CC BY
26
УДК 616.991.452:576.809.3.3
Е.В.Желудкова, А.А.Бывалов, В.П.Бондарев, В.И.Климов, А.В.Чернядьев, А.В.Ежов,
С.А.Швецов, Д.А.Мохов
ВЫБОР ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ ОСНОВ И СРЕД, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ПРОИЗВОДСТВЕ ВАКЦИНЫ ЧУМНОЙ ЖИВОЙ СУХОЙ
ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт МО РФ», Киров
Разработаны состав и метод получения тест-культуры для оценки качества питательных основ и сред в производстве вакцины чумной живой сухой со сроком годности не менее 6 мес. Тест-культура включает суспензию микробов К ре.\іі.\ вакцинного штамма ЕВ (50-109 м.к./мл), стабилизированную в защитной среде, содержащей сахарозу (2,5 %), глицерин (10 %), К2НР04 (0,12 %), КН2Р04 (0,08 %).
Ключевые слова: тест-культура, питательная среда, технология, чумная вакцина.
Специфическая профилактика чумы занимает одно из важных мест в системе противоэпидемических мероприятий в отношении этой особо опасной инфекции [4,9]. По мнению подавляющего большинства исследователей, наиболее эффективной для специфической профилактики чумы является производимая в России вакцина чумная живая сухая на основе штамма ЕВ для подкожного и ингаляционного применения (ВЧЖС) [5, 11].
Несмотря на то, что производство чумной вакцины в России осуществляется уже в течение шести десятилетий, до сих пор продолжаются научные исследования, направленные на совершенствование ее технологии и методов контроля [1, 6, 8].
В частности, возрастающие требования к качеству используемой вакцины вызывают настоятельную потребность в разработке и производстве доступных, качественных и стандартных питательных основ (ПО) и питательных сред (ПС), в том числе сухих, применение которых во многом определяет кондиционность готового препарата.
В технологии ВЧЖС используются плотные и жидкие ПС. Для приготовления плотных питательных сред (ППС) применяется ферментативный гидролизат мяса (ФГМ) крупного рогатого скота, а жидкие питательные среды (ЖПС) готовятся на основе ФГМ и соляно-кислотного деионизированного гидролизата казеина, на которых выращиваются субкультуры в бутылях и нативные культуры в реакторах. В последние годы отечественная биотехнология характеризуется изменениями рынка сырьевых ресурсов: снижением их качества, отсутствием постоянных поставщиков, производителей продукции, а следовательно, и информации об уровне организации производства. Все это резко повысило актуальность работ по совершенствованию способов оценки полноценности получаемых и разрабатываемых ПО и ПС, применяемых на разных стадиях приготовления вакцинных препаратов, в первую очередь, с помощью биотестов.
Результаты работы последних лет свидетельствуют о том, что обеспечение соответствия фиксируемых значений физико-химических показателей
ПО нормативным требованиям является необходимым, но отнюдь не достаточным условием нормального роста микроорганизмов и получения качественных культур. В соответствии с методическими рекомендациями Минздрава в комплексе показателей качества ПО и ПС, наряду с физико-химическими характеристиками, предлагается использовать и биологические показатели [7]. Однако данный документ содержит лишь самые общие подходы к оценке ростовых свойств ПС без акцента на вакцинное производство.
Для оценки качества ПС по биологическим показателям применяются различные методические подходы. Их выбор определяется в том числе и предназначением ПС. Одним из существенных условий корректности применения того или иного биологического метода оценки качества ПС является использование стандартизованной тест-культуры со стабильными свойствами. К сожалению, нормативная документация, регламентирующая производство и контроль ряда вакцинных препаратов, в том числе и ВЧЖС, не содержит требований к культурам тест-штаммов, с помощью которых можно достоверно оценивать ростовые свойства ПС.
В связи с вышеизложенным актуальными представляются исследования, направленные на разработку надежных способов оценки качества ПО и ПС, используемых в производстве ВЧЖС.
Целью настоящей работы является обоснование состава и способа приготовления тест-культуры, предназначенной для определения кондиционности ПС, применяемых в технологии ВЧЖС.
Материалы и методы
Объектом исследования была культура У. рв8118 вакцинного штамма ЕВ линии НИИЭГ, хранящегося в Федеральной Коллекции стандартизованных микроорганизмов ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». В работе использовали чумной диагностический бактериофаг М.П.Покровской и чумной бактериофаг Л-413 С В.С.Лариной. Питательные среды (жидкие и плотные) готовили на основе ФГМ. Ха-
рактеристики ПС соответствовали требованиям нормативной документации.
При пассировании in vivo вакцинного штамма чумного микроба использовали беспородных морских свинок обоего пола массой 250-300 г.
