CC BY
100
Химия растительного сырья. 2008. №4. С. 119-123.
УДК 577.112.083; 577.152.321
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗ ASPERGILLUS NIGER И PENICILLIUM DIERCKXII
© А.А. Шубаков1, А.Г. Донцов2, Т.И. Челпанова1, Е.А. Елькина1
1 Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар, Республика Коми, 167982 (Россия)
E-mail: [email protected]
2Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Коммунистическая, 28, Сыктывкар, Республика Коми, 167610 (Россия)
С помощью адсорбционной хроматографии на различных носителях из культуральных жидкостей грибов Aspergillus niger и Penicillium dierckxii выделены и очищены полигалактуроназы с удельной активностью 262,6 и 63,6 ед./мг белка соответственно. Методом электрофореза в полиакриламидном геле в культуральной жидкости P. dierckxii обнаружены две изоформы фермента, из которых только одна сохраняется в конечном очищенном препарате полигалактуроназы.
Ключевые слова: полигалактуроназа, биосинтез, мицелиальные грибы, Aspergillus niger, Penicillium dierckxii, очистка, хроматография.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ (проекты 03-04-48136 и 06-04-48079), Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-1260.2003.4, НШ-5796.2006.4), Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», а также Интеграционных проектов, выполняемых в УрО РАН совместно с СО РАН и ДВО РАН.
Введение
Пектиназы составляют уникальную группу ферментов, которые обусловливают деградацию пектиновых веществ, присутствующих в стенках растительных клеток [1, 2]. Полигалактуроназы (ПГ, КФ 3.2.1.15) обладают эндо-карбогидразной активностью и являются катализаторами гидролитического расщепления а-(1^-4)-гликозидных связей между неэтерифицированными остатками D-галактопиранозилуроновой кислоты в углеводной линейной цепи галактуронана - кора пектиновых полисахаридов [3, 4].
ПГ синтезируются высшими растениями и рядом бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов [5-7]. Одним из основных источников получения полигалактуроназ служат мицелиальные грибы - эффективные биотехнологические продуценты с высокой пектиназной активностью [8, 9]. В литературе описаны различные способы очистки полигалактуроназ в основном из мицелиальных грибов рода Aspergillus (A. alliaceus, A. carbonarius, A. japonicus, A. niger) [6, 10, 11] и в меньшей степени - из рода Penicillium (P. expansum) [12].
Целью данной работы являлась разработка новых способов выделения и очистки полигалактуроназ, продуцируемых грибами A. niger и P. dierckxii на средах с цитрусовым пектином.
Экспериментальная часть
Ферменты. Полигалактуроназы выделяли и очищали из культуральных жидкостей, полученных после культивирования мицелиальных грибов A. niger ВКМ F-1119 и P. dierckxii ВКПМ F-152 на жидких пита-
* Автор, с которым следует вести переписку.
тельных средах с цитрусовым пектином (1%) в качестве источника углерода и индуктора. Условия культивирования грибов описаны в работе [13].
Определение ферментативной активности. Активность полигалактуроназы определяли по накоплению редуцирующих сахаров после 10 мин инкубации водного раствора фермента при 50 °С с 1% полигалак-туроновой кислотой («ICN», США) в 0,05 М натрий-ацетатном буфере (рН 5,0). Образовавшиеся сахара определяли по методу Нельсона [14]. Калибровочный график строили по a-D-галактуроновой кислоте («ICN», США). За единицу активности полигалактуроназы принимали такое количество фермента, которое освобождает из галактуронана при данных условиях 1 мкмоль a-D-галактуроновой кислоты за 1 мин реакции. По-лигалактуроназная активность выражается числом указанных единиц в 1 мл раствора фермента. Удельную активность рассчитывали в единицах активности на 1 мг белка.
Содержание белка определяли по методу Лоури [15], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Выделение и очистка полигалактуроназ. Для очистки культуральных жидкостей от пектиновых веществ, придающих им светло-коричневую окраску, были исследованы адсорбционные свойства микропористого угля марки СКТ, угля марки БАУ-Б с высоким развитием мезопор и угля переходного типа марки ОУ-А. Размеры частиц всех марок углей после их размола составляли не более 0,1 мм. В культуральную жидкость при рН 3,5 добавляли соответствующий уголь, смесь тщательно перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 мин, после чего адсорбент отделяли фильтрованием, а в фильтрате определяли активность полигалактуроназы и содержание белка. Оценку содержания пектиновых веществ в культуральных жидкостях осуществляли по цветности растворов путем измерения оптической плотности на фотоколориметре КФК-2 (Россия) при длине волны 315 нм. Степень очистки по цветности оценивали как отношение разности между исходной и конечной цветностью к исходной ее величине и выражали в процентах. Потери активности оценивали по отношению разности между исходной и конечной активностью полигалактурона-зы к исходной ее величине и выражали в процентах.
