CC BY
140
УДК 631.46
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS -АССОЦИАТИВНАЯ АЗОТФИКСИРУЮЩАЯ БАКТЕРИЯ
Фунг Тхи Ми (Вьетнам), Н.А. Манучарова, А.Л. Степанов, Л.А. Поздняков, О.В. Селицкая, В.Т. Емцев
Из ризопланы овощных растений, произрастающих на почвах Северного Вьетнама, на безазотистой среде выделено 227 чистых бактериальных культур, которые проявляли азотфиксирующую активность и в условиях модельных опытов оказывали положительный ростовой эффект на растения, причем инокуляция ими не вызывала образование клубеньков. Определение филогенетического положения наиболее активных штаммов на основании секвенирования гена 16S рРНК показало, что они принадлежат к семейству Rhizobiaceae филогенетической группы Alpharoteobacteria и наиболее близки к типовому штамму р. Agrobacterium — A. tumefaciens. По физиолого-биохимиче-ским признакам эти организмы также отнесены к A. tumefaciens. Таким образом, выделенные нами штаммы данного вида бактерий, известного как фитопатоген, выступают в качестве ассоциативных азотфиксаторов и, более того, оказывают положительное влияние на рост и развитие культурных растений.
Ключевые слова: азотфиксирующие бактерии, ассоциативные бактерии, Ipomoea aquatica, Brassica integrifolia, ростактивирующие вещества, нитрогеназная активность, стимуляция роста растений, Agrobacterium tumefaciens.
Введение
С момента открытия известно, что Agrobacterium tumefaciens является возбудителем корневого рака [18] и патогенен для растений [11]. Па-тогенность обусловлена наличием Ti-плазмиды, которая способна встраиваться в ядерную ДНК растительных клеток, вызывая их неупорядоченный рост и неконтролируемый синтез опинов — источника питания для бактерий. Уникальная способность A. tumefaciens трансформировать геном растений в настоящее время широко используется в генной инженерии [19]. Это направление исследований приковало к себе внимание ученых, тогда как работ в области экологии A. tumefaciens на данный момент проведено недостаточно. В 1990 г. L. Kanvinde и G.R.K. Sastry [14] показали, что эти организмы могут фиксировать атмосферный азот, однако систематические исследования по определению их потенциала как азотфиксатора с тех пор не проводились. Следовательно, изучение A. tumefaciens, обитающего в ризоплане растений, является в настоящий момент интересным и практически важным.
В последние десятилетия число исследований, посвященных ассоциативным азотфиксирующим бактериям, существенно возросло, так как они, обитая на корнях растений, улучшают их азотное питание, стимулируют рост, а также обеспечивают защиту от фитопатогенов, чем способствуют адаптации к стрессовым факторам. К ассоциативным бактериям относят представителей таких родов, как Azospirillum, Enterobacter, Erwinia, Serra-
tia, Alcaligenes, Arthrobacter, Acinetobacter и Flavo-bacterium.
Данная работа проделана на образцах из Вьетнама, где давно проводятся исследования по выделению бактерий из ризопланы корней риса, арахиса, кофе, кукурузы и др. Однако изучение азотфиксаторов в ризоплане овощных культур ранее здесь не проводилось, в связи с чем исследования в данной области представляются актуальными.
Первоначальная цель работы — исследование бактериального населения ризопланы таких овощных культур, как водяной шпинат (Ipomoea aquatica) и разнолистная капуста (Brassica integrifolia), выращиваемых в условиях Северного Вьетнама, а также поиск наиболее активных азотфиксаторов, оказывающих наибольшее стимулирующее влияние на развитие культурных растений. Такие микроорганизмы перспективны в плане использования их для создания бактериальных удобрений.
Объекты и методы исследования
Объекты — ассоциативные бактерии ризопла-ны двух видов упомянутых выше овощных культур, ранее не изучавшихся в подобных целях. Водяной шпинат, или ипомея водяная, — вид цветковых растений сем. Вьюнковые (Convolvulaceae). Однолетняя или многолетняя травянистая форма, в пищу употребляются стебли и листья. Капуста разнолистная из сем. Капустные (Brassicaceae) — однолетнее растение высотой 50—100 см. Эти две овощные культуры — одни из важнейших во Вьетнаме.