Микроскопические исследования выполняли по общепринятым методам. Изучение морфологических особенностей культур проводили с использованием циторефрактометрического определения относительного содержания неповрежденных и делящихся клеток, визуального анализа, а также измерения линейных размеров клеток с помощью автоматического анализатора изображения «MAGISCAN» фирмы JOYCE-LOEBL (Великобритания).
Культивирование микробов осуществляли на плотной и в жидкой ПС на основе ФГМ (перевар Хоттннгера) при температуре (26-28) °С в течение двух суток. В качестве разводящей жидкости для приготовления последовательных 10-кратных разведений использовали 0,85 % раствор натрия хлорида. Биологическую концентрацию микробов в культурах определяли путем высева серийных разведений культур на ППС в чашки Петри и подсчета числа выросших колоний. Определение оптической концентрации микробов в культурах осуществляли с помощью ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасеви-ча (ОСО 42-28-85П).
Концентрацию ионов водорода (рН) в микробных суспензиях определяли потенциометрически.
Расчет основных статистических параметров и их оценку проводили с доверительной вероятностью р=0,95.
Результаты и обсуждение
На начальном этапе работы проведены сравнительные исследования, направленные на выбор формы тест-культуры, предназначенной для проверки качества ПС. В этих экспериментах в качестве возможных вариантов тест-культуры испытывали три вида посевных культур вакцинного штамма ЕВ линии НИИЭГ I, II и III генерации, используемых в технологии ВЧЖС [10], агаровую субкультуру и стабилизированную пассированную агаровую культуру на основе микробов Y. pestis штамма ЕВ. Проведено сравнительное изучение пяти вышеуказанных вариантов микробных культур Y. pestis штамма EВ с использованием следующих показателей: оптической концентрации по ОСО мутности, биологической концентрации (по числу колониеобразующих единиц), относительного содержания клеток неповрежденных и делящихся, линейных размеров микробов (длина и диаметр). Оценке подвергали как свежеприготовленные, так и хранившиеся культуры.
Из данных, представленных на рис.1, видно, что наименьшую способность формировать колонии на ППС через 7 и 14 сут хранения имеют микробные культуры, выращенные в ЖПС в статических условиях во флаконах (30 и 21 % соответственно), а большая выживаемость по доле колониеобразующих единиц через 14 сут хранения характерна для культур, выращенных на ППС в пробирках (-80 %). Средний уровень колониеобразующей
способности характерен для микробных культур, приготовленных на скошенной ППС в матрацах и в ЖПС в бутылях с аэрацией. Он составляет на 7-е сутки хранения 81 и 87 %, а на 14-е сутки - 66 и 59 % соответственно. Наибольшая доля поврежденных клеток наблюдалась на 14-е сутки хранения в микробных культурах, выращенных в ЖПС, а наименьшее количество поврежденных клеток было в микробных культурах, полученных на ППС. Низкую сохраняемость клеток бульонных микробных культур из флаконов после хранения, на которую указывает утрата клетками способности формировать колонии на ППС, можно связать с высокой гетерогенностью микробной популяции за счет наличия в них значительного количества молодых, не завершивших цикл развития клеток.
В связи с этим предложено оценить возможность использования в качестве тест-культуры агаровой культуры, выращенной на ППС на основе ФГМ, скошенной в матрацах, так как наши данные и данные литературы свидетельствуют о преимуществе агаровых культур над жидкими по стабильности основных биологических свойств. Проведенные исследования показали, что агаровая культура У. рвъиъ штамма ЕВ лучше сохраняет свои свойства в течение двух недель экспозиции, однако для обеспечения потребностей вакцинного производства указанного срока недостаточно.
В целях увеличения срока годности разрабатываемой тест-культуры целесообразной представлялась оценка возможности использования метода криоконсервации, обеспечивающего наиболее щадящее воздействие на жизнеспособность и другие свойства микроорганизмов при их длительном хранении [2, 3]. В результате проведенных исследований выбор был остановлен на доступной и легко поддающейся стерилизации обычными методами сахарозно-глицериновой защитной среде.
На рис. 1 также представлены результаты иссле-
Рис. 1. Динамика колониеобразующей способности микробов тест-культуры (за 100 % принята колониеобразующая способность бактерий свежеприготовленных культур):
1 - культура I генерации (ППС, пробирка); 2 - культура II генерации (ЖПС, флакон); 3 - культура III генерации (ЖПС, бутыль);
4 - субкультура (ППС, матрац); 5 - стабилизированная агаровая культура. Культуры 1-4 исследовались сразу при приготовлении (А), через 7 (Б) и 14 сут (В) хранения; стабилизированная агаровая культура (5) исследовалась сразу при приготовлении (А), через 30 (Б) и 120 сут (В) хранения
Рис. 2. Схема получения тест-культуры У. pestis штамма ЕВ
дования стабилизированной агаровой субкультуры по аналогичным биологическим показателям, но на более длительных сроках хранения (30 и 120 сут). Принципиальных отличий в направленности изменений биологических свойств для стабилизированных культур не было. Жизнеспособность микробов в составе криоконсервированной культуры через 6 мес. хранения при температуре минус (20±2) °С составила 83 % от первоначального уровня (свежеприготовленная культура). Совокупность полученных результатов позволила считать целесообразным использование при разработке тест-культуры метода криоконсервации агаровой культуры штамма ЕВ в сахарозно-глицериновой защитной среде.
