CC BY
259
УДК 577.152.32
ОЧИСТКА а-АМИЛАЗ Aspergillus flavus var. oryzae И Bacillus subtilis И ИХ СВОЙСТВА
Е. В. Авдиюк
Л. Д. Варбанец Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев
Л. А. Сафронова Е. С. Харкевич
Е-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Получено 17.01.2012
Подобраны методы выделения и очистки энзимов с а-амилазной активностью двух продуцентов — Aspergillus flavus var. oryzae 80428 и Bacillus subtilis 147, которые включали: фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрацию на TSK-геле Toyopearl HW-50 и ионообменную хроматографию на TSK-геле DEAE-Toyopearl 650 M (для а-амилазы A. flavus var. oryzae); фрак -ционирование сульфатом аммония и аффинную сорбцию на крахмале (для а-амилазы B. subtilis 147). а-АмилазаA. flavus var. оryzae 80428 была очищена в 37 раз, а а-амилаза B. subtilis 147 — в 20 раз по сравнению с активностью энзима в супернатанте культуральной жидкости. а-Амилаза
A. flavus var. оryzae проявляла максимальную активность при рН 6,0 и температуре 60 °С, сохраняла 100% активности через 24 ч при рН 5,0-7,0 и в течение 3 ч при температуре 37 °С. рН-оптимум а-амилазы B. subtilis составлял 8,0 с термооптимумом при 90 °С; энзим полностью сохранял исходную активность в течение суток при рН 7,0-9,0 и в течение 3 ч при температуре 37 °С, 60 °С и 70 °С. При температуре 80 °С а-амилаза B. subtilis сохраняла 80% первоначальной активности после 3 ч инкубирования.
Ключевые слова: а-амилаза, рН- и термооптимумы, рН- и термостабильность, очистка, Aspergillus flavus var. oryzae, Bacillus subtilis.
С каждым годом возрастают потребности промышленности в энзимных препаратах микроорганизмов и расширяются области их биотехнологического применения [1, 2]. Первое место по частоте использования занимают протеолитические энзимы, второе — амилолитические [3], наиболее распространенным из которых является а-амилаза.
а-Амилазы [ЕС 3.2.1.1], катализирующие гидролиз а^-(1,4)-гликозидной связи в крахмале, гликогене и родственных поли-и олигосахаридах, синтезируются многими видами микроорганизмов, включая бактерии и грибы, а также обнаружены в тканях насекомых, млекопитающих и в высших растениях [6]. а-Амилаза является ключевым энзимом в процессе получения производных крахмала, используется в хлебопекарной, текстильной, спиртовой, бумажной промышленности, в пивоварении, производстве моющих средств [4]. В последние годы а-амилазу начали широко применять в медицинской и клинической химии, что, в свою очередь, требует высокой степени чистоты энзима [5].
При получении а-амилаз используют главным образом традиционные методы
очистки протеинов, такие как фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию. Однако некоторые авторы склоняются к более простому, быстрому и легко воспроизводимому методу — аффинной сорбции на крахмале.
Целью настоящей работы было выделение препаратов с а-амилазной активностью из супернатанта культуральной жидкости (СКЖ) Aspergillus flavus var. oryzae и Bacillus subtilis, их очистка и изучение оптимальных параметров действия (рН и температуры, при которых действуют энзимы, их термо- и рН-стабильности).
Материалы и методы
Объектами исследования были два продуцента грибного и бактериального происхождения — A. flavus var. oryzae 80428 и
B. subtilis 147, выделенные из рубца крупного рогатого скота и почвы, соответственно.
A. flavus var. oryzae культивировали на жидкой питательной среде 1 такого состава (г/л): NaNO3 — 1; KH2PO4 — 1; KCl — 0,5; MgSO47H2O — 0,5; FeSO47H2O — 0,015; нерастворимый картофельный крахмал — 10; рН 6,0.
Для выращивания B. subtilis использовали жидкую питательную среду 2 такого состава (г/л): NaNO3 — 2; KH2PO4 — 1; KCl — 0,5; MgSO4 7H2O — 0,5; FeSO4 7H2O — 0,015; нерастворимый картофельный крахмал — 1; соевая мука — 10; рН 6,0.
Культивирование микроорганизмов на вышеуказанных средах проводили глубинным способом в 0,5 л колбах Эрленмэйера на качалках со скоростью вращения 220 об/мин при температуре 25 °С (A. flavus var. oryzae) и 42 °С (B. subtilis) в течение 5 и 3 сут, соответственно. После ферментации биомассу отделяли фильтрованием или центрифугированием, а в надосадочной жидкости определяли содержание протеина, амилолитиче-скую и протеолитическую активность.
