CC BY
53
Известия Тульского государственного университета Серия Естественные науки 2008. Выпуск 1. С. 211-220
ХИМИЯ
V. IК 594.3
A.A. Овчинникова, A.A. Ветрова, А.Е. Филонов, А.М. Воронин
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, Пущино,
Путинский государственный университет, Пущино
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ШТАММОВ-ДЕСТРУКТОРОВ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ: КОЛОНИЗАЦИЯ КОРНЕЙ И ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ ОТ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФЕНАНТРЕНА
Аннотация. Исследовано взаимодействие штаммов-деструкторов поли-циклических ароматических углеводородов. Изучено их влияние на растения в условиях загрязнения модельной системы фенантреном.
Введение
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) представляют собой группу опасных и распространенных почвенных загрязнителей. Многие ПАУ устойчивы к деградации, для них характерны токсические, мутагенные или канцерогенные свойства [1]. Поэтому они могут представлять значительную угрозу для окружающей среды и здоровья человека. Деструкция ПАУ может проходить вследствие абиотических процессов, однако, основную роль в деградации этих соединений играют микробные популяции [2]. Хорошо известна способность микроорганизмов, относящихся к разнообразным таксономическим группам, разлагать различные химические соединения. Среди огромного царства Eubacteria представители родов Pseudomonas nBurkholderia имеют широкий спектр углеродного питания и
Работа выполнена при финансовой поддержке, РФФИ проект № 06-04-96-318_р; МНТЦ (грант 2366); гос. контракта Тема РНП 2.1.1.7789; РНП 2.1.1.9290; С1ШГ 1ШВ2-010001-РЦ-05; БОЕ-ГРР-СБВЛ^грант № КВО-10118).
© Овчинникова A.A., Ветрова A.A., Филонов А.Е., Воронин А.М., 2008
способны разлагать большое количество различных ксенобиотиков том числе и ПАУ. Деградация поллютантов существенно повышается при совместном использовании микроорганизмов-деструкторов и растений, а именно в процессе фиторемедиации. Основные достоинства фиторемедиации состоят в возможности рекультивации больших территорий, относительно низкой стоимости по сравнению с другими технологиями, высокой эффективности и слабом негативном воздействии на окружающую среду [3,4]. Ранее были выделены и охарактеризованы различные бактерии-деструкторы ПАУ, однако взаимодействие этих микроорганизмов в ризосфере растений не изучалось.
Целью данной работы было изучение взаимодействия штаммов-деструкторов ПАУ и его влияния на растения в условиях загрязнения модельной системы фенантреном.
Методика
1. Бактериальные штаммы
Таблица 1
Бактериальные штаммы, использованные в работе
Штамм Характеристика Источник получения
Pseudomonas putida
BS3701(pBS1141, pBS1142) Xah+ Sal+ 2MeNah+ Gnt+ Phe+ Hna+ ЛБП, ИБФМ РАН*
Burkholderia sp.
BS3702(pBS1143) Xah+ Sal+ Phe+ Ant+ Hna- ЛБП, ИБФМ РАН
ХаЬ+ — способность к росту на нафталине; 2Ме.\аЬ — 2-метилнафталин, Gut- гентизат, РЬе - фенантрен, Ant- антрацен, Нпа - 1-гидрокси-2-нафтойная кислота.
*ЛБП — лаборатория биологии плазмид; ИБФМ РАН- институт биохимии и физиологии микроорганизмов российской академии наук.
2. Питательные среды и добавки
Бактерии выращивали на полноценных питательных средах L В-a rape и LB-бульоне [5], содержащих (в г/л): бакто-триптона (Difco)- 10,0; дрожжевого экстракта (Difco) - 5,0; NaCl - 10,0.