Экспериментально отработанная нами схема получения тест-культуры У. pestis штамма ЕВ представлена на рис. 2.
Приготовление стабилизированной агаровой тест-культуры штамма ЕВ проводили с использованием свежепассированнной культуры. Выросшие на поверхности ППС типичные колонии отбирали бактериологической петлей (не менее 50), тщательно суспендировали в 0,85 % растворе натрия хлорида и высевали по 0,2-0,3 мл во флаконы с ЖПС. Посевы инкубировали при температуре (27+1) ° в течение 48 ч. Культуры из флаконов после оценки характера роста и микроскопии мазков по Граму пересевали на скошенную в матрацах ППС и выращивали при температуре (27+1) °С в течение 48 ч. Агаровые культуры смывали защитной средой, состав которой
указан на рис. 2. Свежеприготовленную объединенную культуру разливали в стерильные пробирки, которые помещали в холодильную камеру при температуре минус (20±2) °С, и хранили в течение 6 мес. Тест-культуру оценивали по следующим показателям: оптической концентрации, биологической концентрации, длине и диаметру микробов, содержанию неповрежденных и делящихся клеток.
Анализ данных, представленных в таблице, показывает, что различия по основным характеристикам (жизнеспособности и доли неповрежденных клеток) между свежеприготовленной и хранившейся в течение 6 мес. (максимальный срок наблюдения) стабилизированными агаровыми культурами относительно невелики. Следует подчеркнуть, что жизнеспособные клетки вакцинного штамма после полугода хранения морфологических изменений не имели.
Таким образом, разработан способ получения тест-культуры, предназначенной для определения кондиционности ПО и ПС в технологии ВЧЖС, сохраняющей свои целевые свойства в течение 6 мес.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бендас Л. Г. // Разработка и стандартизация биологических питательных сред. - М., 1980. - С. 10-14. - 2. Герна Р. // Методы общей бактериологии / Под ред. Ф.Герхардта. -М., 1983. - Т. 1. - 535 с. - 3. Дузу П. Криобиохимия / Пер. с англ. Б.М.Сергеева. - М.: Мир, 1980. - 283 с. - 4. Калинин Ю.Т., Злобин В.Н., Храмов Е.Н. и др. // Вестн. РАМН. -1999. - № 8. - С. 3-8. - 5. Коробкова Е.И. Живая противочумная вакцина (Теория и практика иммунопрофилактики чумы). - М.: Медгиз, 1956. - 208 с. - 6. Медуницын Н.В. // Эпидемиол. и инф. бол. - 1998. - № 6. - С. 4-8. - 7. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. - М., 1980. - 14 с. - 8. Мишанькин Б.Н., Лопатина Н.В. // Биотехнология. - 1996. - № 4. -С. 3-9. - 9. Онищенко Г.Г., Наумов А.В., Кокушкин А.М., Дроздов И.Г. // Пробл. особо опасных инф. - 1993. -№ 1-2. - С. 4-9. - 10. Регламент: РП №1368-03. Вакцина чумная живая сухая. Утв. 25.06.03. - 2003. - 11. Салтыков Р . А . , Ф а й б и ч М. М . Опыт 30-летнего изучения стабильности свойств чумного вакцинного штамма ЕВ в СССР // ЖМЭИ. -1975. - № 6. - С. 3-8.
E.V.Zheloodkova, A.A.Byvalov, V.P.Bondarev, V.I.Klimov, A.V.Cherniadyev, A.V.Yezhov, S.A.Shvetsov, D.A.Mokhov
Choosing a Test-Culture to Assess the Properties
of Nutritional Media and Bases Used in the Production of the Live Dry Plague Vaccine
48-th Central Research Institute of RFMinistry of Defense, Kirov
Elaborated were the composition and technology for manufacturing a test culture to evaluate the qualities of nutritional bases and media used in the production of the live dry plague vaccine with serviceable life of no less than 6 months. The test culture involved a suspension of Y. pestis EV vaccine strain cells (50-109 c.p.ml), stabilized in the protection medium containing sucrose (2.5%), glycerol (10%), K2HP04 (0.12%), KH2P04 (0.08%).
Key words: test-culture, nutritional medium, technology, plague vaccine.
Поступила 29.01.07.
