CC BY
9Экология и системы жизнеобеспечения
УДК 579.66 А.В. Гарабаджиу1, А.В. Анкудинова2, М.И. Янкевич3
ВЫДЕЛЕНИЕ АССОЦИАЦИЙ
БАКТЕРИЙ-ДЕСТРУКТОРОВ
СТОЙКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ
ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ
ИЗ ПОЧВ ПОЛИГОНА
ПРОМЫШЛЕННЫХ
ОТХОДОВ
Введение
Одной из острых экологических проблем современности является загрязнение экосистем полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ). Эти токсиканты попадают в воздушную среду в результате неполного сгорания самых разнообразных топлив и ряда органических веществ, адсорбируются на частицах пыли, сажи и, оседая, концентрируются в почвенном слое. Особо загрязненными являются земли скопления крупных промышленных предприятий, а также городские территории [1, 2].
ПАУ относятся к стойким органическим загрязнениям (СОЗ), они токсичны, обладают потенциальным мутагенным, канцерогенным и тератогенным действием, представляют собой опасность для живых организмов и экосистем в целом [3, 4]. ПАУ плохо поддаются воздействию почвенной микрофлоры и накапливаются в существенных количествах, превышающих предельно допустимые концентрации (по 3,4-бенз(а)пирену) более, чем в 5 раз.
Основным методом очистки и восстановления загрязненных ПАУ почв является биоремедиация, основанная на применении микроорганизмов-деструкторов, способных использовать этот экотоксикант в качестве единственного источника углерода и энергии.
Культуры бактерий-деструкторов ПАУ выделяют из различных источников: почв и водоемов городских территорий, зон скопления промышленных предприятий, вблизи разработок месторождений каменного угля, нефти и газа, в местах техногенных катастроф, связанных с раз-
Санкт- П етербургски й государственн ый технологический институт (технический университет) 199013, Санкт-Петербург, Московский пр., д. 26.
Из образцов почв и воды полигона токсичных отходов «Красный Бор» (Ленинградская область) выделено 5 стабильных сообществ микроорганизмов. Установлено, что бактериальные ассоциации способны к деструкции фенантрена, одного из полициклических ароматических углеводородов. Наиболее активной в отношении деструкции фенантрена оказалась ассоциация V. Степень деструкции фенантрена за 7 суток составила 47 %, в то же время продукты деструкции этой ассоциацией фенантрена обладают наибольшей токсичностью.
Ключевые слова: ПАУ, фенантрен, бактериальные ассоциации, биодеструкторы, биотестирование.
ливами нефтепродуктов и пожарами [5]. В настоящее время актуален поиск новых штаммов микроорганизмов, которые были бы устойчивы к условиям очищаемых территорий и обеспечивали высокую степень деструкции токсикантов. На основе выделенных активных микроорганизмов-деструкторов разрабатываются биопрепараты и технологии, позволяющие проводить биоремедиацию почв. Биопрепараты могут состоять как из монокультуры, так и ассоциации микроорганизмов, считается, что наибольший эффект достигается применением сообщества микроорганизмов-деструкторов.
Целью исследований являлось выделение природных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ из техногенно загрязненных источников и изучение их способности к деструкции ПАУ.
Методики эксперимента
Ассоциации микроорганизмов-деструкторов ПАУ выделяли методом накопительных культур. Микроорганизмы культивировали в жидкой среде Раймонда [6] с добавлением фенантрена в качестве единственного источника углерода и энергии в количестве 0,1 % (мас.). Культивирование проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл в течение 7 суток в условиях аэрации на роторной качалке с частотой вращения 220 об/мин, при температуре 25 °С. Доля посевного материала составляла 10 % (об). Для получения стабильных сообществ произвели 4 последовательных пересева.