Для анализа азотфиксирующих микроорганизмов ризопланы отбирали образцы корней, отмыва-
ли их в стерильной воде и помещали во флаконы с безазотной питательной средой Федорова—Калининской [8]. К ней добавляли 10 г/л глюкозы, 0,1 г/л дрожжевого автолизата, 2 мл 0,5%-го спиртового раствора бромтимолблау и инкубировали при температуре 25—28°. Затем культуры пересевали в полужидкую среду Федорова—Калининской с сахарозой или малатом и смесью витаминов: 10 мкг/л биотина, 200 — рибофлавина, 2 — витамина В12, по 100 мкг/л тиамина, пиридоксина, панто-тената кальция, никотиновой и парааминобензой-ной кислот. Инкубация проходила при 28° в течение двух недель.
Из смешанных культур, показавших наиболее высокий уровень нитрогеназной активности, выделяли чистые культуры бактерий на средах DAS [3] и Эшби [8]. Их пересевали в пенициллиновые флаконы с 5 мл полужидкой среды Федорова—Калининской с сахарозой и через неделю определяли нитрогеназную активность.
Активность фиксации азота определяли ацетиленовым методом [4] с помощью газового хроматографа Chrom-4. Диазотрофные культуры выращивали в пенициллиновых флаконах, закрытых ватными пробками. Перед измерением их заменяли на эластичные резиновые, прочно заворачивали в полиэтилен, добавляли во флакон 1 мл ацетилена и инкубировали сутки при 28°. Нитрогеназную активность выражали в наномолях образовавшегося этилена за один час инкубации.
Для выяснения способности выделенных культур к биосинтезу ростовых веществ проводили опыт с кресс-салатом. Семена замачивали в течение 30 мин. в суточной бактериальной культуре разной концентрации: разведение в 10, 100, 1000 раз; контроль — вода. После этого в чашках Петри на фильтровальную бумагу раскладывали по 20 замоченных семян, вносили 2 мл воды и проращивали в термостате при 25°. Через 72 ч. измеряли длину корешков и стебельков проростков.
Модельный опыт проводили на партенокар-пическом гибриде F1 огурца (Cucumis sativus) сорта «Кассандра» РГАУ—МСХАим. К.А. Тимирязева и разнолистной капусте (Brassica integrifolia) сорта «VK 13» агрофирмы «Vinh Nöng». Растения выращивали в климатической камере в течение 40 дней при следующих параметрах: день — 16ч., +25°, ночь — 8 ч., +18°. Семена огурцов замачивали в воде двое суток, разнолистной капусты — сутки при температуре 25°. Перед посевом проросшие семена обоих видов растений выдерживали в суточной бактериальной культуре в течение двух часов. Титр суточной культуры составлял 7,5 • 108—8,0 • 108 КОЕ/мл. Обработанные проросшие семена высевали в стеклянные сосуды (объем 150 мл) с вермикулитом и раствором смеси Прянишникова [3], закрытые ватной пробкой. Спустя 20 дней растения поливали 8 мл раствора бактериальной суточной культуры (разведение 1:50, титр
суточной культуры — 1,80 • 108—2,0 • 108 КОЕ/мл). Повторность опытов шестикратная.
Для определения нитрогеназной активности культур в ассоциации с растениями в сосуды с вермикулитом добавляли 10 мл ацетилена, закрывали их эластичной резиновой пробкой, прочно заворачивали в полиэтилен и инкубировали в течение двух суток. Для измерения нитрогеназной активности на корнях растений после 40 дней наблюдений мы отбирали корни (0,1 г для огурца и
0.01 г для разнолистной капусты), отмывали их в воде, помещали во флаконы (объем 15 мл) с 5 мл безазотной питательной среды Федорова—Калининской и инкубировали в термостате при 28° в течение недели. Анализы также включали в себя измерение высоты и массы стебля растений после 40 дней наблюдений.
Морфологические и физиолого-биохимические особенности отобранных культур изучали классическими методами [7, 8] в соответствии с показателями, описанными в «Определителе бактерий» Берджи [10, 13].
Филогенетическое положение выделенных микроорганизмов определяли на основании секвени-рования гена 16S рРНК. ДНК из бактерий выделяли методом, описанным в [7]. Концентрация полученных препаратов ДНК составляла 30—50 мкг/мл. Для проведения полимеразной цепной реакции гена 16S рРНК применяли пару «полнометражных» праймеров [5]; для секвенирования ПЦР-про-дуктов использовали набор реактивов SilverSequ-encing, Promega (США), согласно рекомендациям производителя.
