CC BY
171
УДК 541.127:542.943.
ВЫДЕЛЕНИЕ ХИТОЗАНА ИЗ ПРИРОДНОГО СЫРЬЯ К.Ю. Муринов, Ю.Б. Монаков*
Начиная с 60-х годов интерес к природным биополимерам - хитину и его производному - хитозану, резко возрос и не уменьшается до сих пор. Данные о хитине, как о полисахариде, обеспечивающим опорные и скелетные функции, дополнились новыми, позволяющими рассматривать синтез хитина организмами как один из основных, влияющий на рост и морфогенез грибов и дрожжей. Образование этого полисахарида связано с координацией литических процессов, с регуляцией осмотического давления и степени гидрофобности клеток [1-3]. Поверхностный покров насекомых, ракообразных, клеточные стенки грибов, некоторые водоросли и дрожжи содержат в качестве опорного компонента микрофибриллы хитина. Таким образом, природные источники хитина (хи-тозана) многообразны и широко распространены в природе [4, 5]. В связи с этим, было интересно выделить хитозан из различных природных источников (насекомые, грибы, мицеллиальные грибы) и сравнить некоторые характеристики полученного продукта с хитозаном, выделенным из краба Дальневосточного. В качестве объектов для выделения хитозана были выбраны поверхностный покров пчел, вешонка обыкновенная, мицеллиальный гриб Aspergillus niger.
Экспериментальная часть. Обработка образцов поверхностного покрова пчел, грибов растворителями
Навеску порошка при постоянном перемешивании обрабатывали 3-х кратным избытком (по объему) органических растворителей и 2-х кратным избытком неорганических реагентов для более полного удаления примесей. Обработанный порошок отделяли от растворителя на центрифуге «УЛК - 1» (3000 об/мин) и промывали в случае использования неорганических реагентов водой, а органических - ацетоном (20-ти кратный избыток). Полученные образцы сушили при комнатной температуре до постоянного веса.
Поверхностный покров пчел - высушенный и перемолотый - порошок темно - коричневого цвета, влажность - 6%.
Мицелий гриба Aspergillus niger:
а) образец М-1 - высушенный и перемолотый порошок темно-бежевого цвета (при спорообразовании).
б) образец М-2 - высушенный и перемолотый порошок светло - коричневого цвета (в начале спорообразования).
в) образец М-3 - высушенный и перемолотый образец цвета глины, с зеленоватым оттенком (при спорообразовании).
г) образец М-4 - высушенный и перемолотый по-
рошок серо - бежевого цвета (практически без спор).
Мицелий гриба Aspergillus niger (образец М-3? -выращивали на экстракте пшеничной муки, который готовили следующим образом: 15%-ную мучную смесь в воде кипятили и фильтровали. На фильтрате выращивали мицелий при температуре 27 °С в течение 6-ти суток.
Шляпочный гриб Pleurotus ostreatus (вешонка обыкновенная? - высушенный, перемолотый порошок светло - желтого цвета.
Посевной мицелий шляпочного гриба Pleurotus ostreatus - выращивали на пропаренной соломе при температуре 18 -25 0С, в течение 24 суток.
Обсуждение результатов. Выделение хитозана из мицелия гриба Aspergillus niger
Были исследованы четыре образца мицелия, которые отличались по условиям культивирования и составу питательной среды. Элементный анализ образцов исходного мицелия различен (табл. 1). Наибольшее содержание азота (5 %) наблюдается в мицелии, выращенном на экстракте из пшеничной муки с добавлением фосфата аммония (образец М-3). Содержание азота в мицелии, культивированном на среде Чапека, колеблется от 2,5 до 3,7 % (образцы М-1, М-2, М-4).
Для удаления карбонатов металлов образец мицелия (М-1) обрабатывали водным раствором 2н HCl в течение 20 мин при 50 оС с последующей отмывкой водой до значения рН = 7.