Для выделения энзимов A. flavus var. oryzae и B. subtilis к супернатанту культуральной жидкости добавляли сухую соль сульфата аммония до 90% насыщения под контролем рН. Смесь выдерживали в течение ночи при 4 °С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 5 000 g и растворяли в 3-кратном объеме 3 М сульфата аммония.
Для очистки энзимов использовали методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Гель-фильтрацию проводили на колонке (2,0x32 см) с нейтральным TSK-гелем — Toyopearl HW-50 фирмы Toyo Soda (Япония), уравновешенным 0,01 М Tris-HCl-буфером, рН 6,5. Осадок, полученный в результате высаливания, диализировали в течение суток против дистиллированной воды, а затем 0,01 М Tris-HCl-буфера и концентрировали на полиэтиленгликоле (ПЭГ). Образец (1,7-2 мг) наносили на колонку, элюцию производили тем же буфером со скоростью 54 мл/ч. Фракции с амилолитиче-ской активностью объединяли и концентрировали (« в 5 раз) на ПЭГ. Далее полученный образец наносили на колонку (1,5x25 см) с DEAE-Toyopearl 650 M (Toyo Soda, Япония), уравновешенную 0,01 М Tris-HCl-буфером, рН 6,5. Элюцию проводили линейным градиентом NaCl (0-1,0 М) со скоростью 45 мл/ч. Активные фракции объединяли и использовали для дальнейших исследований.
Очистку энзимов осуществляли также с применением метода аффинной сорбции на крахмале. Сорбцию проводили в эппендор-фах, используя в качестве субстрата нерастворимый картофельный крахмал (200 мг). Крахмал отмывали 0,01 М фосфатным буфером (ФБ) с рН 6,5 и центрифугировали при 5 000 g в течение 10 мин для удаления растворимых частиц. Затем эппендорфы с крах-
малом помещали на холод (20 мин) и далее смешивали крахмал с предварительно охлажденным диализатом (1 мл). Суспензию инкубировали на ледяной бане в течение 1 ч с медленным перемешиванием и через 2 ч центрифугировали (5 000 g, 5 мин, 4 °С). Осадки крахмала со связанной а-амилазой 3 раза интенсивно промывали 0,01 М ФБ при 4 °С, каждый раз центрифугируя в том же режиме. Энзим десорбировали 0,01 М ФБ, нагретым до 60 °С, с последующим центрифугированием для осаждения гранул крахмала. Полученную надосадочную жидкость использовали для дальнейших исследований.
Амилолитическую активность определяли, как описано ранее [7].
Содержание протеина на всех этапах исследования регистрировали на спектрофотометре СФ-26 при 280 нм, а его количество — методом Lowry et al. [8].
Определение общей протеолитической активности осуществляли по методу Ансона в модификации Петровой [9].
При определении гликозидазной активности использовали соответствующие синтетические субстраты: п-нитрофенил-а- и -ß-D-галактопиранозид (Sigma, США), п-нитрофенил-а- и -ß-D-глюкопиранозид (Sigma, США), п-нитрофенил-N-acetyl-a-и -ß-D-галактопиранозид (Koch-Light, Великобритания), п-нитрофенил-^ацетил-а^-глюкозаминид (Koch-Light, Великобритания), п-нитрофенил-а- и ß-D-ксилопиранозид (Sigma, США), п-нитрофенил-а-D-маннопи-ранозид (Sigma, США), п-нитрофенил-а-D-фукопиранозид (Sigma, США), п-нитрофе-нил^^-глюкуронида (Sigma, США),
n-нитрофенил-N-acetyl-ß-D-глюкозаминид (Sigma, США). Для этого к 0,1 мл раствора энзима добавляли 0,2 мл 0,1 М фосфатно-цитратного буфера (ФЦБ), рН 5,2, и 0,1 мл 0,1%-го раствора субстрата в ФЦБ. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при температуре 37 °С. Реакцию останавливали добавлением 1 М раствора бикарбоната натрия. В контрольную пробу вносили те же компоненты, но в обратном порядке. Количество п-нитрофенола, отщепившегося от субстрата в результате гидролиза, определяли колориметрическим методом по поглощению при 400 нм [10]. За единицу активности энзима принимали количество его, гидролизирующее 1 мкмоль субстрата в 1 мин в усло виях опыта.