Для опеределения сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов пользовались генбанком BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Они были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий при помощи программы BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html). Филогенетические деревья построены на алгоритме «neighbour-joining», реализованном в программе Mega.
Статистическую обработку полученных данных проводили по критериям Фишера—Стьюден-та по программе Statistica 5,5.
Результаты и их обсуждение
Выделение наиболее активных ассоциативных азотфиксаторов. На первом этапе работы из ризопланы Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia получено 36 образцов накопительных культур, большинство из которых имели невысокую азотфик-сирующую активность. Однако были обнаружены четыре накопительные культуры из ризопланы
1. aquatica (A—D) и три из ризопланы B. integrifolia (E—J), которые при росте на среде Федорова— Калининской с сахарозой превосходили остальные
культуры по способности к азотфиксации более чем на порядок. Эти культуры выбрали для дальнейших исследований. Они характеризовались нит-рогеназной активностью на уровне 9,01—19,21 нмоль С2Щ/ч, причем образцы из ризопланы I. aquatica более активны, чем из ризопланы B. integrifolia. На среде Федорова—Калининской с малатом уровень нитрогеназной активности всех культур был низким и варьировал мало (самое высокое значение составило только 1,24 нмоль С2Щ/ч).
Из отобранных накопительных культур (A—J) выделили 227 чистых культур. Каждую из них вновь протестировали на активность азотфиксации, и 17 наиболее активных изолятов отобрали для дальнейших модельных опытов. Такими изолятами стали А20 с нитрогеназной активностью 29,37 нмоль С2Н4/ч, В30 (19,44), В31 (27,81), С7 (44,24), С12 (42,7), C13 (43,2), C19 (42,57), C22 (42,87), C31 (42,65), C37 (43,9), C43 (41,95), D2 (2,58), E17 (4,13), E30 (2,96), F12 (8,99), J26 (2,41) и J35.
Проверка влияния выделенных культур бактерий на растения в условиях модельного опыта (рост кресс-салата) показала, что большинство полученных штаммов способно к активации роста растений на ранних стадиях развития. При достаточно высоком разведении бактериальной культуры (1:100, 1:1000) наблюдалась существенная стимуляция роста как корней (до 149%), так и стеблей (до 139%) проростков кресс-салата. При разведении 1 : 10 все варианты показывают значения, близкие к контролю.
Максимальный ростовой эффект в данном опыте показали изоляты E17, C22 при разведении 1:1000 на корешки — 141 и 149% от контроля, C43, F12 (1:1000) на стебельки — 134 и 139%, J26 (1:100) на корешки — 149%, C7, C19 (1:100) на стебельки — 122 и 123% от контроля. Поскольку на данной стадии развития растений используются запасные вещества семени, причиной положительного влияния указанных штаммов на проростки тест-культуры является, скорее всего, их способность не к азотфиксации, а к синтезу ростактивирующих веществ и подавлению роста фитопатогенных микроорганизмов [2]. Из литературы известно, что растения и ризосферные бактерии обмениваются химическими веществами — «сигналами», которые позволяют им вступать в му-туалистические взаимоотношения. Среди таких веществ, образуемых ризобактериями, — гормоны роста растений, в частности ауксин (индолил-3-уксусная кислота — ИУК). Активными продуцентами ИУК являются бактерии Aeromonas veronii, Edwardsiella tarda, Listonella anguillarum, Pantoea ananas, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii, а также типичные почвенные бактерии — представители родов Arthrobacter, Pseudomonas и некоторые другие, в том числе Agrobacterium [9].
С указанными семью изолятами был проведен модельный опыт на растениях огурца и раз-
нолистной капусты с целью определения их стимулирующего воздействия на развитие растений при более поздних стадиях роста и измерения азот-фиксирующей активности in situ на корнях. Нит-рогеназную активность в сосудах с растениями, инокулированными одним из семи штаммов, определяли на 20-й день опыта. После завершения опыта измеряли азотфиксацию на отобранных и отмытых корнях растений, помещенных в безазотную питательную среду Федорова—Калининской. Корреляция между активностью азотфикса-ции на живых растениях после 20 дней и на корнях этих же растений после 40 дней выращивания не обнаружена.