Титр гетеротрофных и ПАУ-деградирующих микроорганизмов в почве и воде определяли методом Коха
1 Гарабаджиу Александр Васильевич, д-р хим. наук. профессор, каф. микробиологического синтеза, проректор по научной работе, e-mail: gar-54@mail.ru
2 Анкудинова Анастасия Владимировна, канд. биолог. наук, инженер-биотехнолог ООО «НПП «ЭкоБиоТехнологии», 197183, Санкт-Петербург, наб. Черной речки д.10, e-mail: ankoodinova@inbox.ru
3 Янкевич Марина Ивановна, д-р биолог. наук, директор по развитию ООО «НПК «Илма Эко», 190020, г. Санкт-Петербург, наб. Обводного канала д.150 , корп. 335, e-mail: iankevich@yandex.ru
Дата поступления -7 ноября 2013 года
[7] высевом на плотную пептон-дрожжевую среду с глюкозой [8] и плотную минеральную среду Раймонда с 0,1 %-ным содержанием фенантрена, соответственно.
Степень деструкции фенантрена в жидкой среде определяли флуорометрическим методом на анализаторе «Флюорат-02» по стандартной методике [9].
Остаточную токсичность продуктов окисления фенантрена в жидкой среде ассоциациями микроорганизмов-деструкторов ПАУ оценивали по всхожести семян и длине побегов и корней кресс-салата (в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной культуральной жидкостью ассоциации) [10], по состоянию листецов ряски (выцветание, замедленные темпы развития), помещенных в анализируемую жидкость [11].
Результаты и обсуждение
Выделение природных сообществ. С начала 70-х годов прошлого века в Ленинградской области действует полигон по захоронению токсичных отходов «Красный бор». Поэтому для поиска высоко активных диких штаммов был выбран именно этот объект, на который в течение почти полувека свозили и размещали в картах самые разнообразные токсичные отходы Северо-Запада страны. Из почв внутренней стороны обваловки действующей карты полигона и воды этой карты были отобраны образцы для исследования. Методом накопительных культур получены 5 ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ. 4 сообщества микроорганизмов выделили из почвы, одно - из воды. После 4 последовательных пересевов в жидкую минеральную среду Раймонда с фенантреном в качестве единственного источника углерода и энергии получены стабильные природные сообщества микроорганизмов-деструкторов фенантрена.
Для определения соотношения гетеротрофных микроорганизмов и биодеструкторов ПАУ, методом Коха определили титр микроорганизмов на минеральной среде Раймонда с фенантреном, а также общее количество ге-теротрофов в пробах на «богатой» пептон-дрожжевой среде с глюкозой.
Как видно из таблицы 1, в почвенном образце 1 все микроорганизмы являлись ПАУ-деструкторами, их численность составляла 107 КОЕ/г., в других образцах число гетеротрофных микроорганизмов превосходило количество ПАУ-деструкторов на порядок (за исключением 4 образца, отобранного у уреза воды карты, в котором численность гетеротрофных микроорганизмов была на 4 порядка выше).
Таблица 1. Титр гетеротрофов и микроорганизмов-деструкторов ПАУ в
Ассоциации микроорганизмов-деструкторов ПАУ
Рисунок 1. Степень деструкции фенантрена ассоциациями микроорганизмов-деструкторов ПАУ после 7 суток культивирования в жидкой минеральной среде Раймонда
Степень деструкции фенантрена ассоциацией V составила 47 %. Также наблюдалась высокая степень деградации фенантрена ассоциациями микроорганизмов II, III. За 100 % принимали количество фенантрена в аналогичном опыте без внесения биомассы исследуемых микроорганизмов.
Токсичность продуктов окисления фенантрена. Любая экобиотехнология призвана уменьшить действие загрязняющих веществ и продуктов их деградации на природные объекты.
Изучено влияние продуктов деструкции выделенных ассоциаций микроорганизмов на различные биологические тест-объекты. Для оценки остаточной токсичности культу-ральных жидкостей, полученных при 7 суточной ферментации выделенных ассоциаций на минеральной среде с фенантре-ном, проведено биотестирование с использованием тест-объектов.
