CC BY
100
УДК 579.262
Романова О.С.1, Гоголева Н.Е.2, Немцева Н.В.3, Плотников А.О.3
1 Оренбургский государственный университет 2 Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН 3 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН E-mail: [email protected]
ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И СВОЙСТВА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ БАКТЕРИЙ, ОБРАЗУЮЩИХ АССОЦИАЦИИ С ПРОСТЕЙШИМИ
Из водоемов Оренбургской области выделено 7 культур простейших, из них бактериологическим методом получено 18 штаммов бактерий-ассоциантов. Численность бактерий-ассоци-антов составила от 50 до 10000 КОЕ/мл. Отобранные штаммы были представлены грамположи-тельными (61%) и грамотрицательными бактериями (39%). Методом секвенирования гена 16Б рРНК определено филогенетическое положение выделенных бактерий, которые относились к филумам Рг^еоЬа^ема, АсйпоЬа^епа и Р^тю^еэ. Среди выделенных бактерий установлено широкое распространение каталазной активности, антилизоцимной активности и способности образовывать биопленки.
Ключевые слова: простейшие, бактерии-ассоцианты, каталазная активность, антилизоцим-ная активность, биопленки.
Свободноживущие простейшие - обязательный компонент почвенных и водных экосистем, где они достигают большого разнообразия и численности. Несмотря на то, что бактериотрофные простейшие широко распространены в водных экосистемах [1] и часто выступают в роли фактора, лимитирующего численность бактерий [2], целый ряд бактериальных видов способны длительно сохраняться в ассоциациях с простейшими [3]. Важнейшим практическим аспектом пер-систенции бактерий в сообществах с простейшими является резервуарное значение последних для сохранения в природе патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. В обзоре [3] показано, что в клетках свободноживущих амеб персис-тирует как минимум 46 таксонов различных бактерий, 30 из которых относятся к протеобактери-ям, из них более половины могут вызывать заболевания у человека. В работе [4] установлена способность уже 70 видов бактерий сохраняться внутри клеток свободноживущих амеб.
Установлено, что бактерии используют различные стратегии для выживания и размножения в ассоциациях с простейшими. Первая стратегия направлена на сохранение и развитие внеклеточной части бактериальной популяции, использующей разные способы уклонения от фагоцитоза простейшими: формирование нитевидных и удлиненных морфотипов, образование биопленок, переход в некультивируемые и покоящиеся формы, синтез и выделение протистоцидных токсинов [5]. Вторая стратегия основана на включении разных механизмов, защищающих фагоцитированные простейшими внутриклеточно локализованные бактериальные клетки от киллинга лизосомальными ферментами и радикалами: об-
разование капсулы, предотвращение фагосомаль-но-лизосомального слияния, инактивация лити-ческих ферментов и кислородных радикалов, «ускользание» из фагосомы в цитоплазму и др. [3], [6].
Несмотря на крайнее разнообразие протис-тов, неизвестно, насколько выражено таксономическое разнообразие бактерий, в ассоциациях с протистами разных таксонов. Единственные представители протистов, хорошо изученные в этом плане - голые лобозные амебы, в первую очередь акантамебы [4], тогда как другие группы протистов, в частности жгутиконосцев и инфузорий изучались эпизодически. Отсутствует надежная методика, позволяющая четко дифференцировать внутриклеточных бактерий-ассоциантов от внеклеточной части популяции. Неизвестно, каково разнообразие функциональных свойств, обеспечивающих выживание и размножение протеобактерий в водных экосистемах, с учетом стратегии персистенции вида (внеклеточные или внутриклеточные механизмы). В связи с вышеизложенным, целью данной работы стала разработка методики выделения бакте-рий-ассоциантов простейших, а также характеристика филогенетического разнообразия и функциональных свойств бактерий в ассоциациях со свободноживущими простейшими.
Материалы и методы исследования
Материалом для работы послужили микроорганизмы - бактерии и простейшие, выделенные из природных водоемов Оренбургской области. Из водоемов были обследованы река Тузлукколь (Беляевский район, Оренбургская область) - левосторонний приток реки Урал, воды которого смешиваются с родниковой водой высокой соле-
Романова О.С. и др.
Видовое разнообразие и свойства культивируемых..
