CC BY
49
УДК 579.64
Л. С. Алексеева, Д. В. Тюпа*, С. В. Калёнов, В. И. Панфилов
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 , корп. 1 * e-mail: d.tiupa@inbox.ru
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОМПОНЕНТОВ АЗОТФИКСИРУЮЩЕГО СООБЩЕСТВА ГРАНУЛИРОВАННОГО АЭРОБНОГО АКТИВНОГО ИЛА, АДАПТИРОВАННОГО К СТРЕССУ
Исследовано выделенное из гранул адаптированного к стрессу аэробного активного ила азотфиксирующее сообщество микроорганизмов. Установлено, что оно представляет собой факультативно-синтрофный консорциум трех бактериальных культур, одна из которых не является азотофиксатором. Культуры выделены в чистом виде пассивированием на селективных средах и идентифицированы с применением микробиологических методов. Высокая азотфиксирующая активность сообщества позволяет предложить его для разработки препаратов для фертилизации почвы, устойчивых к стрессу.
Ключевые слова: азотфиксаторы; азотфиксирующее сообщество; Rhizobium; Agrobacterium; Azotobacter.
Стремительное ухудшение качества почв по всему миру остро ставит задачу их рекультивации и возвращения в сельскохозяйственный оборот. Немаловажную роль в этом процессе может сыграть биологическая фиксация азота, производимая некоторыми микроорганизмами. Наиболее известные из них, симбионты бобовых растений р. ЯЫхоЫит, играют решающую роль в фиксации азота, однако данному процессу препятствует ряд ограничивающих факторов, определить которые можно емким понятием «тресс-факторы». Азотфиксирующие бактерии р. ЯЫгоЪшт различаются своей чувствительностью к различным факторам окружения, но предел этой чувствительности достаточно низок. Дефицит ростовых факторов, соленость почв, неблагоприятный рН, температура, тяжелые металлы, биоциды, болезни растений, выпас скота, нитратный стресс, ограниченная влажность и сочетание вышеперечисленных неблагоприятных условий приводят как к исчезновению популяции азотфиксирующих в почве, так и к замещению микробиоценоза почвы в целом, переводу его в неблагоприятный для растений режим [1].
Задача поиска толерантных к стрессу штаммов азотфиксаторов стоит достаточно остро, исследователи находят и описывают их в различных экологических нишах, однако внедрение их в сельское хозяйство сдерживается малой азотфиксирующей активностью в условиях стресса и отсутствием устойчивости к сочетанному стрессу. Например, виды, устойчивые к высокой температуре не переносят повышение содержания кислорода в почве, некоторые обладают требовательностью к
микроэлементам и специфическим ростовым факторам. Подобные проблемы могут решаться рядом технологических приемов иммобилизацией с источниками ростовых факторов, защитными средами, а также применением устойчивых микробных сообществ, в которые входят азотфиксаторы. Последний подход может оказаться наиболее перспективным в свете данных работ, посвященных выделению свободноживущих бактерий р. ЯЫгоЫит, облигатно не ассоциированных с растениями [2].
Активный ил водоочистных сооружений может являться источником сообществ азотфиксирующих микроорганизмов, которые оказывают существенное влияние на биологическую активность всего сообщества и качество очистки воды. Именно очистные сооружения являются «искусственным накопителем» самых разнообразных культур с огромных территорий. Присутствующие в активном иле пусть даже в очень незначительном, следовом количестве, эти культуры можно отобрать с помощью ряда манипуляций.
В ходе работ, направленных на получение устойчивого аэробного гранулированного активного ила, проведенных на кафедре биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева [3], выделена ассоциация азотфиксирующих микроорганизмов, присутствовавшая в этих гранулах и изучавшаяся отдельно. Особенностью отбора азотфиксаторов стали условия получения гранул аэробного активного ила: отъемно-доливной режим ведения процесса, включающий стадии голодания консорциума активного ила и
воздействия на него до 1 г/л пероксида водорода в предстационарную фазу развития.
Азотфиксаторы были выделены посевом механически разрушенных гранул на стандартную среду Эшби. В ходе предварительного 16Б рРНК анализа было выявлено присутствие в ассоциации микроорганизмов трех бактериальных культур; высев ассоциата по Коху на среду Эшби [4] не позволил выделить отдельные культуры - в одинаковых по морфологии колониях всегда
Характеристики колоний микробных
присутствовала смесь культур, что может говорить о синтрофном сообществе. Посев по Коху на среду для азотфиксаторов, содержащую бобовый отвар [4] дал возможность получить отличающиеся морфологически отдельные бактериальные колонии (табл. 1, рис. 1) из которых взяты образцы для микроскопирования (рис.2), окраски по Граму и окраски капсул по Омелянскому.