Анализ данных, полученных в эксперименте с кресс-салатом в качестве тест-объекта, показал, что ассоциации (за исключением ассоциации V) без разведения не оказывали выраженного ингибирующего действия на всхожесть семян (рисунок 2). Однако наблюдалось ингибирование длины побегов кресс-салата, обработанного культуральными жидкостями ассоциаций без разведения (рисунок 3). Длины стеблей в вариантах, обработанных культуральными жидкостями в разведении в 2, 4, 8 раз, были близки к контрольному значению, а в некоторых случаях даже превосходила длину побегов растений контроля (при обработке семян культуральными жидкостями ассоциаций I, II, III, исключение составляет вариант с культуральной жидкостью ассоциации II, разбавленной в 4 раза, параметр не отличался от контрольного).
№ п.п Обра- Ассоциа- Титр гетеротрофных микро- Титр микроорганизмо
зец ция организмов, КОЕ/г в-деструкторов ПАУ, КОЕ/г
1 Почва I (1,6±0,2)х10/ (1,0±0,1)х10/
2 Почва II (1,0±0,1)х108 (1,3±0,1)х10/
3 Почва III (1,0±0,1)х10/ (1,0±0,1)х106
4 Почва IV (1,2±0,1)х101и (1,6±0,2)х106
5 Вода V (2,6±0,3)х10/ (1,3±0,1)х106
контроль (вода)
100
Деструкция фенантрена в жидкой среде ассоциациями микроорганизмов. Деструкцию фенантрена в присутствии выделенных ассоциаций микроорганизмов оценивали по уменьшению его концентрации за 7 суток культивирования в минеральной среде. Начальная концентрация фенантрена в среде составляла 0,1 % (мас.). Как видно из гистограммы на рисунке 1, исследованные ассоциации отличаются по эффективности потребления фе-нантрена.
v
□ Контроль (вода)
и Минеральная среда
а Ассоциация
□ Ассоциация II
□ Ассоциация ill
■ Ассоциация IV
■ Ассоциация V
Без разведения
Рисунок 2. Всхожесть семян кресс-салата, обработанных культураль-ными жидкостями ассоциаций, выращенных на среде с фенантреном. Примечание * - достоверные различия параметров по сравнению с параметрами контроля (р = 95 %)
40
35
2 30
5
2 о 25
'О
о с 20
«
X s 1S
ä
10
S
0
i LI
•i
Контроль 0J (вода)
: Минеральная L среде
[^Ассоциация I ШПАссоциация II [_ Ассоциаций III ■ Ассоциация IV □ Ассоциаций V
Таблица 2. Оценка токсического действия культуральных жидкостей ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ на ряску
(Мо^а аггЬка)
без разведения в 2 раза в 4 раза е 8 раз
Проба
Рисунок 3. Влияние культуральных жидкостей ассоциаций на длину побега кресс-салата. Примечание * - достоверные различия параметров по сравнению с параметрами контроля (р = 95 %)
В ходе эксперимента было отмечено заметное ингибирование длины корневой системы в опытных образцах, а также в вариантах, в которых для обработки семян использовали минеральную среду (рисунок 4).
г.-| Контроль Ш (вода) "Ч!3
Минеральная
среда
| Ассоциация Е Ассоциация II | | Ассоциация ||| Щ Ассоциация IV НАссоциация V
без разведения в 2 раза в 4 раза в 8 раз
Рисунок 4. Влияние культуральных жидкостей ассоциаций на длину корня кресс-салата. Примечание * - достоверные различия параметров по сравнению с параметрами контроля (р = 95 %)
В чашках с самым большим разведением длина корня приближалась к длине корня растений контроля (вода). Таким образом, можно предположить, что на развитие корней кресс-салата оказал влияние минеральный фон, а не продукты деструкции.
Таким образом, в результате культивирования микроорганизмов на минеральной среде с фенантреном образуются продукты метаболизма, которые в ряде случаев оказывают ингибирующее действие на развитие тест-растения. Поскольку состав ассоциаций отличается входящими в них микроорганизмами, то при создании биопрепарата для очистки и восстановления загрязненных экосистем, необходимо выбрать микроорганизмы и ассоциации, при деградации ПАУ которыми не образуются токсические вещества. При деструкции фенантрена реализуются различные механизмы метаболизма субстрата, образующиеся окисленные формы, обладая большей растворимостью в воде, могут оказывать сильное биологически активное действие на тест-объект. Культуральная жидкость самой активной в отношении деструкции фенантрена ассоциации V оказала самый значительный токсический эффект на кресс-салат.
