GGCGAAGGAC

GT GGATCGT GTAGATCGT GTGGATCGT GTGGATCGT GTGGATCGT GT GGATCGT GTGGATCGT GT GGATCGT ----Section 4

Рис. 4. Нуклеотидные последовательности генов амидаз штаммов почвенных изолятов Rhodococcus, гомологичные генам R. erythropolis (Е12517) и R. rhodochrous N744 (Х54074).

А

------------------------П6-2-1 (0.0198)

AmiRhd fr (0.0281)

------П11-2 (0.0045)

L E12517 fr (0.0015)

П4-1 (0Л3007)

--------------------П11-8-5 (0.0120)

K17p (0.0000)

Б

11-8-5f-A (-0.0004)

2-4ff-AR (0.0002)

11-2-A [-0.0002)

-------------4-1 For-A [0.0082]

----------------------------------------------------------------5-2F-A (0.0404)

-------------------4-3F-A (0.0124)

Рис. 5. Филогенетические древа нуклеотидных последовательностей, гомологичных генам амида-зы R. rhodochrous N744 (А), R. rhodochrous

М88614 (Б)

Заключение

Бактерии, активно трансформирующие амиды карбоновых кислот, широко представлены в почве естественной среды. Среди культур, обладающих высоким уровнем нитрилгидратазной и амидазной активности, преобладают представители рода Rhodococcus.

Среди почвенных изолятов Rhodococcus, обладающих высокой амидазной активностью, наиболее распространены гены амидаз двух типов, гомологичные последовательностям из R. erythropolis, GenBank, Е12517 и R. erythropolis, GenBank,

М88614.

Филогенетический анализ секвенированных последовательностей позволяет предположить, что структура вновь выявленных генов ближе к гипотетической предковой форме алифатической ами-дазы, чем последовательности, депонированные в GenBank Е12517, М88614 (рис. 5).

Работа поддержана программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», ВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.)» и грантом поддержки молодых ученых УрО РАН.

Библиографический список

Забазная Е.В. Отбор штаммов, трансформирующих акрилонитрил и акриламид в акриловую кислоту / Е.В. Забазная, С.В. Козулин, С.П. Воронин // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34, № 4. С. 377-384.

Клонирование ДНК. Методы / пер. с англ.; под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988. 538 с.

Кузнецова М.В. Распространение нитрилкон-вертирующих бактерий в почвах Пермского края / М.В. Кузнецова, А.Ю. Максимов, Г.В. Овечкина,

B.А. Демаков // Вестник Перм. ун-та. 2007. Т.5(10). С.96-99.

Максимов, А.Ю. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp. gt1 / А.Ю. Максимов, М.В. Кузнецова, Г.В. Овечкина и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39, № 1. С. 6368.

Моисеева Т.Н. Скрининг штаммов-деструкторов акриловой кислоты и ее производных / Т.Н. Моисеева, С.В. Козулин, Л.К. Куликова,

C.П. Воронин // Биотехнология. 1991. № 6. С. 7983.

Перцович С.И. Алифатическая амидаза из Rhodococcus rhodochrous- представитель семейства нитрилаз/цианидгидратаз / С.И. Перцович, Д.Т. Гуранда, Д.А. Подчерняев, А.С. Яненко, В.К. Швядас // Биохимия. 2005. Т.70. С.1556-1565

Asano Y. Overview of screening for new microbial catalysts and their uses in organic synthesis - selection and optimization of biocatalysts // J. Biotechnol. 2002. Vol. 94. P. 65-72.

Banerjee A. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects / A. Banerjee, R. Sharma, U.C. Banerjee // Appl. Microbiol. Bio-technol. 2002. Vol. 60. P. 33-44.

Cowan D. Biochemistry and biotechnology of me-sophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes / D. Cowan, R. Cramp, R. Pereira et al. // Ex-tremophiles. 1998. Vol. 2, № 3. P. 207-216.

Fournand D. Aliphatic and enantioselective ami-dases: from hydrolysis to acyl transfer activity/ D. Fournand and A. Arnaud //J.Appl.Microbiol. 2001. Vol.91. P. 381-393.

Kotlova E. K. Isolation and primary characterization of an amidase from Rhodococcus rhodochrous

E.K. Kotlova, G.G. Chestukhina, O.B. Astaurova., Gerasimova et al. // Biotechnologia. 1995. №.7-8. T.E Leonova, A.S. Yanenko, V.G. Debabov // Bio- P. 139-144. chemistry. 1999. Vol. 64, N. 4. P. 384-389.

Yanenko A.S. Regulation of nitrile utilization in Rhodococcus / A.S. Yanenko, O.B. Astaurova, T.V.

SOIL ACTINOBACTERIA OF GENUS RHODOCOCCUS HAVING HIGH AMIDASE ACTIVITY

V.A.Demakov, Yu.A.Pavlova, A.Yu.Maksimov, M.V.Kuznetsova

Soil cultures of Rhodococcus genera actinobacteria having termostable activity were investigated. The PCA-analysis and sequencing of amidase genes was carried out. Sequences, homologous to known amidase genes from R. erythropolis, GenBank, M88614, R. erythropolis, GenBank, E12517 and R. rhodochrous N774 were revealed

Почвенные актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие высокой амидазной активностью Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Демаков В. А., Павлова Ю. А., Максимов А. Ю., Кузнецова М. В.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Демаков В. А., Павлова Ю. А., Максимов А. Ю., Кузнецова М. В.

SOIL A

Текст научной работы на тему «Почвенные актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие высокой амидазной активностью»