Таблица 1
олятов на среде для азотфиксаторов с бобовым отваром
Номер культуры Форма Размер, мм Край Структура Цвет Профиль Блеск и прозрачность
1 Круглая 3 Гладкий Однородная, слизистая Бесцветная Выпуклая Блестящая, непрозрачная
2 Неправильная 5-6 Ветвистый Струйчатая, в виде налета Бесцветная Плоская Матовая, непрозрачная
3 Круглая 1-2 Гладкий Однородная, слизистая Желтая Выпуклая Блестящая, непрозрачная
Рис. 1. Вид микробных изолятов 1 (А), 2 (Б) и 3 (В), посеянных штрихом на среду для азотфиксаторов,
содержащую бобовый отвар
Рис. 2. Микроскопирование микробных изолятов 1 (А), 2 (Б) и 3 (В) (16x100), фиксированный препарат
А
#
Б
/ Ф
Г '» • % * 1 : • • у ф
.» * / / \ 1 л о
•
Проведенный первичный и последующий 16Б рРНК анализ позволил идентифицировать изоляты.
Изолят 1: клетки эллипсоидальной формы, грамотрицательные, капсул не образуют, предположительно Agrobacterium Ште/ас1ет (Agrobacterium и А11огЫ2оЬшт были включены в род ЯЫхоЫит [2]), азотфиксаторы.
Изолят 2: клетки преимущественно палочковидной формы, грамотрицательные, при окраске по Омелянскому обнаружены капсулы, предположительно относятся к р. Аго1оЬас1ег, азотфиксаторы.
Изолят 3: грамположительные кокки, предположительно относятся к р. М1сгоЬас1епит. к зотфиксаторам не относятся.
Взаимоотношения между изолятами охарактеризованы по методу Петровой, при этом доказано усиление роста изолята 3 в присутствии либо изолята 1, либо изолята 2.
Сравнение ростовых характеристик азотфиксаторов - изолятов 1, 2 и исходной ассоциации на жидкой среде Эшби в микроаэрофильных условиях показывает в 3 раза большую скорость роста сообщества при накоплении около 2 г/л биомассы за 7 суток роста по сравнению с отдельными изолятами 1, 2. Соотношение изолятов 1, 2, 3 в сообществе составляет 80%, 8%, 12% соответственно. В
условиях повышенной аэрации рост микроорганизмов ингибируется, что характерно для азотфиксаторов. Наилучший рост ассоциации обеспечивался при поверхностном
культивировании на агаризованной среде Эшби -в процессе роста выделяется большое количество слизи, то есть экзополимера, секретируемого в основном изолятом 1. Устойчивость сообщества и отдельных культур к стрессу определялась в модельных опытах с пероксидом водорода. На жидкой среде Эшби сообщество выдерживало до 0,2 г/л пероксида водорода при 50%-ном вымирании и дальнейшем продолжении роста, тогда как изоляты 1 и 2 в этих условиях лизировались полностью. Изолят 3, зависящий от азотфиксирующих бактерий сообщества, на Ь-бульоне был толерантен к 0,2-0,3 г/л пероксида водорода. Скорее всего, именно данная культура определяет реакцию азотфиксирующего сообщества на пероксид водорода.
Таким образом, первичная характеристика консорциума азотфиксирующих
микроорганизмов, выделенных из
адоптированного к стрессу гранулированного аэробного активного ила, позволяет предложить данное микробное сообщество в качестве варианта для разработки качественно новых препаратов для фертилизации почвы, устойчивых к стрессовым воздействиям.
Алексеева Людмила Сергеевна студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Тюпа Дмитрий Валериевич аспирант кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Калёнов Сергей Владимирович к.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Панфилов Виктор Иванович д.т.н., профессор кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Hamdi H.Z. Rhizobium-legume symbiosis and nitrogen fixation under severe conditions and in an arid climate // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. Vol. 63. P. 968-989.
2. Berge O., Lodhi A., Brandelet G. Rhizobium alamii sp. nov., an exopolysaccharide-producing species isolated from legume and non-legume rhizospheres // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. Vol. 59. P. 367-372.
3. Khokhlachev N.S., Kalenov S.V., Tyupa D.V. The role of stress agents as operating factors in formation
and functioning of granular aerobic activated sludge at model domestic wastewater treatment // Bioprocess Biosyst. Eng. 2014 (article in press).
4. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студентов высших учебных заведений / Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. - М.: Издательский центр «Академия». - 2005. -600 с.
Alexeeva Lyudmila Sergeevna, Tyupa Dmitry Valerievich*, Kalenov Sergei Vladimirovich, Panphilov Viktor Ivanovich
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. * e-mail: d.tiupa@inbox.ru
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF NITROGEN-FIXING COMMUNITY COMPONENTS OF AEROBIC GRANULAR ACTIVATED SLUDGE ADAPTED TO STRESS
Abstract
Nitrogen-fixing microbial community isolated from granules of adapted to stress aerobic activated sludge was studied. It has been established that it represents an optionally-syntrophic bacterial consortium of three cultures, one of which is not a nitrogen fixers. The cultures were isolated in pure by passivation on selective media and identified using the microbiological techniques. High nitrogen-fixing activity of the community allows to offer it to develop products resistant to stress for the fertilization of the soil.
Key words: nitrogen fixers; nitrogen-fixing community; Rhizobium; Agrobacterium; Azotobacter.