В опытах с ряской уже через двое суток началось почкование во всех ячейках планшета, кроме тех, которые содержали культуральные жидкости ассоциаций II, III, IV,
V без разведения, причем наблюдалось выцветание ли-стецов ряски в культуральных жидкостях ассоциаций III,
V (таблица 2). В пробе с ассоциацией V даже при разведении культуральной жидкости в 2 раза не происходило размножения растения. Итак, наиболее токсичными для Wolffia arrhiza оказались продукты метаболизма ассоциации V, нетоксичными - ассоциации I.
Контроль (культивационная _вода)_
Разведение культуральных жидкостей ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПAУ
без в 2 в 4 в 8 в 16
разведения раза раза раз раз
I 3 3 3 3 3
+ + + + +
II 3 3 3 3 3
- + + + +
III 1 2 3 3 3
- + + + +
IV 3 3 3 3 3
- + + + +
V 1 2 3 3 3
- - + + +
Контроль (минеральная среда) 3 + 3 + 3 + 3 + 3 +
Примечание учет проводили по бальной системе, где: «1» - обесцвеченные листецы, «2» - ослабленная окраска, «3» - ярко-зеленые; «+» - наличие почкования, «-» - отсутствие почкования.
Оценивая результаты проведенных биотестов, следует отметить, что для кресс-салата наиболее токсичны метаболиты культуральных жидкостей V и IV, для ряски - V и III.
Выводы
Одним из перспективных источников выделения и изучения микроорганизмов-деструкторов СОЗ являются объекты, подвергнутые сильному техногенному воздействию.
Выделены микробные ассоциации, являющиеся эффективными деструкторами фенантрена. Определено, что минимальным токсичным эффектом на тест-объекты обладает ассоциация II, перспективная для создания биопрепарата-деструктора полициклических ароматических углеводородов.
Литература
1 Пурмаль A-П. Aнтропогенная токсикация планеты, часть 2 // Соросовский образовательный журн.. 1998. № 9. С.46-51.
2. Капелькина Л.П., Самуленков ДЛ. Бенз(а)пирен в почвах мегаполиса и проблемы нормирования его содержания // Труды IV Междунар. научно-практ. конф. «Aвтотранспорт: от экологической политики до повседневной практики». Санкт-Петербург, 2G-21 марта 2008. СПб.: изд-во МAHЭБ, 2GG8. С. 56-58.
3. Fernandez P., Grifoü M, Solanas A.M., Bayona J.M., Abaiges J. Bioassay-directed chemical analysis of geno-toxic components in coastal sediments // Environ. Sci. Tech-nol. 1992. Vol. 26. P. 817-829.
4. Shuttleworth K.L., Cerniglia C.E. Environmental aspects of PAH degradation // Appl. Biochem. Biotechnol. 1995. Vol. 54. P. 291-3G2.
5. Пунтус И.Ф., Филонов A.Е., Кошелева И..A. Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов // Микробиология. 1997. Т. 66. № 2. С. 269-272.
6. Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons // Develop. Indust. Microbiol. 1961. Vol. 2. № 1. P. 23-32.
7. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова, М.: МГУ, 1995. 222 с.
8. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. / Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Академия, 2005. 608 с.
9. ПНД Ф 16. 1. 21-98. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах флюо-риметрическим методом на анализаторе жидкости «Флю-орат-02». Госкомитет РФ по охране окружающей среды. М. 1998.
10. Петухов В.Н., Фомченков В.М., Чугунов В.А., Холоденко В.П. Биотестирование почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с помощью растений // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. № 6. С. 652-655.
11. Цаценко Л.В., Филипчук О.Д. Биологическая индикация и генетический скрининг загрязнения компонентов агроценоза // С.-х. биология. 1997. № 5. С. 33-37.
