CC BY
121
УДК 577.15
М. В. Харина, В. М. Емельянов
ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ОБРАБОТКИ И ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА СВЕКЛОВИЧНОГО ЖОМА
Ключевые слова: свекловичный жом, ферментативный гидролиз, предварительная обработка, сернистая кислота, степень
конверсии.
Изучено влияние длительности предварительной обработки, а также концентрации сернистой кислоты на степень конверсии свекловичного жома ферментным комплексом CellicCTec2.
Key words: sugar beet pulp, enzymatic hydrolysis, pretreatment, sulfurous acid, degree of conversion.
The effect of the duration of the pre-treatment and concentration of sulfuric acid on the conversion of sugar beet pulp with enzyme complex CellicCTec2 was investigated.
Введение
Свекловичный жом является побочной продукцией переработки сахарной свеклы и представляет собой микростружку толщиной не более 2 мм влажностью около 90%, из которой диффузионным способом горячей водой (70-80°С) излечено основное количество сахарозы и некоторая часть минеральных и органических веществ [1].
В свекловичной стружке после извлечения сахарозы остается от 18 до 23% сухих веществ [3]. В свежем свекловичном жоме содержится (% от массы сухих веществ): пектиновых веществ - 24-32, целлюлозы - 22-30, связующих гликанов - 22-30, белков - 1,5-3,0, золы - 3,0-8,2, лигнина - 1,5-3,0, сахарозы - 0,2-0,3 [2].
Свекловичный жом является источником моносахаридов, имеющих большую коммерческую ценность и различные направления применения. Благодаря высокому содержанию углеводов, возможно использование гидролизатов свекловичного жома в производстве биоэтанола, кормовых дрожжей, лизина и других продуктов микробиологического синтеза. Растительная клеточная стенка обладает высокой устойчивостью к деградации. Как известно, условия гидролиза лигноцеллюлозного сырья разбавленными кислотами практически не влияют на химическую устойчивость целлюлозы.
При проведении ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов в их нативном виде выход сахаров достигает менее 20% от теоретически возможного [3]. Это связано с наличием ряда факторов, влияющих на эффективность ферментативного гидролиза, таких как лигнин, связующие гликаны, ацетильные группы, кристалличность и степень полимеризации целлюлозы, размер частиц и пор, доступная площадь поверхности [4-6].
Для повышения степени конверсии полисахаридов нами проведено исследование двухстадийной обработки свекловичного жома, включающей в себя гидролиз связующих гликанов сернистой кислотой и последующая ферментативная деградация целлюлозы.
Экспериментальная часть
В работе использовался жом сахарной свеклы (Beta vulgaris), выработанный на ООО «Буин-
ский сахарный завод» (г. Буинск, февраль 2013 г). Выделение легко- и трудногидролизуемых полисахаридов из свекловичного жома проводилось по стандартным методикам [7].
Предварительная обработка свекловичного жома сернистой кислотой проводилась на лабораторной установке высокотемпературного гидролиза растительного сырья оригинальной конструкции [8, 9] позволяющей проводить процессы химического гидролиза в рабочем диапазоне температур 100-200°С при избыточном давлении 0-1,2 МПа. Свекловичный жом обрабатывался 1% сернистой кислотой при температуре 190° С и варьировании времени обработки свекловичного жома от 5 до 50 минут. Содержание редуцирующих веществ определяли методом Макэна-Шоорля [10]. После гидролиза жом промывался дистиллированной для удаления кислоты, которая в дальнейшем может снижать эффективность ферментативного гидролиза непрогидро-лизованных остатков жома.
В качестве биокатализатора при ферментативном гидролизе в работе использовался ферментный препарат CellicCTec2 компании Novozymes (активностью 115,6 FPU/мл). Основные компоненты ферментного комплекса: целлюлаза CAS 9012-54-8, ксиланаза CAS 37278-89-0. Плотность препарата
1,15 г/мл. Оптимальные условия применения: температура 45-50 °С, рН 5,0-5,5.
Количество ферментного комплекса, вносимого при ферментолизе варьировалось от 0,01 до
0,25 г/г АСВ субстрата.
Исследования проводили в колбах Эрлен-мейера в натрий-цитратном буфере (рН 5,0) при варьировании гидромодуля 1:(10-30) при температуре 50±2°С в течение 120 ч. при постоянном перемешивании на качалке с частотой вращения 150 об/мин. С целью предотвращения роста микроорганизмов в процессе ферментативного гидролиза в каждую колбу добавляли по 40 мкл 1% раствора тетрациклина в 70% этаноле.