Основные изменения в ИК-спектрах исходного образца после обработки соляной кислотой наблюдаются в области 1550 см-1. Интенсивность полосы поглощения при 1550 см-1, ответственной за деформационные колебания аминогрупп, увеличилась. Выход образца на данной стадии составил ~ 63 %. Далее мицелий обрабатывали 2 %-ным водным раствором щелочи с добавлением этанола (1:1) и детергента в течение 1 часа при Т = 98 оС. Полученный продукт (хитин-глюкановый комплекс) имел светло-коричневый цвет и содержал 4,0 % азота. Выход его составил 6,9 % от исходной биомассы мицелия гриба Aspergillus niger.
Образец М-2 был обработан водными растворами соляной кислоты и гидроксида натрия с добавлением детергента и этанола, как и в случае образца М-1.
Для дальнейшей очистки и дезацетилирования хитина был проведен щелочной гидролиз полученного образца в стеклянной ампуле в атмосфере аргона при 120 оС в течение 1 часа. Далее проводили последова-
*Муринов Константин Юрьевич - kw.ii.. н.с. института органической химии УНЦ РАН.
Монаков Юрий Борисович - академик РАН, заведующий кафедрой физической химии и химической экологии БГУ, зав. лабораторией стереорегулярных полимеров ИОХ УНЦ РАН.
тельное отмывание осадка этанолом понижающейся концентрации: 96, 70, 50, 30 % и затем водой.
В ИК-спектрах исходного мицелия и полученных образцов после обработки наблюдали полосу поглощения в области 3300 см-1, связанную с колебаниями гидроксильных групп - ОН. В области 1750 см-1 в ИК - спектре исходного образца наблюдали полосу поглощения малой интенсивности карбонильной группы, интенсивность которой повышалась после обработки водными растворами соляной кислоты и гидро-ксида натрия. Интенсивность полосы поглощения при 1550 см-1, относящейся к деформационным колебаниям аминогрупп, несколько увеличилась после обработки водным раствором соляной кислоты и значительно, после обработки раствором концентрированной щелочи. Вероятно, это связано с протеканием процесса дезацетилирования полисахарида. В области 1150 см-1 в ИК - спектре исходного образца зафиксирована полоса поглощения, соответствующая связи -С-О-С-. После обработки образца мицелия М-2 наблюдалось повышение интенсивности полосы при 1080 см-1 по отношению к интенсивности полосы поглощения при 1040 см-1. Такое же соотношение ин-тенсивностей полос поглощения в области 1000 -1100 см-1 наблюдается и в ИК-спектре хитозана из панциря краба Дальневосточного. Полученный образец имел светло-коричневый цвет. Его выход составил 4 % от массы исходного сырья.
Для выделения хитозана из кислотонерастворимо-го глюкана образцы мицелия М-2 и М-4, прошедшие все этапы очистки, были экстрагированы 0,1н водным раствором HCl. Содержание хитозана в хитозан-глюкановом комплексе из М-2 составило 5 %, а из М-4 (по методике, включающей более жесткие условия дезацетилирования) - 10 %. Спектры ХТЗ-глюканового комплекса и хитозана из мицелия гриба Aspergillus niger практически совпадают за исключением полосы поглощения в области 1750 см-1, ответственной за поглощение карбонильной группы. ИК-спектры хитозана из образца мицелия М-4 и хитозана из панциря краба Дальневосточного имеют одни и те же характерные полосы поглощения (3400, 3000, 1750, 1650, 1500 - 1200, 1160, 1100, 1040 см-1).
Выделение хитозана из поверхностного покрова пчел
Для удаления водорастворимых примесей образец пчел с размером частиц < 0,315 мм при комнатной температуре обрабатывали дистиллированной водой 3 часа, 10 %-ным водным раствором HCl 8 часов, 5 %-ным водным раствором NaOH 4 часа; при температуре кипения 5 %-ным водным раствором NaOH 2 часа смесью этанол:бензол (1:1) 4 часа, 5 %-ным водным раствором пероксида водорода 2 часа при 40 °С. В таблице 2 указаны условия обработки, при которых достигается максимальная отмывка и выход образца:
Поверхностный покров пчел обрабатывали по методикам, использованным при выделении хитозана из мицелия гриба Aspergillius niger.