В качестве минимальной среды для бактерий использовали синтетическую среду Е [6] следующего состава (г,мл /л): К2НРО i -8,71; 5М р-р NH4CI-1; 0,1М р-р Ха2SO 1 - 1; 62 мМ р-р \IgCl2 - 1; 1 мМ р-р СаС12 - 1; 0,005 мМ р-р (ХН i)tjMo7()21 IH2O - 1; микроэлементы - 1. Состав раствора микроэлементов в 10% НС1, (г/л): Z11O - 0,41; FeCl2 6Н20 - 5,4; M11CI2 4Н20 -2,00; СиС12 2Н20 - 0,17; СоС12 6Н20 - 0,48; Н3В03 - 0,06; pH 7,0.
Для получения агаризованных сред добавляли 20 г/л агара ( «Pronadisa» Испания).
Выращивание микроорганизмов на агаризованной минеральной среде с использованием нафталина и фенантрена в качестве единственного источника углерода и энергии проводили в парах этих веществ. Среду Кинга Б (КВ [7]) использовали для мониторинга штаммов.
3. Гнотобиотическая система для выращивания растении.
Для изучения влияния штаммов-деструкторов в ризосфере растений использовалась гнотобиотическая система [8].
Выращивание растений проводили в закрытых пластиковых сосудах размером 77 мм х 77 мм х 97 мм (Magenta vessel, «Sigma») в 150 г песка при влажности 15%. Нафталин вносили в виде пудры до конечной концентрации 200 мкг/г песка и тщательно перемешивали. Фенантрен вносили в виде пудры в концентрации 500 мкг/г песка .
Для обеспечения минерального питания растений использовалась среда "Murashige and skoog basal sait» («Sigma»). Положительным контролем служили растения, выращенные без добавления нафталина и фенантрена и без инокуляции, отрицательным - с добавлением ПАУ и без инокуляции. Схемы экспериментов приведены на рис.1 и рис.2.
4. Бактеризация проростков
Семена горчицы белой (Sinapis alba) стерилизовали 10 % раствором гипохлорита натрия в течение 30 мин., затем промывали 4 раза стерильной водопроводной водой в течение 2 часов. Семена раскладывали на L- агар и инкубировали 18-20 ч при 2 1°С. для контроля стерильности семян.
В эксперименте JV» 1 стерильные проростки ипокул провал и суспензией штаммов, взятых с экспоненциальной фазы роста, (плотность 108 КОЕ / мл) в течение 15 мин. В эксперименте Л»2 суспензию микроорганизмов вносили непосредственно в песок вместе с минеральной средой, концентрация микроорганизмов составляла 1,5* 108 КОЕ/г песка
В один горшок высевали 20 проростков горчицы. Растения выращивали в следующем режиме: 12-часовой световой период и 12-часовой темновой период при температуре 20°С. Через 7 дней делали смывы с корней и ризосферы, и после стандартных серийных разведений высевали на LB-arap и среду Кинга Б для качественного и количественного анализа бактерий.
5. Определение содержания фенантрена в образцах
150г песка из модельной системы переносили в колбу и экстрагировали 100 мл метенола, в течение 16 часов при 25°С. Затем 200 мкл метанольного экстракта анализировали с помощью ВЭЖХ, используя хроматограф LKB-2150 (Швеция). Колонка С18, Nova Рак Waters, система 60% метанол - 40% вода, УФ детектор, рабочая длина волны 280 нм, скорость потока 1 мл/мин.
6. Схемы экспериментов
Рис. 1. Схема эксперимента № 1
Рис. 2. Схема эксперимента № 2
Результаты и их обсуждение
1. Изучение защитного эффекта штаммов-деструкторов ПАУ
Как видно из рис.З токсический эффект фенантрена проявлялся в подавлении роста побегов горчицы белой.
Рис. 3. Фитотоксический эффект фенантрена на побеги горчицы белой 1 — растения с внесением фенантрена, без микроорганиизмов 2 — растения без внесения фенантрена и микроорганизмов
В эксперименте №1 наилучший защитный эффект наблюдался в системе, содержащей оба штамма 3701 и 3702, а в эксперименте №2 - как в модельной системе, интродуцированной штаммом-деструктором Pseudomonas putida 3701 (pBS 1141, pBS1142), так и при совместном культи-BiipoB&mmPseudomonas putida 3701 (pBS 1141, pBS1142) и Burkholderia sp. BS3702(pBS1143) (рис.4).
