CC BY
71. Р. Адамс. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир, 1983. 264 с.
2. С.М. Адуева, Р.Я. Подчерняева. Биотехнологические методы культивирования клеток // Актуал. пробл. вирусол.: тез. докл. науч. конф. п. Гвардейский, 1994. Ч. 1. С. 11-12.
3. Л.А. Алиева, Г.Н. Завьялова, А.Ф. Бондаренко и др. Использование безсывороточной среды и среды с сывороткой, образованной полиэтилен-гликолем для культивирования клеток ВНК-21 // Актуал. пробл. вет. вирусол.: тез. докл. науч. конф. Владимир, 1983. С. 6-7.
4. А.Н. Децина, Т.П. Прошкова, Л.Д. Мартынец, М.А. Андреева. Повышение ростстимулирую-щей активности сыворотки КРС, обработанной ПЭГ // Культивирование клеток животных и человека: тез. докл. 3 Всесоюз. совещания, г. Пущи-но. М., 1990. С. 21-22.
5. Л.П. Дьяконов, В.Ф. Глухов, А.А. Поздняков и др. Культура клеток и тканей животных: учебно -метод. пособие. Ставрополь, 1980. Ч. 1. 111 с.
6. Под ред. Л.П. Дьяконова, В.И. Ситькова. Животная клетка в культуре (Методы и применение в био-
тура
технологии). М.: Компания Спутник, 2000. 400 с.
7. Т.А. Костина, О.П. Аверихин, И.Ф. Радеева, М.Ю.
Максимова. Сыворотки крови различных животных для культивирования линий клеток и вирусов. Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток // Тез. докл. Всесоюз. конф. Новосибирск, 1991. С. 26
8. В.Т. Ночевный. Оптимизация процессов производства культур клеток и вирусов в суспензии переживающих тканей: дис. д-ра биол. наук в форме доклада. М., 1994. 49 с.
9. Методы культивирования клеток: сб. науч. тр. Л.: Наука, 1988. 296 с.
10. А.С. Пригода, А.И. Коренева, Е.Ю. Коновалова и др. Конструирование безсывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. 4. Культивирование в биореакторах перевиваемой линии клеток ВНК-21 на малосывороточных питательных средах // Биотехнология. 1991. № 5. С. 55-58.
11. Под. ред. Р.Е. Спиерса, Дж. Б. Гриффитса; пер. с англ. Биотехнология клеток животных. Т. 1-2. М.: Агропромиздат, 1989. 822 с.
УДК 619:578.823.91:636.22/.28.001.8
Г.С. Скитович, Г.Н. Дороненкова, С.А. Чупин, Л.Б. Прохватилова
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ РОТАВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Введение
Ротавирусы являются наиболее распространенным этиологическим агентом острых гастроэнтеритов крупного рогатого скота (КРС). Ущерб, причиняемый рота-вирусами, слагается из отставания в росте и гибели животных. В силу высокой кон-тагиозности ущерб особенно ощутим в животноводческих хозяйствах промышленного типа. Результаты проведенных за последние годы исследований патологического материала на наличие кишечной инфекции свидетельствуют о широкой циркуляции ротавирусов в хозяйствах РФ [1, 2, 3]. Доказана широкая диссеминация ротави-русов КРС среди животных разных видов и наличие антител у грызунов (морских свинок, крыс, хомяков, мышей) [5].
Важным условием успешной борьбы с ротавирусной инфекцией является своевременная и правильная диагностика заболевания, для чего необходимы эффективные диагностические методы, в том числе иммуноферментный анализ (ИФА) [4]. Необходимым условием для разработки тест-систем на основе ИФА является получение соответствующих антигенов, обладающих высокой специфической активностью, что в свою очередь предполагает выделение изолятов в культуре клеток с дальней-
шим изучением их иммунобиологических свойств.
В ходе данной работы было проведено выделение двух изолятов ротавируса КРС в культуре клеток и изучены их биологические свойства.