Каждые 4-12 ч. отбирали пробу суспензии для определения содержания глюкозы, которое рассчитывали с учетом присоединения воды к ангид-роглюкозным остаткам соответствующих мономерных звеньев при ферментативном гидролизе субстрата. Содержание глюкозы в ферментолизатах определяли глюкозооксидазным методом.
Эксперименты проводили в 3 кратной аналитической повторности. Погрешность реализации экспериментов при определении содержания глюкозы и редуцирующих веществ не превышала ± 0,25%.
Результаты и обсуждение
На первом этапе выбора оптимальных условий предварительной обработки с целью оценки влияния длительности предварительной обработки свекловичного жома сернистой кислотой проведен ферментативный гидролиз свекловичного жома, обработанного 1% сернистой кислотой в течение 5,
10, 20, 30, 40 и 50 минут при 190°С. Также, в качестве контрольного эксперимента проводился ферментативный гидролиз свежего свекловичного жома, не подвергавшегося какой-либо обработке. Ферментативный гидролиз проводился при соотношении массы абсолютно сухого вещества 1:20 и загрузке фермента 0,1 г/г АСВ субстрата.
Динамика конверсии свекловичного жома, предварительно обработанного 1% сернистой кислотой в течение 5, 10, 20, 30, 40 и 50 минут при 190°С представлена на рисунке 1.
-♦-Лп (цхдг фшгчьной обработки -< уши
——10 шти -*-;<> мин
-♦-30 мин -•-40 МЛН
-♦-50 м»«
Рис. 1 - Динамика конверсии свекловичного жома, предварительно обработанного 1% сернистой кислотой в течение 5, 10, 20, 30, 40 и 50 минут при 190°С
Как показано на рис. 1, предварительная обработка свекловичного жома 1% сернистой кислотой оказывает значительное влияние на степень его конверсии ферментным препаратом. Наибольшая степень ферментативной конверсии наблюдается при предварительной обработке свекловичного жома 1% сернистой кислотой в течение 10 мин. С увеличением продолжительности обработки свекловичного жома 1% сернистой кислотой с 10 до 50 мин. наблюдается снижение степени его конверсии. Это может быть связано с тем, что при более длительном пребывании в аппарате происходит обугливание свекловичного жома при контакте со стенками капсул, нагретых до 190°С. Таким образом, обработка жома более 10 мин. не желательна. Предварительная обработка свекловичного жома 1% сернистой кислотой значительно увеличивает выход глюкозы по сравнению с жомом, не подвергавшимся обработке, с 17,3% до 79,6% от АСВ жома. Данный факт объясняется тем, что при воздействии сернистой кислоты происходит удаление связующих гли-
канов и пектиновых веществ и увеличение площади доступной поверхности целлюлозы.
С целью определения оптимальной нормы расхода фермента проведен ферментативный гидролиз свекловичного жома обработанного в течение 10 мин. 1% сернистой кислотой при 190°С при варьировании загрузки ферментного комплекса от 0,01 до 0,25 г/г АСВ субстрата при гидромодуле 1:20 (рис. 2).
Время, ч
■^■0.01 гферыента г субстрата -•-0.025 г фермента г субстрата чгО.О.5 і фср»ісиі;і г субсірга« —0.СТ5 і фермента г субстрлга *-•“0.1 г фермента г субстрлга -*“0.25 г фермента г субстрата
Рис. 2 - Влияние загрузки ферментного комплекса степень конверсии свекловичного жома, предварительно обработанного 1% сернистой кислотой при 190°С в течение 10 мин.
Как видно из рисунка 2, максимальная степень конверсии достигается к 96 ч. ферментативного гидролиза и достигает 82,76 и 88,3% от АСВ жома при загрузке фермента 0,10 и 0,25 г/г АСВ субстрата соответственно.
Известно, что такие компоненты целлюло-литических ферментных комплексов как целлобио-гидролазы и эндоглюканазы ингибируются продуктами их гидролиза - целлобиозой и глюкозой [11]. Существует предположение, что в процессе ингибирования нормальный комплекс субстрат-фермент преобразуется в неэффективный. Следовательно, при накоплении в гидролизате высокой концентрации глюкозы и целлюбиозы, процессы ферментативной конверсии лигноцеллюлозы замедляются.
Увеличение гидромодуля в процессе ферментативного гидролиза может способствовать повышению степени конверсии свекловичного жома. Поэтому, для изучения влияния гидромодуля на степень конверсии при ферментативном гидролизе свекловичного жома проведен ферментолиз при варьировании гидромодуля 1:(15-30) (рис. 3).
Исследование влияния гидромодуля на степень конверсии при ферментативном гидролизе свекловичного жома показало, что увеличение гидромодуля от 1:20 до 1:30 обеспечивает повышение степени конверсии на 15,7% от АСВ жома. При этом максимальная степень конверсии достигается при более низкой загрузке фермента (0,05 вместо 0,1 и
0,25 г/г АСВ субстрата) и составляет 84,96% от АСВ жома.