По данным элементного анализа (табл. 3) обработ-
ка образца 2н водным раствором соляной кислоты, 2 % водным раствором NaOH и концентрированной щелочью приводит к уменьшению содержания азота в продукте. Содержание азота в образце, после всех обработок, уменьшилось почти в 2 раза (с 11,4 до 6,2 %). Полученный продукт имел темно-коричневый цвет. Его выход составил 8,1 %.
Увеличение времени обработки поверхностного покрова пчел указанными реагентами значительно уменьшает выход продукта до 3,7 % от исходной массы. Элементный состав отличается от элементного состава продукта обработки поверхностного покрова пчел при небольших временах: снизилось содержание углерода и незначительно азота, и повысилось содержание кислорода и водорода. Продукт представлял светло-серый порошок.
Характерные полосы поглощения ИК - спектров образцов, полученных из поверхностного покрова пчел и хитозана из панциря краба Дальневосточного, совпадают и незначительно отличаются по интенсивности.
Выделение хитозан-глюканового комплекса из шляпочного гриба Pleurotus ostreatus
Как видно из данных элементного анализа, исходный образец шляпочного гриба Pleurotus ostreatus (вешонки обыкновенной) содержит много золы (табл. 3). Для ее удаления образец В-1 обрабатывали 2 н водным раствором соляной кислоты в течение 4 часов при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Дальнейшую обработку вели концентрированным водным раствором гидроксида натрия в течение 1 часа при 98 оС для дезацетилирования хитина. Элементный состав исходного образца шляпочного гриба Pleurotus Ostreatus близок к элементному составу ми-целиального гриба Aspergillius Niger, но отличается более высоким содержанием азота - 4,4 %. Обработка водным раствором соляной кислоты и концентрированным раствором гидроксида натрия привела к уменьшению содержания азота, углерода и водорода (табл. 3). Вероятно, это связано с небольшим содержанием хитина в исходном образце шляпочного гриба Pleurotus Ostreatus. Об этом свидетельствуют и данные ИК-спектроскопии. Интенсивность полосы поглощения в области 1660 см-1 значительно уменьшилась и отсутствует полоса поглощения в области 1590 см-1. В области 1000-1500 см-1 ИК-спектр полученного образца идентичен ИК-спектру хитозана из краба Дальневосточного. Как и в случае образцов мицелия и поверхностного покрова пчел, наибольшая потеря веса образца наблюдается после реакции дезацетилирования, которая проводилась в довольно жестких условиях. На данной стадии выход продукта составил 8,4 %. Выход хитозан-глюканового комплекса по отношению к исходной биомассе шляпочного гриба Pleurotus Ostreatus - 4,3 %.
Хитозан-глюкановый комплекс, выделенный из мицелия по сравнению с хитозаном из краба Дальневосточного, содержит в два раза меньше азота. Из поверхностного покрова пчел выделен хитозан-глюкановый комплекс, у которого содержание азота
довольно высокое , но ниже , чем должно быть в хито-зане. Полученный хитозан-глюкановый комплекс из шляпочного гриба, значительно отличается по элементному составу от хитозана. На основании элементного анализа и данных ИК-спектроскопии сделан вывод, что наиболее близкие по функциональному составу к хитозану из краба Дальневосточного образцы, выделенные из мицелия микроскопического гриба
и из поверхностного покрова пчел. На основании полученных результатов, можно заключить, что наиболее удобным сырьем для выделения хитозана является панцири краба Дальневосточного. Полученный хитозан-глюкановый комплекс может быть использован как объект для исследования биологических и физико - химических свойств.
Таблица 1.