Влияние температуры и рН на активность а-амилаз исследовали в интервале температур от 4 до 100 °С, рН 3-12. В качестве буфера использовали 0,05 М универ-
сальный буферный раствор. Термостабильность препаратов определяли при температуре 37 °С и 60 °С (для а-амилазы A. flavus var. oryzae) и при температуре 37 °С, 60 °С, 70 °С, 80 °С, 90 °С (для а-амилазы B. subtilis), отбирая аликвоты через 15, 30, 60, 120, 180 мин инкубирования энзима при соответствующей температуре. рН-стабильность а-ами-лаз изучали, выдерживая смесь препарата с соответствующим буфером в течение 24 ч и отбирая пробы для оценки активности через определенные промежутки времени (15, 30, 60, 120, 180 мин).
На рисунках (3-10) приведены средние арифметические величины; отклонение от среднего значения не превышало 5%.
Результаты и обсуждение
Необходимая степень чистоты энзимных препаратов определяется областью их применения. Так, в легкой промышленности и сельском хозяйстве используют энзимы с незначительной степенью очистки (технические препараты), в то время как различные отрасли пищевой, микробиологическая и текстильная промышленность требуют применения более высокоочищенных препаратов. Особенно высокие требования к чистоте энзимных препаратов выдвигают медицинская и химическая промышленность [4, 5, 11].
В данной работе для очистки а-амилаз были использованы как традиционные методы, в частности осаждение сульфатом аммония, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, так и более высокоэффективный и избирательный метод — аффинная сорбция на крахмале.
Объектами исследования служила а-амилаза, полученная из продуцентов грибного и бактериального происхождения —
A. flavus var. oryzae и B. subtilis, соответственно.
Известно, что в культуральной жидкости большинства микромицетов можно выявить целый комплекс гликозидазной активности, что прежде всего связано со способом существования грибов, природными субстратами которых являются растительные остатки [12]. С использованием крахмала, казеина, а также ряда синтетических субстратов в СКЖ A. flavus var. oryzae была обнаружена: а-амилазная, а- и ß-D-галактозидазная, ß-D-глюкозидазная, Ы-ацетил^-О-глюкозами-нидазная, Ы-ацетил^-О-галактозидазная, а также протеолитическая активность.
Для очистки препарата а-амилазы
A. f lavus var. oryzae от сопутствующих энзи-
мов супернатант культуральной жидкости фракционировали сульфатом аммония от 0 до 30% и от 30 до 90% насыщения. Применение сульфата аммония для выделения энзимных препаратов является традиционным, так как он хорошо растворим в воде и не оказывает вредного влияния на энзимы, а также способен стабилизировать протеиновые глобулы. Поскольку при 30% насыщении сульфатом аммония наблюдалось осаждение части амилолитической активности, в дальнейшем для выделения а-амилазы A. flavus var. oryzae использовали осаждение супернатанта культуральной жидкости сульфатом аммония от 0 до 90% насыщения, что позволило повысить активность энзима в 3 раза. Однако не всегда высаливание сульфатом аммония приводит к повышению уровня активности энзима, иногда происходит только его концентрирование [13].
Дальнейшая схема очистки а-амилазы
A. flavus var. oryzae включала гель-фильтрацию на Toyopearl HW-50 геле (рис. 1). В результате гель-фильтрации диализата высаливания были получены три фракции, однако а-амилазная активность присутствовала только во фракции I, причем была повышена в 1,5 раза, в то время как протео-литическая и другие виды гликозидазной активности были снижены в 30 и 2 раза, соответственно, по сравнению с активностью 90% высаливания.
Дальнейшая ионообменная хроматография фракции I на DEAE-Toyopearl 650 M геле с использованием градиента NaCl (0-
1,0 М) (рис. 2) позволила очистить от сопутствующих протеинов и увеличить а-амилаз-ную активность препарата A. flavus var. oryzae в 9 раз по сравнению с результатами
Номера фракций “ Протеин
—+— Пр0Т*0 ЯОЛМ С ЖЖ X
маиамос»
Рис. 1. Профиль элюции препарата а-амилазы A. flavus var. oryzae на Toyopearl HW-50
гель-фильтрации и в 37 раз по сравнению с активностью в СКЖ. На данном этапе очистки удалось полностью избавиться от про-теолитической, р-О- и а-О-галактозидазной активности и снизить значения Ы-ацетил-р-D-галактозидазной, р-О-глюкозидазной и Ы-ацетил-р-О-глюкозаминидазной активности до следовых количеств (рис. 3).