Материалы и методы
Выделение вируса. Из фекалий готовили 10% суспензию в растворе Хенкса с последующим осветлением путем центрифугирования. Надосадочную жидкость пропускали через фильтры "Миллипор" (США) с диаметром пор 0,22 мкм. К фильтрату добавляли пенициллин (1000 ед/см3), стрептомицин (1000 мкг/см3) и гентамицин (200 мкг/см3). Фильтрат фекалий, предварительно обработанный раствором трипсина в конечной концентрации 10 мкг/см3, вносили во флаконы с монослоем клеток. После адсорбции вируса в течение 60 мин при температуре 37° С монослой клеток двукратно отмывали раствором Хен-кса и добавляли поддерживающую среду Игла без сыворотки, содержащую трипсин в концентрации 1 мкг/см3. Зараженную культуру клеток ежедневно просматривали в световом микроскопе и по истечении 7 дней замораживали. Последующие пассажи проводили подобным образом.
Титрование вируса. Определение ин-
фекционности выделенных изолятов проводили титрованием по цитопатическому действию в монослое клеток Магк-145 и выражали в ^ТЦД50/см3. Результаты учитывали согласно методу Рида и Менча.
Гипериммунные сыворотки. Гипериммунные сыворотки на выделенные изоля-ты получали путем 3-кратной гипериммунизации концентрированным и очищенным антигеном лабораторных животных: кроликов и морских свинок. Полученные гипериммунные сыворотки инактивиро-вали прогреванием при 56° С в течение 30 мин.
ИФА. Определение противовирусных антител в сыворотках крови кроликов и морских свинок осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа.
РН. Реакцию нейтрализации проводили в перевиваемой культуре клеток Магк-145, используя серийные двукратные разведения сыворотки и постоянную дозу вируса (200 ТЦД5о/см3).
Результаты и обсуждение
Ранее нами было выявлено, что в РФ преобладают ротавирусы КРС G-типов: G6 - 47%, G8 - 30%, G10 - 19% и Р-ти-пов: Р5 - 48%, Р11 - 33%. Реже встречаются ротавирусы Р-типов: Р1 и Р7. Для разработки диагностических наборов необходимо иметь лабораторные штаммы, чьи характеристики соответствуют полевым изолятам, циркулирующим в хозяйствах. Ранее нами был выделен в культуре клеток МДВК штамм ротавируса КРС "ТЕ87',' относящийся к серотипам G8Р7
При анализе патологического материала, поступившего на исследование из хозяйств Владимирской области, где отмечены вспышки заболеваний с диарейным синдромом, были выявлены два изоля-та ротавируса КРС, обозначенных Собин-ка/10/99/В и Юрьев/03/00 и охарактеризованных в ПЦР типами G10Р11 и G6Р5 соответственно.
Чтобы расширить спектр изолятов, используемых при лабораторной диагностике, решено было выделить данные изоля-ты в культуре клеток.
Были использованы следующие моно-слойные перевиваемые культуры клеток: почки эмбриона коровы (МДВК), почки макаки-резус (Магк-145), гонады козы (КГ-91), почки кролика (РК15). После проведения трех последовательных пассажей выявили, что для изолята Юрьев/03/00 более чувствительной культурой клеток является МДВК, а для изолята Собинка/10/99/В - Магк-145.
Всего на данных культурах с каждым изолятом было проведено по 10 пассажей. Первые два пассажа характеризовались отсутствием цитопатического действия. К третьему пассажу оба изолята вызывали видимое, однако нехарактерное для рота-вирусов, ЦПД в культуре клеток. Для доказательства специфичности ЦПД РНК, выделенная из культуральной жидкости, была исследована методом электрофореза геномных сегментов в агарозном геле. На электрофореграмме была видна картина разделения геномных сегментов, характерная для ротавируса.