Выделение хитин-глюканового и хитозан-глюканового комплексов из мицелия гриба Aspergillus niger
Образец Обработка Выход по этапам, % Общий выход, % Элементный состав
Раствори-тель Время Т,°С С, % Н, % N, % О , % Зола, %
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
М-1 Исходный образец — — — 6,9 45,2 (49,1) 6,4 (7,0) 3,1 (3,4) 37, 3 (40,5) 8,0 Следы
2н HCl 20 мин 50 63,1 50,1 7,5 4 ,1 38,4 Следы
2 % №ОН 1 час 98 11,0 51,8 7,8 4,0 36,4 Следы
М-2 Исходный образец — — — 4,0 44,8 (47,6) 6,4 (6,8) 2, 5 (2,7) 40,4 (42, 9) 5, 9 Следы
2н HCl 20 мин 50 84,9 50,1 7,1 2, 5 40,4 Следы
2 % №ОН 1 час 98 14,7 49,9 7,3 2, 3 40,6 Следы
20 % №ОН 1 час 110 -120 32,4 47,2 6,6 4,0 42,2 Следы
М-3 Исх. образец — — — 3,3 53,8 (55,0) 7,4 (7,6) 4, 5 (4,6) 32,2 (32, 9) 2,2 Следы
Н2О 1 час 98 60,2 56,5 8,2 3,2 32,1 Следы
1 % №ОН 2 % НС1; 3 % №ОН 30 мин 30 мин 30 мин 25 98 98 5,4 48,8 6,4 5,0 39, 8 Следы
М-4 Исх. образец — — — 3,9 45,7 (46,9) 6,4 (6,5) 3,7 (3,8) 41,7 (42, 8) 2, 5 Следы
2н НС1 4 часа 25 73,8 51,3 7 ,1 3, 9 37,6 Следы
50 % №ОН 5 часов 98 5,3 48,7 6, 9 4, 3 40,2 Следы
*) в скобках приведены данные элементного анализа в расчете на обеззоленный образец
Таблица 2.
Выходы об] разцов пчел после обработок различными растворителями.
Растворитель Время обработки, мин Выход, %
Вода (20 °С) 15 66
Вода (60 °С) 15 63
Гептан (60 °С) 60 72
Трипсин* (20 °С) 15 62
Ацетон (20 °С) 120 86
Изопропанол (20 °С) 60 84
Толуол (20 °С) 120 90
*0 , 02 % водный раствор
Таблица 3.
Выделение хитин-глюканового и хитозан-глюканового комплексовиз наружного покрова пчел и из шляпочного гриба Pleuroteus Ostreatus.____
Образец Обработка Выход по этапам, % Общий выход, % Элементный состав
Растворитель Время T,°C С, % Н, % N, % О , % Зола, %
П-1 Исх. образец — — — 8,1 53,7 7,4 10, 9 23,2 5,0
2н HCl 20 мин 50 46,0 55,7 8,1 10, 9 25, 3 Следы
2 % №ОН 1 час 98 29,0 50,6 6,5 9,0 33, 9 Следы
20 % №ОН 1 час 110 60,6 48,9 6,1 6,2 38, 8 Следы
П-2 2н HCl 3 часа 50 53,2 3,7 47,8 6,2 10, 3 35, 8 Следы
2 % №ОН 2 часа 98 24,7 52,2 7,2 8, 5 32,1 Следы
20 % №ОН 6 часов 110120 28,1 45,9 6,7 5, 9 41, 5 Следы
В-1 Исх. образец — — — 4,3 43,5 6,5 4,0 36, 5 9, 5
2н На 4 часа 25 51,3 43,2 5,9 3,0 47, 9 Следы
50 % №ОН 1 час 98 8,3 43,6 6 ,1 1, 9 48,4 Следы
Литература
1. Chitin and chitosan: Sources , Chemistry, Biochemistry, Physical Properties and Application. Ed. T. Anthonsen. - London. - N. - Y.: Elsevier Applied Science. - 1990. - 830 p.
2.Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования // Материалы 3 Всес. конф. - Москва, . - 1991. - М.: ВНИРО. - 1992. - 107 С.
3.Muzzarelli R.A.A. Chitin. - Oxford, New - York : Pergamon Press. - 1970. - 309 p.
4.Chitin and chitosan. Proceeding of the 2 Int. Conf. on Chitin and Chitosan. - July 12-14, 1982. - Sapporo, Japan. - Ed. Hirano S., Tokura S,. - 1982. - 254 P.
5.Chitin in Nature and Technology. Proceeding of the 3 Int. Conf. - Ed. Muzarelli R. - New - York. - London: Plenum Press. - 1985. - 583 p.
Поступила в редакцию 25.05. 02. г.