В условиях модельного опыта инокуляция бактериями (субстрат стерилен, поэтому внесенные бактерии не конкурируют с таковыми в субстрате, а конкурируют только с бактериями на семенах) оказывает существенное воздействие на массу стеблей как огурца, так и капусты. При увеличении азотфиксирующей способности на корнях огурца наблюдается увеличение массы стебля (большой коэффициент корреляции — r = 0,9), в то же время масса стебля капусты лучше коррелирует с азотфиксирующей активностью на живых растениях после 20 дней выращивания (r = 0,72). Наличие подобной корреляции указывает на стимулирование роста растений путем улучшения азотного питания.
В модельном опыте инокуляция следующими изолятами оказывает большое влияние на массу стебля огурца: C43 — 150% от контроля, F12 — 168, С22 — 179, С7 — 180, С19 — 186% от контроля; на массу стебля капусты: J26 — 113% от контроля, E17 — 146, С19 — 165, С22 — 167, F12 — 177% от контроля. При этом стимулирующий эффект заметен визуально. По степени влияния на массу стебля огурца особенно отмечены изоляты, выделенные из ризопланы водяного шпината (за исключением F12).
Определение выделенных культур. В результате из 227 чистых культур ассоциативных азот-фиксирующих бактерий, выделенных из ризопла-ны тропических овощных культур I. aquatica и B. integrifolia, нами было отобрано семь штаммов, имеющих наиболее высокую нитрогеназную активность как на питательных средах, так и в ассоциации с растениями, а также оказывающих стимулирующее действие на культурные растения в модельных опытах. Определено классификационное положение данных организмов по морфологическим и физиолого-биохимическим особенностям (таблица).
Все штаммы показали способность к образованию 3-кетолактозы при росте на лактозе, что характерно исключительно для A. tumefaciens и A. radiobacter [7]. Отнесение штамма к одному из этих видов осуществляется исключительно по признаку фитопатогенности, в остальном они иден-
Морфология и физиолого-биохимические особенности изолятов, выделенных из ризопланы тропических овощных культур
Особенность изолятов Ipomoea aquatica Brasica integrifolia
С43 C22 С7 C19 E17 F12 J26
Форма колонии на среде DAS круглая с валиком по краю, выпуклая и гладкая, непигмен-тированная концентрическая, выпуклая и гладкая, непигмен-тированная круглая с валиком по краю, выпуклая и гладкая, непигмен-тированная концентрическая, выпуклая и гладкая, непигмен-тированная концентрическая, выпуклая и гладкая, непигмен-тированная круглая с валиком по краю, выпуклая и гладкая, непигмен-тированная круглая с валиком по краю, выпуклая и гладкая, непигмен-тированная
Окраска по Грамму — — — — — — —
Форма клеток прямые палочки прямые палочки прямые палочки прямые палочки прямые палочки прямые палочки прямые палочки
Диаметр клеток, мкм 0,6 — 1,0 0,6 — 1,0 0,6 — 1,0 0,6 — 1,0 0,6 — 1,0 0,6 — 1,0 0,6 — 1,0
Подвижность в жидкой среде + + + + + + +
Образование кислоты из глюкозы + + + + + + +
Оксидаза + + + + + + +
Рост при 35° + + + + + + +
Образование 3-кето-лактозы + + + + + + +
Подкисление среды при использовании этанола +
Ростактивирующий эффект + + + + + + +
Фиксация азота + + + + + + +
Образование клубеньков в овощных культурах
тичны [10, 15]. Однако, как уже отмечалось, данный признак связан с наличием или отсутствием Тьплазмиды и поэтому не может рассматриваться как видоопределяющий. Поскольку ДНК типовых штаммов А. tumefaciens и А. radiobacter проявляют высокую степень гомологии, их можно отнести к одному виду [12, 15].
Для тех же семи штаммов определено филогенетическое положение на основании секвенирова-ния гена 168 рРНК. Показано, что все они принадлежат сем. Rhizobiaceae филогенетической группы Alphaproteobacteria. При этом наиболее близкой (99,8% гомологий) к полученным последовательностям оказалась таковая типового штамма представителя р. Agrobacterium — A. tumefaciens. Для определения точной филогенетической позиции исследуемых штаммов внутри сем. Rhizobiaceae и его родства с A. tumefaciens использовали доступные из базы данных GenBank последовательности представителей других родов этого семейства. Последовательности гена 168 рРНК изучаемых штаммов практически идентичны (99,8% гомологий) последовательности типового штамма A. tu-mefaciens (рисунок).