Рис. 2. Профиль элюции препарата а-амилазы A. flavus var. oryzae на DEAE-Toyopearl 650 M
Рш. 3. Спектр активности препарата а-амилазы A. flavus var. oryzae на разных стадиях очистки.
СКЖ — супернатант культуральной жидкости;
ГФ — гель-фильтрация;
ИОХ — ионообменная хроматография
Таким образом, предложенная схема очистки оказалась эффективной и позволила очистить энзимный препарат A. flavus var. oryzae в 37 раз по сравнению с активностью в СКЖ продуцента.
При производстве любого энзимного препарата важно получить максимально очищенный продукт при минимальных затратах, поэтому параллельно нами был использован более простой, доступный и дешевый метод очистки аффинной сорбции на крахмале. Однако использование этого метода для получения очищенного препарата а-амилазы A. flavus var. oryzae не дало желаемых результатов. Удельная активность энзима не только не была увеличена в результате очистки, но и снизилась в 3 раза, что может быть связано с недостаточной сорбцией а-амилазы A. flavus var. oryzae на данном субстрате. Поэтому в дальнейшем для получения очищенного препарата а-амилазы A. flavus var. oryzae такой метод очистки не применялся.
В СКЖ другого продуцента а-амилазы
B. subtilis 147 помимо а-амилазной активности (2,5-3,0 Ед/мл) отмечалась также про-теолитическая активность (0,5-0,6 Ед/мл), в то время как другие виды гликозидазной активности не были обнаружены. Для выделения препарата а-амилазы из супернатанта культуральной жидкости B. subtilis 147 прибегали к осаждению сульфатом аммония 90%-го насыщения, поскольку, как и в случае с а-амилазой A. flavus var. оryzae, при 30%-м насыщении сульфатом аммония наблюдалось осаждение части амилолитиче-ской активности. Этот способ выделения энзима позволил повысить активность а-амилазы B. subtilis 147 в 6 раз по сравнению с активностью в СКЖ.
Главная задача, стоящая перед нами, заключалась в отделении от а-амилазы энзима с протеолитической активностью. С этой целью применили несколько методов, а именно: использование специфического для связывания протеаз субстрата (диасорб-бацитрацина), гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию, аффинную сорбцию на крахмале.
Ранее исследователи [14] успешно применяли бацитрацин в качестве лиганда для связывания протеаз при аффинной хроматографии, поскольку он является их конкурентным ингибитором, взаимодействуя с зоной связывания субстрата в этих энзимах. Однако в наших исследованиях использование диасорб-бацитрацина не дало положительных результатов: субстрат сорбировал как
протеазу, так и амилазу, а десорбировать амилазу, изменяя ионную силу буфера, не удалось. Применение для этой цели системы растворителей значительно усложняло бы задачу и могло вызвать инактивацию энзима.
Для очистки препарата B. subtilis 147 также были использованы такие методы, как гель-фильтрация на TSK HW-50 геле и ионообменная хроматография на DEAE-TSK 650 M геле. Удельная активность а-амилазы
B. subtilis 147 после очистки этими методами не только не увеличивалась, но даже снижалась, а разделение амилолитического и про-теолитического энзимов не происходило.
Учитывая, что традиционные методы оказались неэффективными для очистки препарата а-амилазы B. subtilis 147, в дальнейших исследованиях использовали аффинную сорбцию на крахмале. Исследователи [15] более 100 лет тому назад обнаружили, что амилаза поджелудочной железы способна сорбироваться на картофельном нерастворимом крахмале. Более того, было показано, что не только крахмал, но и гликоген, а также декстрины могут служить сорбентами а-амилазы. Причем сорби-руемость а-амилазы на полисахаридных субстратах повышается с понижением температуры, поэтому сорбцию проводят при 0-
4 °С, а десорбцию — при повышенных температурах. В качестве субстратов для сорбирования а-амилазы B. subtilis 147 были использованы два вида нерастворимого картофельного крахмала, а также кукурузный крахмал. Наилучшей способностью к сорбированию отличался нерастворимый картофельный крахмал фирмы «Авега» (Украина), поэтому именно этот вид крахмала использовали для дальнейшей работы. Были подобраны оптимальные условия для сорбирования а-амилазы B. subtilis 147: 1) соотношение количества энзима и количества крахмала — 300 мкг и 200 мг соответственно; 2) величина рН буфера — лучше всего энзим сорбировался на крахмале при слабокислых и нейтральных значениях рН. Эти результаты совпадают с данными, полученными исследователями [13, 16] для а-ами-лаз Bacillus sp. BKL20 и B. subtilis IF03108, которые также лучше всего связывались с нерастворимым картофельным крахмалом при слабокислых и нейтральных значениях рН.