Ультра- и диафильтрацию культуральных жидкостей проводили на половолоконном модуле с пределом пропускания 15 кДа при 4 °С.
Для твердофазной экстракции полигалактуроназ использовали колонку 200х10 мм, заполненную обра-щенно-фазным силикагелем зернением 40-63 мкм («Sigma», США) с привитой октадецилсилановой группой Ci8. Концентрат культуральной жидкости (рН 3,5) при помощи насоса ММС-2С (Чехия) пропускали через колонку со скоростью 1 мл/мин. Белки элюировали с колонки 0,01 М ацетатным буфером (рН 3,5). Во фракциях элюата определяли активность полигалактуроназы и содержание белка. Фракции, содержащие ПГ-активность, объединяли, диализовали и лиофилизовали.
Твердофазную экстракцию лиофилизованного концентрата культуральной жидкости также проводили на колонке 450х22 мм с гидроксиапатитом зернением 100-250 мкм при 4 °С. Колонку уравновешивали 0,01 М фосфатным буфером (рН 6,0), после чего на нее наносили 63,4 мг лиофильно высушенного концентрата культуральной жидкости, растворенного в 5 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 6,0). Для элюции ПГ использовали градиент фосфатного буфера от 0,01 М до 0,4 М (рН 6,0). Фракции собирали с помощью коллектора фракций FCC 61. Активные по полигалактуроназе фракции, элюированные 0,2 М фосфатным буфером, объединяли, диализовали и лиофилизовали.
Аналитические методы. Электрофоретическое разделение белков и изоформ полигалактуроназы исходной культуральной жидкости P. dierckxii ВКПМ F-152 и очищенного ферментного препарата проводили в вертикальных пластинах 7,5% полиакриламидного геля в неденатурирующих условиях с системой буферов по [16]. Гистохимическое выявление зон полигалактуроназы в гелях после электрофореза осуществляли по методу, описанному в работе [17], используя в качестве субстрата 1,2% полигалактуроновую кислоту из цитруса («Sigma», США), а в качестве красителя - 0,05% рутениевый красный («Sigma-Aldrich», США). Активность полигалактуроназы проявляется на ярко-красном фоне в виде неокрашенных полос в местах расщепления субстрата ферментом. Белки окрашивали серебром по методу [18].
Для определения субстратной специфичности выделенных полигалактуроназ в качестве субстратов использовали 1% водные растворы галактуронана («ICN», США), ксилана («Serva», Германия), карбоксиме-тилцеллюлозы («Sigma», США). К растворам каждого субстрата добавляли по 2 мг ферментного препарата, смеси инкубировали при 50 °С в течение 2 ч на водяной бане, затем кипятили 5 мин на водяной бане при 100 °С для инактивации ферментов. Обработанные таким образом смеси центрифугировали, а супернатанты упаривали и в них с помощью бумажной хроматографии (БХ) определяли моносахаридный состав.
Распределительную БХ моносахаридов проводили на бумаге Filtrak FN-12 в системе растворителей н-бутанол : пиридин : вода (6 : 4 : 3). Для обнаружения пятен моносахаридов на хроматограммах использовали раствор кислого анилинфталата в водонасыщенном бутаноле при 105 °С. Стандарт - раствор a-D-галактуроновой кислоты («ICN», США).
Оптимум рН выделенного фермента определяли при 50 °С в 0,05 М натрий-ацетатном буфере в диапазоне значений рН от 2,0 до 9,0 с интервалом рН 0,5. Для определения рН-стабильности растворы фермента выдерживали 24 ч в равных объемах 0,05 М натрий-ацетатного буфера с различным значением рН (от 2,0 до
9.0 с интервалом 0,5) при 4 °С. Температурный оптимум действия полигалактуроназы устанавливали при рН
5.0 в диапазоне температур от 20 до 90 °С с интервалом 10 °С. Термостабильность фермента изучали, предварительно инкубируя раствор полигалактуроназы при различных температурах (4, 25 и 40 °С) в течение 1
ч, с последующим определением ферментативной активности при 50 °С.
Обсуждение результатов
Выделение и очистка полигалактуроназ из культуральной жидкости Aspergillus niger ВКМ F-1119.
Схема разработанного нами способа выделения и очистки ферментов представлена на рисунке.
Для освобождения от примеси пектиновых веществ была проведена адсорбционная очистка культуральной жидкости A. niger с помощью активированных углей марок СКТ, ОУ-А и БАУ-Б различной концентрации (табл. 1).