ности в урочище Тузлукколь; и Ириклинское водохранилище, расположенное в Гайском районе Оренбургской области, и представляющее собой крупнейший пресный водоем данного региона.
Выделение бактерий производилось из накопительных культур простейших. Чистые культуры бактерий получали бактериологическим методом с использованием элективных сред. Идентификация бактерий проводилась по культуральным, морфологическим (окраска по Граму, тест с КОН), биохимическим (оксидаза, каталаза, окисление/ферментация глюкозы, ферментация других углеводов, рост изолятов на средах Эндо, Flo и Columbia agar) и генетическим признакам (клонирование и секвениро-вание гена 16S рРНК).
ДНК бактерий выделяли с использованием набора лабораторных реагентов PureGene (Gentra). Система праймеров для типирования микроорганизмов (табл. 1) была разработана на основе последовательностей гена 16S рРНК и 16S-23S межгенного спейсера [7].
Для сравнительного анализа полученных последовательностей гена 16S с известными сиквенсами, депонированными в GenBank, применяли пакет компьютерных программ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
У бактерий - ассоциантов простейших определяли каталазную активность количественным методами [8]. Антилизоцимную активность микроорганизмов определяли чашечным методом [9]. Количественную оценку способности микроорганизмов формировать биоплёнки проводили фотометрическим методом в 96-лу-ночных планшетах для иммуноферментного анализа [10]. Количественным выражением степени образования биопленок служили значения оптической плотности, измеряемые на фотометре ELx808 (BioTek, США).
Результаты и обсуждение
В результате исследования разработана методика разделения внутриклеточных бактерий - ассоциантов от внеклеточной части популяции с применением антибиотиков.
Методика включает в себя несколько этапов:
1) отбор планктонной пробы;
2) выделение чистой культуры простейших одного морфовида путём прямого выделения клеток микропипеткой под малым увеличением микроскопа (ув. в 200 раз) или методом серийных разведений в жидкой среде (среда Пра-та для пресноводных культур или среда Шмаль-ца-Прата для солоноватоводных простейших).
Таблица 1. Последовательности праймеров, используемых для типирования микроорганизмов.
Название праймера Последовательность
1 Univ16SF1 GGCTCAGATTGAACGCTGGC
2 Univ16SF2 CTAC GGGAGGC AGC AGTGG
3 Univ16SR3 GTCATCCCCACCTTCCTCC
4 Univ16SF4 CTGGGGTG A AGTC GT A AC A AGG
5 Univ16SR4 CCTTGTTACGACTTCACCCCAG
6 Univ23SR1 CTCGGTTGATTTCTTTTCCTC
3) Подкормка выделенной чистой культуры простейших бактериями Pseudomonas fluorescens, убитыми кипячением.
4) Инкубация 2-5 суток с целью накопления численности простейших.
5) Обработка культур простейших антибиотиками в течение 24 ч - цефотаксим (концентрация в среде - 100 мкг/мл) и гентамицин (концентрация в среде - 50 мкг/мл). Сочетание антибиотиков в указанных концентрациях было подобрано на основании следующих критериев: сохранение жизнеспособности протистов; чувствительность бактериальных культур во всех изученных планктонных пробах, включая солёные; отсутствие действия на процесс репликации ДНК; сохранение структуры и свойств в водном минеральном растворе в течение периода инкубации.
6) Отмывка от антибиотиков путем трехкратного центрифугирования при 1500-3000 об/ мин со сменой среды на стерильную. После последнего центрифугирования супернатант осторожно удаляют, чтобы в пробирке осталось около 0,5 мл концентрированной культуры проти-стов.
7) Высев 0,1 мл концентрированной культуры простейших на Columbia agar. В процессе испытаний данная среда показала преимущества перед средами Эндо, Плоскирева, 1,5% мясо-пептонный агар, поскольку на ней высевается существенно больше разных таксонов бактерий, включая актинобактерии, альфа-, бета- и гам-мапротеобактерии. На 1,5% мясо-пептонном агаре преимущественно вырастают гаммапро-теобактерии, а на средах Эндо, Плоскирева -вибрионы и энтеробактерии, тогда как остальные таксоны регистрируются эпизодически.