Важным условием эффективной очистки а-амилазы является десорбция связанного энзима с носителя. Известно, что десорбция наиболее активно происходит в условиях повышенных температур [17, 18]. Однако не всегда повышение температуры гарантирует
эффективное отделение энзима от носителя. В качестве элюантов использовали 2%-е растворы мальтозы, глюкозы, декстрина, 1 М ацетата кальция и 1 М хлорида калия (рис. 4). а-Амилаза B. subtilis 147 десорбировалась всеми исследованными элюантами, но наилучшие результаты были получены с использованием 0,01 М фосфатного буфера при нагревании до 60 °С и 2% -го раствора декстринов, когда наблюдалась 4- и 3-кратная очистка энзима (50 и 40 Ед/мг протеина соответственно) по сравнению с 90%-м высаливанием, при этом удалось почти полностью избавиться от протеазы (0,02 Ед/мл).
Таким образом, аффинная сорбция на крахмале оказалась эффективным методом очищения а-амилазы B. subtilis 147, что позволило очистить ее в 20 раз по сравнению с СКЖ. По результатам, полученным другими авторами, с использованием аффинного метода очистки на основе крахмала им удалось достичь 18-кратной очистки а-амилазы [6].
Дальнейшая работа была связана с определением оптимальных значений рН и температуры действия очищенных а-амилаз
A. flavus var. oryzae и B. subtilis, а также с изучением их стабильности при оптимальных значениях рН и температуры.
Для определения рН-оптимумов действия очищенных а-амилаз (рис. 5) использовали
0,05 М универсальный буферный раствор с диапазоном значений рН от 3,0 до 12,0. Установлено, что препараты а-амилаз в зависимости от штамма отличались оптимальными условиями действия. Так, а-амилаза B. subtilis 147 была активна в диапазоне рН от 4,0 до 9,0, с оптимальным значением 8,0. Подобное свойство было характерно для а-амилазы B. cohnii, проявляющей активность в диапазоне рН от 4,0 до 10,0 [19],
5 70
2м »
В*
И 40
S 3 »
S а
IS зо
о ———i—■——i———i———i———i———i акорж 6ytf> ментол главе» ШШ Ш
С<СНЗСОО]0
Элю юлы
Рис. 4. Влияние разных веществ на десорбцию а-амилазы B. subtilis 147 с нерастворимого картофельного крахмала.
«-» — Амилолитическая активность диализата 90%-го высаливания
Рис. 5. Определение рН-оптимума очищенных а-амилаз A. flavus var. oryzae и B. subtilis 147
а-амилазы B. subtilis JS-2004 с оптимумом рН 8,0 [20], а-амилазы из Bacillus sp. BKL20, которая проявляла высокую амило-литическую активность в широком диапазоне рН - от 6,0 до 11,0 [13], для а-амилазы
B. subtilis KIBGE HAS с рН-оптимумом 7,5 [21], а-амилазы B. cereus с оптимумом рН
8,0 [22].
а-Амилаза A. flavus var. oryzae 80428 имела оптимум рН 6,0 и была активна при рН от 4,0 до 7,0. а-Амилазы таких грибных продуцентов, как A. niger, Penicillium citrinum HBF62 и P. camemberti PL21, имели максимальную активность при рН 5,0 [24], 5,5 и 6,5 [6, 23], соответственно.
Таким образом, исследуемые нами препараты а-амилаз были активными при кислых, нейтральных и щелочных значениях рН.
Изучение стабильности а-амилаз с оптимальными значениями рН показало, что а-амилаза B. subtilis 147 (рис. 6) полностью сохраняла стабильность в течение 24 ч при рН 7,0; 8,0; 9,0, а при рН 6,0 — 63% от
Время, мин
-pH 4,0 -pH 3,0 pH 6,0
pH 7,0 -pH 8,0 -pH 9,0
исходной активности. Значения рН 4,0 и 5,0 оказались неблагоприятными для а-амилазы B. subtilis 147 — через 3 ч энзим сохранял всего 30% начальной активности, а через 24 ч активность полностью исчезала. Подобное свойство характерно для а-амилазы Bacillus sp. BKL20, которая также была полностью стабильна в течение 24 ч при рН 7,0-9,0, а при рН 4,0 и 5,0 имела незначительную активность [13]. а-Амилаза B. subtilis JS-2004 через сутки при оптимальном значении рН 8,0 сохраняла 94% начальной активности, а при рН 7,0 и 9,0 — 90% [20].