Таким образом, выделенные штаммы являются представителями вида A. tumefaciens, хорошо известного как фитопатоген. Наши исследования нитрогеназной активности не противоречат литературным данным [14], согласно которым A. tume-faciens в свободном состоянии растет на безазотной среде, восстанавливает ацетилен до этилена и включает в состав биомассы 15N2. Последовательности ДНК структурных генов, ответственных за нитрогеназу (nifH, nifD и nifK), высококонсервативны [17], поэтому можно ожидать, что ассоциативные штаммы A. tumefaciens будут обладать теми же особенностями фиксации азота, что и патогенные. Известно, что этот вид обладает молибден-зависимой нитрогеназой, функционирование которой подавляется в аэробных условиях и в присутствии NH+. Некоторые аспекты работы нитро-геназы у А. tumefaciens напоминают другие хорошо изученные диазотрофные бактерии, такие, как Klebsiella pneumonia [16].
Надо полагать, что при отсутствии или повреждении Ti-плазмиды A. tumefaciens не может вызывать заражение растений, но, как свидетельствуют наши данные, оказывает положительное воздей-
72
Agrobacterium sp. EP R 18 16S ribosom... Agrobacterium tumefaciens gi|57703055... Rhizobium sp. gi|586830625|gb|KF90613... Agrobacterium tumefaciens gi|60878614... Agrobacterium tumefaciens gi|58586563... Agrobacterium tumefaciens gi|57703055(2) -1
-Rhizobium sp. gi|586830630|gb|KF90614...
Agrobacterium tumefaciens gi|58586563... Uncultured Agrobacterium sp. clone Ag... Agrobacterium tumefaciens strain SM14... Agrobacterium tumefaciens strain R9-7... Agrobacterium sp. gi|657710113|gb|KJ6... Agrobacterium tumefaciens strain SWFU(2) Agrobacterium tumefaciens strain D254... Agrobacterium tumefaciens strain SWFU... Agrobacterium sp. gi|570554466|gb|KF7... 6
Филогенетические дендрограммы, построенные на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРНК видов бактерий, способных к процессу фиксации молекулярного азота. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 1 нуклеотидной замене на каждые 10 нуклеотидов; цифры — достоверность ветвления, установленная с помощью «bootstrap» — анализа 1000 альтернативных деревьев; а — штамм, выделенный из ризопланы разнолистной капусты (F12);
б — штамм, выделенный из ризопланы водяного шпината (C43)
ствие на растения в ассоциации с ней, превосходя по степени этого влияния все другие бактерии ризопланы исследованных тропических овощных культур. Помимо снабжения растений азотом и синтеза ростактивирующих веществ, можно ожидать, что данные штаммы конкурируют с патогенными за одни и те же сайты связывания, защищая таким образом растение от болезнетворных агентов.
Выводы
Впервые из ризопланы овощных культур Ipo-moea aquatica и Brassica integrifolia (Вьетнам) выделен ряд ассоциативных бактерий, обладающих нитрогеназной и ростактивирующей активностью. Исследование филогенетического положения выделенных культур, проведенное на основании сек-венирования гена 16S рРНК, показало, что наиболее активные из них принадлежат семейству Rhi-
zobiacea филогенетической группы Alpharoteobac-teria. Последовательности гена 168 рРНК изучаемых культур оказались практически идентичными (99,8% гомологий) последовательности типового штамма Agrobacterium tumefaciens.
Филогенетические особенности и физиолого-биохимические тесты, в частности образование 3-кетолактозы, дают нам основание утверждать, что изученные штаммы относятся к A. tumefaciens.
Таким образом, экологическое взаимодействие A. tumefaciens с тропическими овощными культурами строится на основе мутуализма, и в ризосфере этих растений он является наиболее активным азотфиксатором и продуцентом ростактивирующих веществ. Выделенные нами штаммы могут быть использованы для создания бактериальных препаратов, стимулирующих рост других культурных растений.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. Киев, 1964.
2. Емцев В.Т. Ассоциативный симбиоз почвенных диазотрофных бактерий и овощных культур // Почвоведение. 1994. № 4.
3. Завалин А.А., Чистотин М.Ф., Кожемяков А.П. Эффективность инокуляции зерновых культур Agroba-
сterium radiobacter в зависимости от азотного удобрения, почвенных и метеорологических условий // Агрохимия. 2001. № 2.
4. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии. М., 1991.
5. Манучарова Н.А. Гидролитические прокариот-ные комплексы наземных экосистем. М., 2014.