Характеристика филогенетического разнообразия бактерий в ассоциациях со свободно-живущими простейшими
Из двух участков Ириклинского водохранилища выделены две чистые культуры амебоид-
Естественные науки
ных простейших Vanella sp., из которых в результате высева на среду "Columbia agar" получены 8 культур бактерий. 4 штамма относились к фи-луму Actinobacteria (Microbacterium oxydans, Microbacterium sp., Leucobacter chromiireducens, Micrococcus luteus) и 4 - к филуму Proteobacteria (Acidovorax sp., Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas mendocina). Численность бактерий в культурах простейших, выделенных из водохранилища (после обработки антибиотиками) составила 200-3250 КОЕ/мл культуры.
Из пяти участков реки Тузлукколь выделено 3 чистых культуры жгутиковых простейших (Percolomonas cosmopolitus, Flagellata sp., Cafeteria roenbergensis) и 2 чистых культуры инфузорий (Cyclidium sp., Colpoda sp.). В клетках жгутиконосцев и инфузорий методом высева на питательной среде "Columbia agar" выделено 10 культур бактерий. 4 штамма относились к филуму Actinobacteria (Kocuria rosea, Kocuria sp., Microbacterium sp., Leucobacter chromiire-ducens), 5 - к филуму Proteobacteria (Halomonas venusta, Halomonas pacilica, Pseudomonas pseu-doalcaligenes, Raoultella sp.) и 1 - к филуму Firmi-cutes (Staphylococcus epidermidis). Численность бактерий в культурах простейших, выделенных из р. Тузлукколь (после обработки антибиотиками) составила 50-10000 КОЕ/мл культуры.
Несмотря на небольшой объём полученных данных, обращает на себя внимание, что филогенетическое разнообразие бактерий, персисти-рующих в клетках простейших, достаточно высоко. Наиболее частыми таксонами в культурах простейших являются актинобактерии и про-теобактерии, причем среди последних лидирует класс Gammaproteobacteria (Pseudomonas, Halomonas, Raoultella). Эпизодически встреча-
0,002-0,39 2,26-4,3 >4,3 усл.ед
Рисунок 1. Распределение штаммов в зависимости от выраженности каталазной активности среди бактерий - ассоциантов простейших реки Тузлукколь
ются фирмикуты (Staphylococcus epidermidis).
Встречаемость прокариотных таксонов в зависимости от типа водной экосистемы характеризуется разным набором родов и видов. В клетках простейших соленых водоемов не обнаружены представители энтеробактерий за исключением единственного штамма Raoultella sp., но выявлены протеобактерии родов Halomonas и Pseudomonas. Актинобактерии представлены родами Leucobacter, Microbacterium, Kocuria. В экосистеме водохранилища в культурах простейших отмечено разнообразие родов актинобактерий Microbacterium, Leucobacter, Micrococcus, и гам-мапротеобактерий Acidovorax, Agrobacterium, Pseudomonas. Роды Microbacterium, Leucobacter, Pseudomonas встречались как в пресных, так и в соленых местообитаниях.
Характеристика функциональных свойств бактерий в ассоциациях со свободноживущими простейшими
Распространенность каталазной активности среди исследуемых изолятов составила 100%. Среди бактерий - ассоциантов простейших реки Тузлукколь доминировали бактериальные штаммы со значениями каталазной активности от 0,002 до 0,39 усл.ед. (рис. 1).
В Ириклинском водохранилище доминировали штаммы со значениями каталазной активности от 2,12 до 2,7 усл.ед., второе место по численности занимали штаммы со значениями признака до 3,9 усл. ед. (рис. 2). Доля штаммов с более низкими значениями (> 0,28 усл. ед.) была незначительна.
Способность микроорганизмов инактиви-ровать лизоцим - антилизоцимная активность была определена у всех исследуемых изолятов.
Распространенность антилизоцимной активности среди бактерий, выделенных из про-
60
я
5
S 40 Г
о
0
ё 20 ее
1 ю
о
>0Д8 2,12-2,7 <3,9 усл.ед.
Рисунок 2. Распределение штаммов в зависимости
от выраженности каталазной активности среди бактерий - ассоциантов простейших Ириклинского водохранилища
Романова О.С. и др.