а-Амилаза A. flavus var. oryzae (рис. 7) оказалась полностью стабильной в течение 24 ч при рН 5,0; 6,0; 7,0, а при рН 4,0 сохраняла только 17% исходной активности. а-Амилаза P. citrinum HBF62 через сутки проявляла 95% начальной активности при рН 7,5, 80% — при рН 6,5 и 74% — при оптимальном значении рН 5,5 [6]. Таким образом, исследуемые нами а-амилазы B. subtilis 147 и
A. flavus var. оryzae были полностью стабильными при оптимальных значениях рН.
Зависимость активности большинства энзимов от температуры графически описывается кривой, с помощью которой определяют оптимальную для каждой реакции температуру. Определение термооптимума показало (рис. 8), что а-амилаза B. subtilis 147 с рН-оптимумом 8,0 проявляла максимальную активность при температуре 90 °С, а а-амилазаA. flavus var. oryzae с оптимумом рН 6,0 — при температуре 60 °С. Эти результаты согласуются с данными, полученными другими авторами для а-амилазы Bacillus HUTBS62, которая проявляла максимальную активность при 90 °С [25], а-амилазы Geobacillus thermoleovorans с термооптиму-
Рис. 6. рН-стабильность очищенной а-амилазы
B. subtilis 147
Рис. 7. рН-стабильность очищенной а-амилазы A. flavus var. oryzae
120
100
И
І 80
6
* і 60
6 40
£
£Û
X
s 20
<
о -----і---.-----1----1----1----1 ♦ і ♦-1
4 16 37 50 60 70 80 90 100
Температура, °С
♦ а-амилаза Aspergfflus oryzae » а-амилаза Bacillus subtilis
Рис. 8. Определение термооптимума очищенных а-амилаз A. flavus var. oryzae и B. subtilis 147
мом при 100 “С [1], а-амилазы Bacillus sp. PN5 c максимальной активностью при 90 “С [26], а-амилазы P. citrinum HBF62 c термооптимумом при 55 “С [6].
Определение термостабильности показало, что а-амилаза B. subtilis 147 с рН-опти-мумом 8,0 (рис. 9) оказалась полностью термостабильной в течение 3 ч при температуре 37, 60 и 70 “С, при 80 “С — сохраняла 80% исходной активности. При оптимальной температуре 90 “С энзим сохранял 70% исходной активности в течение получаса и 7% — 3 ч инкубирования. а-Амилаза Bacil -lus HUTBS62 на протяжении 3-часового инкубирования при 60 “С сохраняла 80% исходной активности, при 70 “С — около 60%, при 80 “С — 55% и при 90 “С — 40% [25].
Изучение термостабильности а-амилазы
A. flavus var. оryzae показало (рис. 10), что при инкубировании энзима в течение 3 ч при температуре 37 °С она сохраняет 100% ак -тивности, а при оптимальной температуре 60 °С уже через полчаса наблюдалось снижение активности до 22%, через 3 ч — до 3%. В то же время а-амилаза P. citrinum HBF62 при 3-часовой инкубации при 27 °С сохраняла 93% исходной активности, а при 60 °С — 75% [6].
140
о --------------------------т--------? т
15 30 60 130 180
Время, мин
-*-31 °С -•-60 °С
Рис. 10. Термостабильность очищенной а-амилазы A. flavus var. oryzae
Таким образом, в результате проведенных исследований были получены очищенные препараты а-амилаз A. flavus var. оryzae 80428 и B. subtilis 147. По результатам изучения рН- и термостабильности а-амила-за B. subtilis 147 является перспективной не только с научной точки зрения, но и для применения в различных отраслях промышленности, особенно для осахаривания крахмалосодержащего сырья, поскольку использование термостабильного энзима дает возможность непосредственно перейти от стадии желатинизирования крахмала к его расщеплению без дополнительных затрат на охлаждение реакторов.
Время, мни
37ФС —А-70*С
—60*С -»-80*С
Рис. 9. Термостабильность очищенной а-амилазы B. subtilis 147
ЛИТЕРАТУРА
1. Uma Maheswar Rao J. L., Satyanarayana T. Purification and characterization of a hyperthermostable and high maltogenic а-amylase of an extreme thermophile Geobacillus ther-moleovorans // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2007. — V. 142, N 2. — P. 179-193.