Как в эксперименте №1, так и в эксперименте №2 в условиях системы, содержащей штамм Burkholderia sp. BS3702(pBS1143) длина побегов растения была ниже, чем в системе, содержащей штамм Pseudomonas putida 3701 (pBS1141, pBS1142) при совместном культивировании растений и обоих штаммов-деструкторов. Возможно, это связано с тем, что Burkholderia sp. BS3702(pBS1143) накапливает промежуточный метаболит, который токсичен для растений. А при совместном культивировании растений и двух деструкторов концентрация предполагаемого интермедиата снижается за счет потребления его Pseudomonas putida 3701 (pBS 1141, pBS1142), тем самым смягчая действие токсиканта.
Рис. 4. Длина побега в эксперименте №1 и №2. Стрелками показаны варианты с лучшим защитным эффектом
2. Биодеградация фенантрена
Как известно ПАУ, являются малорастворимыми загрязнителями, а, следовательно, малодоступными для микроорганизмов в качестве источника углерода и энергии.
Из табл. 2 видно, что деградация фенантрена в эксперименте №1 была незначительной. Возможно, это связано с характером интродукции микроорганизмов-деструкторов в модельную систему (проростки инокули-ровали суспензией штаммов, взятых с экспоненциальной фазы роста). В связи с этим микроорганизмы локализовались в основном на корнях и в ризосфере растений. Это объясняет защитный эффект без существенной деградации фенантрена. Фенантрен распределен в системе по всему объему, и видимо, процесс биоремедиации проходил в большей степени в зоне корней горчицы белой, тем самым, избавляя растения от токсического воздействия поллютанта.
В случае эксперимента № 2 (микроорганизмы вносились непосредственно в модельную почву) лучшим штаммом-деструктором фенантрена был штамм Pseudomonas putida BS3701(pBS1141,pBS114). В системе, интроду-цированной этим микроорганизмом, содержание поллютанта снизилось в 1,7 раза (табл.2).
Предполагалось, что деградация фенантрена при совместном культивировании двух штаммов-деструкторов будет идти лучше, однако процесс минерализации проходил хуже, чем в присутствии одного из деструкторов.
Таблица 2
Остаточная концентрация фенантрена в эксперименте Л» 1 и Л» 2
Модельные системы, содержащие: Остаточная концентрация фенантрена в эксперименте №1, мкг/мл Остаточная концентрация фенантрена в эксперименте №2, мкг/мл
фенантрен 0,4 ±0,02 0,11 ±0.01
фенантрен+растения 0,41±0,05 -
фенантрен+растения+В83701 0.37±0.03 0,24±0,01
фенантрен+растения+В83702 0,37±0,02 0,27±0,05
фенантрен+растения+В83701+В83702 0,39±0,01 0.3 1 ±0.05
3. Взаимодействие микроорганизмов-деструкторов в ризосфере и ризоплане растений
Исследования концентрации микроорганизмов на корнях горчицы белой и в ризосфере показали, что численность бактерий на корнях более чем на порядок превышала количество интродуцированных микроорганизмов в ризосфере через 7 дней культивирования (рис.5-8). Несомненно, это связано с корневой экссудацией растений. Экссудация питательных веществ корнями создает окружающую среду, обогащенную питательными веществами, в которой стимулируется микробная активность. Растительные экссудаты содержат такие важные компоненты, как сахара, органические кислоты и аминокислоты.
Как видно из данных диаграмм 5-8 практически во всех случаях концентрация В83701 была выше при совместном культивировании с В83702. чем в случае системы, содержащей только один В83701. Это также наводит на мысль о выделении интермедиатов одним штаммом, и использования их в качестве более доступного (чем фенантрен) источника углерода другим штаммом [1].
эксперимент №1
1.00Е+10 1.00Е+09 § 1.00Е+08
е
1.00Е+07
д 1.00Е+06 “ 1.00Е+05 1.00Е+04
г— ± гЩ гЕ- рЬ
±
■ 3701 □ 3702
о
со
+
о
N.
СО
+
к
0)
I—
о
го
о.