Видовое разнообразие и свойства культивируемых...
тозойно-бактериальных ассоциаций составила 100%. Выраженность АЛА была незначительной, в пределах от 1 до 2 мкг/мл и различалась в исследуемых группах бактерий.
По результатам фотометрической оценки способности образования биопленок наиболее активными были грамположительные бактериальные штаммы филума АсИпоЬайепа, о чем свидетельствуют средние значения оптической плотности 00630 (более 0,14 ед. ОП). Менее интенсивно формировали биопленки штаммы, принадлежащие филуму Рго1еоЬас1епа (менее 0,14 ед. ОП). У филума Ркшю^еБ, а именно -единственного штамма Б. ер1ёегш1ё18, была отмечена слабая способность к образованию биопленок, равная 0,026 ед. ОП.
Таким образом, можно сделать следующие выводы:
1. Разработана эффективная методика разделения внутриклеточных бактерий - ассоци-антов от внеклеточной части популяции с применением антибиотиков.
2. Филогенетическое разнообразие бактерий, персистирующих в клетках простейших, достаточно высоко. Наиболее частыми таксонами в культурах простейших являются акти-нобактерии и протеобактерии.
3. Среди бактерий, выделенных из прото-зойно-бактериальных ассоциаций, широко распространены каталазная активность, антили-зоцимная активность и биопленкообразование, что отражает комплексную стратегию персис-тенции изученных видов бактерий в сообществах с простейшими (сочетание внеклеточных и внутриклеточных механизмов персистенции).
01.10.2014
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 14-04-01796, программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Живая природа: современное состояние и проблемы развития" проект № 12-П-4-1039, гранта Оренбургской области в сфере научной и научно-технической деятельности (соглашение №38 от 30.06.2014)
Список литературы:
1. Porter K. G., Sherr E. B., Sherr B. F., Pace M., Sanders R. W. Protozoa in planktonic food webs // Journal of Protozooloogy. -1985. - V. 32. - P. 409-415.
2. PernthalerJ. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications (review) // Nature reviews. Microbiology.
- V. 3. - P. 537- 546.
3. Greub G., Raoult D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae // Clinical Microbiology Reviews. - 2004. - V. 17(2).
- P. 413-433.
4. Thomas V., Loret J.-F., Jousset M., Greub G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant // Environmental Microbiology. - 2008. - V. 10(10). - P. 2728-2745.
5. Corno G., Jurgens K. Structural and functional patterns of bacterial communities in response to protist predation along an experimental productivity gradient // Environmental Microbiology. - 2008. - V. 10(10). - P. 2857-2871.
6. Snelling W. J., Moore J. E., McKenna J. P., Lecky D. M., Dooley J. S. G. Bacterial-protozoa interactions; an update on the role these phenomena play towards human illness (review) // Microbes and Infection. - 2006. - V. 8. - P. 578-587.
7. Kryuchkova Y. V., Burygin G. L., Gogoleva N. E., Gogolev Y. V., Chernyshova M. P., Makarov O. E., Fedorov E. E., Turkovskaya O. V. Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7 // Microbiological Research. - 2014. - V. 169. - P. 99-105.
8. Бухарин О. В., Черкасов С. В., Сгибнев А. В., Забирова Т. М., Иванов Ю. Б. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 Р // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2000.
- Т. 130. - № 7. - С. 80-82.
9. Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я., Малышкин А. Н., Немцева Н. В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1984. - № 2. - С. 27-28.
10. O'Toole G. F., Kaplan H. B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Annual Review of Microbiology. - 2000.
- V. 54 - С. 49-79.
Сведения об авторах:
Романова Оксана Сергеевна, студентка Оренбургского государственного университета,
e-mail: [email protected]
Гоголева Наталья Евгеньевна, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН, кандидат биологических наук,
e-mail: [email protected] Немцева Наталия Вячеславовна, заведующая лабораторией водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, доктор медицинских наук, профессор,
e-mail: [email protected] Плотников Андрей Олегович, заведующий центром коллективного пользования научным оборудованием "Персистенция микроорганизмов" Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, кандидат медицинских наук, доцент, 03.00.07, e-mail: [email protected] 460000 г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел.: (3532) 775417