2. Prakash O, Jaiswal N. а-Amylase: An ideal representative of thermostable enzymes // Ibid. — 2009. — V. 160, N 8. — P. 2401-2414.
3. Mitidieri S., Souza M. A. H, Schrank A., Vain-stein M. H. Enzymatic detergent formulation containing amylase from Aspergillus niger: A comparative study with commercial detergent formulations // Biores. Technol. — 2006. — V. 97. — P. 1217-1224.
4. De Souza P. M, Magalhaes P. O. Application of microbial а-amylase in industry: A review // Braz. J. Microbiol. — 2010. — V. 41, N 4. — P. 850-861.
5. Rao D, Swamy A. V. N., SivaRamaKrishna G. Bioprocess technology strategies, production and purification of amylases: An overview // The Internet J. Genomics and Proteomics TM ISSN: 1540-2630. — 2007. — V. 2, N 2.
6. Metin K, Koc Ц, Burcu B. A. Z., Halil B. H. Purification and characterization of а-amylase produced by Penicillium citrinum HBF62 // Afr. J. Biotechnol. — 2010. — V. 9, N 45. — P. 7692-7701.
7. ГОСТ 20264.4-89. Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности. — Изд-во стандартов, 1989. — 17 с.
8. Lowry O. H., Rosebrough H. J., Faar A. L., Randal R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. — 1963. — V. 193, N 1. — P. 265-275.
9. Петрова И. С., Винцюнайте М. Н. Определение протеолитической активности ферментных препаратов микробного происхождения // Прикл. биохим. микробиол. — 1966. — Т. 2, № 1. — С. 322-327.
10. Буглова Т. Г., Маланчук В. М. и др. Физио-лого-биохимические особенности некоторых продуцентов а-галактозидазы // Микробиол. журн. — 1991. — Т. 53, № 6. — С. 34-41.
11. Shipra D., Surendra S., Vinni S., Manohar L. S. Biotechnological applications of industrially important amylase enzyme // Intern. J. Pharm. Bio Sci. — 2011. — V. 2, Issue 1. — P. 486-496.
12. Улезло И. В., Запрометова О. М. -Галак-тозидаза микроорганизмов // Прикл. био-хим. микробиол. — 1982. — Т. 18, № 1. —
С.3-15.
13. Kubrak O. I., Storey J. M., Storey K. В., Lush-chak V. I. Production and properties of а-amylase from Bacillus sp. BKL20 // Can. J. Microbiol. — 2010. — V. 56. — P. 279-288.
14. Степанов В. М., РуденскаяГ. Н., Янонис В. В. и др. Аффинная хроматография протеиназ
на сорбентах, содержащих бацитрацин в качестве специфеского лиганда // Биоорг. химия. — 1978. — Т. 4, № 9. —
С.1256-1263.
15. Галич И. П. Амилазы микроорганизмов. — К.: Наук. думка, 1987. — 192 с.
16. Mitsuiki S., Mukae K., Sakai M. et al. Comparative characterization of raw starch hydrolyzing а-amylases from various Bacillus strains // Enzyme and microbial technology. — 2005. — V. 37. — P. 410-416.
17. Mendu D. R., Ratnam B. V. V., Purnima A., Ayyanna C. Affinity chromatography of а-amylase from Bacillus licheniformis // Ibid. — 2005. — V. 37, N 7. — P. 712-717.
18. Najafi M. F., Kembhavi A One step purification and characterization of an extracellular а-amylase from marine Vibrio sp. // Ibid. — 2005. — V. 36, N 4. — P. 535-539.
19. Ghorbel R. E., Maktouf S., Massoud E. B. et al. New thermostable amylase from Bacillus cohnii US147 with a broad pH applicability // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2009. — V. 157. — P. 50-60.
20. Asgher M., Asad M. J., Rahman S. U., Legge R. L. A thermostable а-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing // J. Food Engin. — 2007. — V. 79. — P. 950-955.
21. Saeeda Bano, Shah Ali Ul Qader, Afsheen Aman et al. Purification and characterization of novel а-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS // J. Amer. Assoc. Pharm. Sci. — 2011. — V. 12, N 1. — P. 255-261.
22. Annamalai N., Thavasi R., Vijayalakshmi S., Balasubramanian T. Extraction, purification and characterization of thermostable, alkaline tolerant а-amylase from Bacillus cereus // Ind. J. Microbiol. — 2011. — V. 51, N 4. — P. 424-429.