0)
Го о о* ?
0) т о.
!г
£
#
к
£
0)
о см
Го р О.
* ? аз т о.
!е
£
#
о:
а о о {5 & + % ¡5
о. со !е + £
#
Рис. 5. Численность микроорганизмов в ризосфере горчицы белой через 7 дней культивирования в эксперименте № 1
эксперимент №1
1.00Е+10 1,00Е+09 5 1,00Е+08 * 1.00Е+07 д 1.00Е+06 “ 1.00Е+05
1,00Е+04 4
гТт-
см
о
1^
со
+
о
1^
со
+
к
£
аз
н
о
го
о.
+
о;
£
аз
§ о а. £-± « а) о.
£
+
к
£
аз
о см го о
о-
±
аз
о.
£
£
■ 3701 □ 3702
+
к
см о 1^
со
а. + ± О аз г^-
о. со
аз
£
Рис. 6. Численность микроорганизмов в ризоплане горчицы белой через 7 дней культивирования культивирования в эксперименте № 1
Рис. 7. Численность микроорганизмов в ризосфере горчицы белой через 7 дней культивирования в эксперименте № 2
Рис. 8. Численность микроорганизмов в ризоплане горчицы белой через 7 дней культивирования в эксперименте № 2
Заключение
Таким образом, исследованные штаммы Pseudomonas puti.da3701 (pBSl 111. pBS1142) и Burkholderia sp. BS3702(pBS1143) являются хорошими колонизаторами корней, что влияет на защитный эффект корней растений от токсического действия фенантрена. Фенантрен является малолетучим ПАУ и основной токсический эффект он оказывает на корни. Микроорганизмы-деструкторы в случае малолетучих ксенобиотиков, таких как фенантрен, следует вносить в виде суспензии, распределяя по всему объему загрязненного участка. Для наиболее эффективной биодеградации ПАУ (фенантрена) и защиты растений необходимо использовать, либо один штамм-деструктор Pseudomonas putida 3701 (pBSl 1 11. pBSl 112). либо совместно применять оба деструктора, так как штамм Burkholderia sp. BS3702(pBSl 1 13) в процессе окисления фенантрена накапливает метаболит, токсичный для растений, что отрицательно сказывается на ростовых характеристиках горчицы белой.
Библиографический список
1. Kuiper Irene Rhizoremediation: a beneficial plant-microbe interaction / Irene Kuiper [etc.]. // Molecular plant-microbe interactions. -2004. -V. 17. -JV® 1. -P. 6-15.
2. Samanta S.K. Polycyclic aromatic hydrocarbons: environmental pollution and bioremediation / S.K. Samanta, O.V. Singh, R.K. Jain. // Trends Biotechnol. -2002. -V. 20. -JV® 6. -P. 243-248.
3. Назаров А. В. Потенциал использования микробно-растительного взаимодействия для биоремедиации / А.В.Назаров, С.А.Иларионов. // Биотехнология. -2005. -№ 5. (’.5162.
4. Elizabeth Pilon-Smits Phitoremediation / Pilon-Smits Elizabeth // Annu. Rev. Plant Biol. -2005. -V. 56. -P. 15-39
5. Миллер Даю. Эксперименты в молекулярной генетике / Дж. Миллер. - М.: Мир, 1976.
6. Evans С. G. Т. The continuous cultivation of microorganisms. Construction of a Chemo-stat / C.G.T. Evans, D. Herbert, D.B. Tempest. // Methods in Microbiology. -1970. -V. 2. -Pp.277-327
7. King O.E. Two simple media for demonstration of pyocyanin and fluorescin / O.E. King, W. Ward, D.E. Raney. // J. Lab. Clin. Methods. -1954. -V. 44. -№ 2. -P. 301-307.
8. Simons M. Gnotobiotic system for studying rhizosphere colonization by plant growth-promoting Pseudomonas bacteria / M. Simons [etc.]. // Mol. Plant-Microbe Interact. -1996. -V. 9. -№ 7. -P.600-607
E-mail: [email protected]
Поступило 08.02.2008