Время проявления ЦПД уменьшалось от третьего до восьмого пассажа со 168 до 96 ч и оставалось неизменным в девятом и десятом пассажах. На уровне 7-го пассажа изоляты Собинка/10/99/В и Юрьев/03/00 вызывали характерные цитопатические изменения в более 50% клеток, проявляющиеся в виде склеивания клеток, отслоения клеток и разрушения монослоя, и накапливались в титрах более 4,5-5,0 ^ ТЦД50/см3 и 5,0-5,3 ^ ТЦД50/см3 соответственно. Конечная картина ЦПД выражалась в гибели клеток, отслоении их в культуральную жидкость и наличии на поверхности роста отдельных тяжей и фрагментов. Инфекционная активность изолятов Собинка/10/99/ В и Юрьев/03/00 на уровне 10 пассажа составила 6,25 ^ ТЦД50/см3 и 6,0 ^ ТЦД50/см3 соответственно.
Антигенная активность выделенных изолятов в сэндвич-варианте ИФА с использованием сывороток крови, полученных на штамм ТЕ87, составила 1:40 для изо-лята Собинка/10/99/В и 1:100 для изолята Юрьев/03/00.
На данные изоляты были получены гипериммунные сыворотки на лабораторных животных (кролики и морские свинки).
Титр антител в сыворотках крови кроликов в реакции нейтрализации для изоля-тов Собинка/10/99/В и Юрьев/03/00 составил 11,6 1о^ и 8,3 1о^ в ИФА - 13,5 1о^ и 10,4 1о^ соответственно. Титр сывороток крови морских свинок в реакции нейтрализации для изолятов Собинка/10/99/В и Юрьев/03/00 составил 11,4 и 8,8 1о^ соответственно, в ИФА - 12,1 и 10,0 соответственно.
Выделенные изоляты ротавируса КРС в настоящее время используются в качестве положительного контроля в ПЦР на ротавирусы КРС различных серотипов. Предполагается использование данных изолятов в качестве производственных для получения антигенов и специфических сы-
вороток с целью разработки тест-систем на основе ИФА.
Выводы
Таким образом, в культуре клеток были выделены два изолята ротавируса КРС - Юрьев/03/00 и Собинка/10/99/В. Данные изоляты характеризуются высокими титрами инфекционной активности, вызывая характерное для ротавирусов ЦПД в культуре клеток, а также стабильно сохраняют
уровень репродуктивной активности при пассировании. Полученные на данные изо-ляты гипериммунные сыворотки характеризуются высокими титрами вируснейтра-лизующей активности в реакции нейтрализации и антигенной активности в ИФА. По результатам исследований выделенные изоляты ротавируса КРС можно рекомендовать в качестве производственных штаммов.
РЕЗЮМЕ
В перевиваемой культуре клеток из патологического материала выделено 2 полевых изолята ротавируса крупного рогатого скота (КРС). Изучены культуральные свойства изолятов. Получены гипериммунные сыворотки на лабораторных животных.
ABSTRACT
Two field isolates of bovine rotavirus were isolated in a continuous cell culture from pathological samples. Cultural characteristics of the isolates were studied. Hyperimmune sera were obtained from laboratory animals.
Литература
1. Г.Н. Дороненкова, С. А. Чупин, А.М. Тимина и др. Выделение ротавируса крупного рогатого скота в культуре клеток // Биотехнология. 2004. № 4. С. 47-52.
2. Л.Г. Рамишвили, ГГ. Рухадзе, Е.А. Непоклонов и др. Серийное пассирование ротавируса крупного рогатого скота в гетерологичной культуре клеток // Вопр. вирусол. 1991. № 6. С. 521-523.
3. В.Г Скибицкий, О.Г Проценко. Серологическое обследование крупного рогатого скота на наличие про-тиворотавирусных антител // Профилактика и меры
борьбы с болезнями молодняка с.-х. животных: тез. докл. науч.-произв. конф. Минск, 1990. С. 10.
4. С. А. Чупин, Г.Н. Дороненкова, В.А. Кудрявцев и др. Выявление ротавирусов крупного рогатого скота группы А и дифференциация их основных G-серотипов с помощью ПЦР // Актуал. про-бл. патол. свиней, крупного и мелкого рогатого скота: матер. конф. молодых ученых. Владимир, 2000. С. 184-190.
5. A.Z. Kapikian, R.M. Chanock. Rotaviruses // Fields Virology 3rd - ed. Philadelphia. 1996. P. 1657-1708.