23. Nouadri T., Meraihi Z.a, Shahrazed Dj.-Dak., Bennamoun L. Purification and characterization of the а-amylase isolated from Penicillium camemberti PL21 // Afric. J. Biotechnol. —
2010. — V. 4, N 6. — P. 155-162.
24. Kiran Kumar V., Ravi Sankar N., Shailaja R. et al. Purification and characterization of а-amylase produced by Aspergillus niger using banana peels // J. Cell and Tissue Research. —
2011. — V. 11, N 2. — P. 2775-2780.
25. Al-Quadan F., Hazem A., Rasha N. Characteristics of a novel, highly acid- and thermostable amylase from thermophilic Bacil lus strain HUTBS62 under different environmental conditions // Ann. Microbiol. — 2011. — V. 61, N 4. — P. 887-892.
26. Rajendra K. S., Kakoli D., Agarwal L., Nayyar P. A highly thermostable and alkaline amylase from a Bacillus sp. PN5 // Biores. Technol. — 2007. — V. 98. — P. 260-265.
ОЧИЩЕННЯ а-АМІЛАЗ Aspergillus flavus var. oryzae І Bacillus subtilis ТА ЇХНІ ВЛАСТИВОСТІ
К. В. Авдіюк Л. Д. Варбанець Л. А. Сафронова Е. С. Харкевич
Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Підібрано методи виділення та очищення ензимів з а-амілазною активністю двох продуцентів — Aspergillus flavus var. oryzae 80428 і Bacillus subtilis 147, які включали: фракціонування сульфатом амонію, гель-фільтрацію на TSK-гелі Toyopearl HW-50 та іонообмінну хроматографію на TSK-гелі DEAE-Toyopearl 650 M (для а-амілази A. flavus var. oryzae); фракціонування сульфатом амонію та афінну сорбцію на крохмалі (для а-амілази B. subtilis 147). а-Амілазу A. flavus var. оryzae було очищено в 37 разів, а-амілазу B. subtilis 147 — у 20 разів порівняно з активністю ензиму в культу-ральній рідині. а-Амілаза A. flavus var. оryzae виявляла максимальну активність при рН 6,0 і за температури 60 ОС, зберігала 100% активності через 24 год при рН 5,0-7,0 і протягом 3 год за температури 37 ОС. рН-оптимум а-амілази B. subtilis 147 становив 8,0 з термооптимумом при 90 ОС; ензим повністю зберігав вихідну активність упродовж доби при рН 7,0-
9,0 та протягом 3 год за температури 37 ОС, 60 ОС, 70 ОС. За температури 80 ОС а-амілаза
B. subtilis 147 зберігала 80% початкової активності після 3 год інкубування.
Ключові слова: а-амілаза, гель-фільтрація, іонообмінна хроматографія, Aspergillus flavus var. oryzae, Bacillus subtilis, очищення.
PURIFICATION OF Aspergillus flavus var.
oryzae AND BACILLUS SUBTILIS а-AMYLASES AND THEIR PROPERTIES
K. V. Avdiyuk L. D. Varbanets L. A. Safronova E. S. Harkevich
Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Methods of isolation and purification of enzymes with а-amylase activity of the two producers — Aspergillus flavus var. oryzae 80428 and Bacillus subtilis 147 were selected which included: ammonium sulfate fractionation, gel filtration on TSK-gel Toyopearl HW-50 and ionexchange chromatography on TSK-gel DEAE-Toyopearl 650 M (for а-amylase, A. flavus var. oryzae); fractionation by ammonium sulfate and affinity sorption on starch (for а-amylase,
B. subtilis 147). а-Amylase of A. flavus var. огу-zae was purified in 37 times and а-amylase
B. subtilis 147 — in 20 times in comparison with enzyme activity in supernatant of cultural medium. а-Amylase of A. flavus var. oryzae showed maximum activity at 60 ос and pH 6,0 and retained 100% activity after 24 h at pH 5,0-7,0 and after 3 h at 37 ОС. The pH and temperature for optimum activity of the enzyme were 90 ОС and 8,0. It was stable at рН 7,0-9,0 after 24 h and at 37 ОС, 60 ОС, 70 ОС after 3 h and retained 80% of the initial activity after 3 h at 80 ОС, respectively.
Key words: а-amylase, gel-filtration, іоп-exchange chromatography, Aspergillus flavus var. oryzae, Bacillus subtilis, purification.