Важным аспектом, который необходимо учитывать при подготовке сырья, подлежащего дальнейшему ферментативному гидролизу, является его хранение после проведения предварительной
обработки. Свекловичный жом, предварительно обработанный при выбранных оптимальных условиях (1% сернистой кислотой в течение 10 мин. при 190°С) был высушен в сушильном шкафу при температуре 50°С до постоянной массы, а затем подвергнут ферментативному гидролизу. Влияние высушивания предварительно обработанного свекловичного жома на эффективность его дальнейшего гидролиза ферментным комплексом ферментным комплексом при гидромодуле 1:20 и варьировании загрузки фермента от 0,01 до 0,1 г фермента/г АСВ субстрата показано на рисунке 4.
Врсш ч —1 15 -*-1:20 -*-1:Э0
Рис. 3 - Влияние гидромодуля на степень конверсии при ферментативном гидролизе свекловичного жома с загрузкой фермента 0,05 г/г АСВ субстрата, предварительно обработанного 1% сернистой кислотой при 190°С в течение 10 мин. при варьировании гидромодуля 1:(15-30)
Как показано на рисунке 4, высушивание предварительно обработанного свекловичного жома приводит к снижению степени его конверсии более чем в 4 раза. Это может быть связано с необратимым закупориванием пор целлюлозы, затрудняющем доступ ферментов к субстрату [11].
.7.
О 10 -О 5Q 4P ÍO еи> “9
Р|ЧИЛ. Ч
^и!0.05 I; фс]11ешл .Г г%б1‘1]кпг1 —^),075 I (зсрвдмг; г суйсграгм
"*"0.1 I ■|ч,|!3<.<111 !1 Е I. ОС фЛГ.1
Рис. 4 - Влияние высушивания предварительно обработанного свекловичного жома на эффективность его дальнейшего гидролиза
Выводы
1. Наибольшая степень ферментативной конверсии наблюдается при предварительной обработке свекловичного жома 1% сернистой кислотой в течение 10 мин.
2. Увеличение гидромодуля от 1:20 до 1:30 обеспечивает повышение степени ферментативной конверсии свекловичного жома на 15,7% от АСВ жома. При этом максимальная степень конверсии достигается при более низкой загрузке фермента (0,05 вместо 0,1 и 0,25 г/г АСВ субстрата) и составляет 84,96% от АСВ жома.
3. Высушивание предварительно обработанного свекловичного жома нежелательно, так как приводит к снижению степени его конверсии более чем в 4 раза.
Литература
1. Л. В. Донченко, Н. В. Демина, С. Е. Ковалева Возможность Науч. журн. КубГАУ, 21, 44-48 (2006)
2. Стахеев И.А., Коломиец Э.И., Здор H.A., Биотехнология малотоннажного производства микробного протеина. Навука ггэхшка, Киев, 1991. 264 с.
3. A.P. Dadi, C.A. Schall, S. Varanasi, Chin. Sci. Bull, 51, 2432-2436 (2007)
4. C.E. Wyman, Annu Rev Energy Environ, 24,189-226 (1999)
5. М.В. Харина, О.Н. Григорьева, Вестник Казан. технол. ун-та, 16, 158-166 (2001)
6. Р.М. Нуртдинов, Р.Т. Валеева, С.Г. Мухачев, М.В. Харина Вестник Казан. технол. ун-та, 6, 143-147 (2001)
7. Stephen S. Fry, The growing plant cell wall: chemical and metabolic analysis. Springer, New York, 1988. 121 p.
8. С.Г. Мухачев, В.М. Емельянов, М.Ф. Шавалиев, Р.Т. Елчуев, Р.Т. Валеева, Р.М. Нуртдинов, А.М. Буйлин Вестник Казан. технол. ун-та, 5, 21-26 (2009)
9. Р.М. Нуртдинов, С.Г. Мухачев, Р.Т. Валеева, В.М. Емельянов, М.Ф. Шавалиев, И.В. Шагивалеев, И.А. Якушев, Вестник Казан. технол. ун-та, 2, 143-147 (2011)
10. Ю.А. Жданов, Г.Н. Дорофеенко, Практикум по химии углеводов. Высшая школа, Москва, 1973. 204 с.
11. Scheper Т., Tsao G. T. Recent progress in bioconversion of lignocellulosics. Spring er-Verlag Berlin Heidelberg, Berlin, 1999. 280 p.
© М. В. Харина - асп., асс. каф. химической кибернетики КНИТУ, [email protected]; В. М. Емельянов д-р техн. наук, проф., зав. каф. химической кибернетики КНИТУ, [email protected].