6. Манучарова Н.А., Власенко А.Н., Турова Т.П. и др. Термофильный хитинолитический микробный комплекс бурой пустынно-степной почвы // Микробиология. 2008. № 5.
7. Методы общей бактериологии. Т. 3 / Под ред. Ф.Герхардта и др. М., 1984.
8. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др. Практикум по микробиологии. М., 2005.
9. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная генетика агро-систем будущего. СПб., 2009.
10. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П. и др. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. Т. 1. М., 1997.
11. El-Fiki F., Giles K.L. Agrobacterium tumefaciens in agriculture and research // Int. Rev. Cytol. 1981. Vol. 13 (Suppl.). P. 47—58.
12. Heumann W. Rhizobium genetics // Biology of inorganic nitrogen and sulphur / Ed. by H. Bothe, A. Trebst. N.Y., 1981. P. 87—102.
13. Jordan D.C. Rhizobiaceae // Bergey's manual of systematic bacteriology / Ed. by N.R. Krieg, J.G. Holt. Vol. I. Baltimore, 1984. P. 234—256.
14. Kanvinde L., Sastry G.R.K. Agrobacterium tumefaciens is a diazotrophic bacterium // Appl. and Environ. microbiol. 1990. Vol. 56, N 7. P. 2087—2092.
15. Rhizobiaceae: Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями / Под ред. Г. Спайн-ка, А. Кондороши, П. Хукаса. СПб., 2002.
16. Robert G.P., Brill W.J. Genetics and regulation of nitrogen fixation //Ann. Rev. Microbiol. 1981. Vol. 35. P. 207—235.
17. Ruvkun G.B., Ausubel F.M. Interspecies homology of nitrogenase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 191—195.
18. Smith E.F., Townsend C.O. A plant tumor of bacterial origin // Science. 1907. Vol. 25. P. 671—673.
19. Wood D.W., Setubal J.C., Kaul R. et al. The genome of the natural genetic engineer Agrobacterium tumefaciens C58 // Science. 2001. Vol.294. P. 2317—2323.
Поступила в редакцию 19.12.2014
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
AS ASSOCIATIVE NITROGEN-FIXING BACTERIA
Phung Thi My (Vietnam), N.A. Manucharova, A.L. Stepanov,
L.A. Pozdnyakov, O.V. Selitskaya, V.T. Emtsev
From root surface of vegetable plants, growing on North Vietnam soils, 227 pure bacterial cultures were isolated on nitrogen-free media. All the cultures have showed nitrogen-fixing ability and offer positive effect on a plant growth in provided model experiments, while none of them have cause root nodule or tumor formation. Basing on the gene sequencing of 16S rRNA, our determination of phylogenic position of the most active isolated strains have revealed their affiliation with family Rhizobiaceae of Alpharoteobacteria phylum, and that they are most closer with type strain of Agrobacterium genus — A. tumefaciens. Physiology and morphology features are also indicate the affiliation of these organisms with A. tumefaciens. Thus, our isolated strain of this plant pathogen bacterium appears as associative diazotrophs who moreover offer positive effect on a growth of cultural plants.
Key words: nitrogen-fixing bacteria, associative bacteria, Ipomoea aquatica, Brasica in-tegrifolia, growth-stimulating substance, nitrogenase activity, ability for stimulating of plant growth, Agrobacterium tumefaciens.
Сведения об авторах
Фунг Тхи Ми, аспирант каф. микробиологии и иммунологии РГАУ—МСХА имени К.А. Тимирязева. E-mail: phungthimy87@gmail.com. Манучарова Наталья Александровна, докт. биол. наук, доцент. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495) 939-34-05; e-mail: manucharova@mail.ru. Степанов Алексей Львович, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495) 939-34-05; e-mail: Stepanov_aleksey@mail.ru. Поздняков Лев Анатольевич, канд. биол. наук, инженер каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495) 939-34-05; e-mail: APL-223@mail.ru. Селицкая Ольга Валентиновна, канд. биол. наук, доцент, зав. каф. микробиологии и иммунологии РГАУ—МСХА имени К.А. Тимирязева. E-mail: selitskayaolga@gmail.com. Емцев Всеволод Тихонович, докт. биол. наук, профессор каф. микробиологии и иммунологии РГАУ—МСХА имени К.А. Тимирязева. E-mail: selitskayaolga@gmail.com.