Установлено, что эффективность очистки культуральной жидкости по цветности снижается в ряду углей ОУ-А, БАУ-Б, СКТ, что может быть связано с различиями в их пористой структуре, а выход ферментативной активности после очистки в указанном ряду углей увеличивается. Максимальная очистка культуральной жидкости от окрашивающих пектиновых веществ достигалась при ее обработке углем ОУ-А концентрацией 20 г/л, при этом степень очистки по цветности составляла 91%. При обработке углем ОУ-А наблюдалось также наибольшее значение удельной активности полигалактуроназ - 59,3 ед./мг белка при троекратной степени очистки (табл. 2).
Ультрафильтрация культуральной жидкости на половолоконном модуле
Схема выделения и очистки полигалактуроназ из культуральной жидкости A. niger и P. dierckxii
Адсорбция культуральной жидкости на угле ОУ-А
Таблица 1. Адсорбционная очистка культуральной жидкости А. niger активированными углями марок СКТ, БАУ-Б, ОУ-А различной концентрации
Концен- трация Активность полигалактуроназы, ед./мг белка Степень адсорбционной очистки,% Потери активности ПГ, %
угля, г/л СКТ БАУ-Б ОУ-А СКТ БАУ-Б ОУ-А СКТ БАУ-Б ОУ-А
2,5 15,9 24,1 26,7 44 60 62 0,0 10,3 22,3
5 17,3 36,5 30,8 44 60 75 0,0 15,8 22,3
10 17,7 37,9 36,2 44 60 82 0,0 19,0 23,6
15 18,3 39,3 50,4 48 62 88 7,6 31,4 24,9
20 20,3 40,4 59,3 58 76 91 21,2 34,6 42,4
Таблица 2. Очистка полигалактуроназ из культуральной жидкости А. niger
Стадии очистки Удельная активность полигалактуроназы, ед./мг белка Степень очистки
Культуральная жидкость 20,0 0,0
Адсорбционная очистка 59,3 3,0
Ультрафильтрация 230,4 11,5
Твердофазная экстракция 262,6 13,1
После проведения ультрадиафильтрации культуральной жидкости удельная активность полигалактуроназ повысилась до 230,4 ед./мг белка при степени очистки в 11,5 раза. Твердофазная экстракция сконцентрированного раствора фермента на колонке с гидроксиапатитом увеличивала удельную активность лиофильно высушенного препарата полигалактуроназ до 262,6 ед./мг белка, что соответствует степени очистки в 13,1 раза.
Выделение и очистка полигалактуроназ из культуральной жидкости Репісіїїит йіетскхіі ВКПМ F-152. Полигалактуроназы очищали из культуральной жидкости объемом 4,21 л, в которой активность ферментов составляла 25,8 ед./мл. Схема выделения и очистки фермента показана на рисунке.
На первой стадии очистки для освобождения от низкомолекулярных примесей и неактивных белков проводили ультра- и диафильтрацию культуральной жидкости при 4 °С на модуле с полыми волокнами. Полученный концентрат (425 мл) был упарен при 40 °С до 140 мл и лиофильно высушен. Масса ферментного препарата составляла 161,3 мг.
На второй стадии выделения и очистки полигалактуроназ 63,4 мг лиофильно высушенного ферментного препарата, растворенного в 5 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 6,0), наносили на термостатируемую при 4 °С колонку с гидроксиапатитом, уравновешенную тем же самым буфером, и проводили градиентное элюирование фосфатным буфером (рН 6,0) от 0,01 до 0,4 М. Полигалактуроназы десорбировались с колонки
0,2 М фосфатным буфером.
Активные по полигалактуроназе фракции были объединены, диализованы и лиофильно высушены. В полученном ферментном препарате (ф.п.) активность полигалактуроназ составляла 63,6 ед/мг белка.
Согласно литературным данным, полигалактуроназы, продуцируемые мицелиальными грибами, часто представлены множественными молекулярными формами. Так, у гриба А. аШасеш выявлено 24 изоформы [10], а у Р. ехратит, например, всего одна изоформа [12]. Специфическое окрашивание ПГ с использованием субстрата -полигалактуроновой кислоты из цитруса и красителя - рутениевого красного выявляет в культуральной жидкости Р. Сіегскхіі две изоформы фермента, обозначенные нами в порядке уменьшения электрофоретической подвижности - ПГ -1 и ПГ-2 и одну форму - ПГ -1 - в конечном очищенном препарате полигалактуроназы.
Электрофоретический анализ белков подтверждает наличие в конечном очищенном препарате ПГ одной быстро мигрирующей зоны белка, соответствующей по подвижности изоформе ПГ-1. Медленно мигрирующая форма ПГ-2 в очищенном ферментном препарате не обнаруживается. Эта изоформа ПГ, возможно, разрушается в процессе выделения и очистки фермента.
Определение субстратной специфичности выделенной полигалактуроназы (ПГ-1) Р. сііегскхіі проводили с использованием ряда полисахаридных субстратов. По данным БХ не было обнаружено образования моносахаридов при действии препарата на ксилан и карбоксиметилцеллюлозу. Следовательно, ферментный препарат не обладает активностью по отношению к данным субстратам, но проявляет активность в отношении галактуронана.
Очищенный препарат ПГ-1 Р. Сіегскхіі проявляет максимальную активность в кислой среде (оптимум рН 5,0) при оптимуме температуры 60 °С. Наибольшей стабильностью фермент обладает при 4 °С в диапазоне рН 3,5-4,5; при этих условиях после 1 ч инкубации сохраняется практически вся исходная активность полигалактуроназы.
Выводы
С помощью адсорбционной хроматографии на различных носителях из культуральной жидкости грибов A. niger и P. dierckxii выделены и очищены полигалактуроназы с удельной активностью 262,6 и 63,6 ед./мг белка соответственно. Методом электрофореза в полиакриламидном геле в культуральной жидкости P. dierckxii обнаружены две изоформы фермента, из которых только одна сохраняется в конечном очищенном препарате полигалактуроназы. Разработанный способ очистки позволяет получать препараты полигалактуроназы с высокой удельной активностью, которые могут успешно использоваться для исследования структуры растительных полисахаридов с помощью направленного ферментативного гидролиза.
Авторы выражают благодарность академику Ю.С. Оводову за ценные советы и помощь в подготовке рукописи.
Список литературы
1. Sunnotel O., Nigam P. Pectinolytic activity of bacteria isolated from soil and two fungal strains during submerged fermentation // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2002. V. 18. P. 835-839.
2. Naidu G.S.N., Panda T. Performance of pectolytic enzymes during hydrolysis of pectic substances under assay conditions: a statistical approach // Enzyme and Microbial Technology. 1999. V. 25. P. 116-124.
3. Alkorta I., Garbisu C., Llama M.J., Serra J.L. Industrial applications of pectic enzymes: a review // Process Biochemistry. 1998. V. 33. №1. P. 21-28.
4. Benen J.A.E., Vincken J.-P., Van Alebeek G.-J.W.M. // Microbial pectinases in pectins and their manipulation / Eds. G.B. Seymour, J.P. Knox. CRS Press, USA . 2002. P. 174-190.
5. Родионова А.М., Безбородов А.М. О локализации систем ферментов, катализирующих расщепление полисахаридов растительных клеточных стенок у высших растений. Пектиназы (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. №5. С. 467-487.
6. Devi N.A., Rao A.G.A. Fractionation, purification, and preliminary characterization of polygalacturonases produced by Aspergillus carbonarius // Enzyme and Microbial Technology. 1996. V. 18. P. 59-65.
7. Pathak N., Sanwal G.G. Multiple forms of polygalacturonase from banana fruits // Phytochemistry. 1998. V. 48. №2. P. 249-255.
8. Loera O., Aguirre J., Viniegra-Gonzalez G. Pectinase production by a diploid construct from two Aspergillus niger overproducing mutants // Enzyme and Microbial Technology. 1999. V. 25. P. 103-108.
9. Астапович Н.И., Рябая Н.Е. Полигалактуроназа Saccharomyces pastorianus: выделение и некоторые свойства // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. №3. С. 287-291.
10. Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Разделение и анализ полигалактуроназ, продуцируемых Aspergillus alliaceus на среде с глюкозой // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. №5. С. 506-509.
11. Семенова М.В., Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства пектиназ из гриба Aspergillus japonicus // Биохимия. 2003. Т. 68. Вып. 5. С. 686-697.
12. Yao C., Conway W.S., Sams C.E. Purification and characterization of a polygalacturonase produced by Penicillium expansum in apple fruit // Phytopathology. 1996. V. 86. No. 11. P. 1160-1166.
13. Шубаков А.А., Елькина Е.А. Продуцирование полигалактуроназ мицелиальными грибами Aspergillus niger ВКМ F-1119 и Penicillium dierckxii ВКПМ F-152 // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2002. № 7. С. 65-68.
14. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // Journal of Biological Chemistry. 1944. V. 153. P. 375-380.
15. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // Journal of Biological Chemistry. 1951. V. 193. P. 265-275.
16. Aotsuka T., Asami T. A simplified apparatus for vertical slab gel electrophoresis // Japan Journal of Genetics. 1979. V. 54. №5. P. 397-400.
17. Васильева К.В., Гладких Т.А., Иванова Л.В., Давыдова М.А., Умралина А.Р., Шапошников Г.Л. Изучение множественности форм полигалактуроназы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле // Прикладная биохимия и микробиология. 1984. Т. XX. Вып. 5. С. 604-611.
18. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М., 1981. 288 с.
Поступило в редакцию 17 октября 2007 г.
