CC BY
41
микробиология
МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616-002.3-085.33.035.1
Тец Г.В., Тец В.В., Ворошилова Т.М., Смирнова Е.И., Кардава К.М., Карамян Т.А., Заславская Н.В., Викина Д.С., Зайцева М.А., Артеменко К.Л., Вечерковская М.Ф. Кауфман А.С.
ВЫБОР АНТИБИОТИКА В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ
ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава РФ, 197022, Санкт-Петербург
Изучена эффективность использования тест-системы"Выбор антибиотика" для оценки чувствительности к лечебным препаратам максимально возможного количества бактерий из патологического материала при ожоговой травме без выделения чистой культуры. По результатам метагеномного анализа установлено, что тест-система позволяет поддержать рост практически всех бактерий, выявленных в раневом отделяемом, в том числе относящихся к пока не культивируемым. Проведено сравнение результатов стандартного определения чувствительности бактерий к антибиотикам и использования эффективного лекарственного препарата по результатам использования тест-системы «Выбор антибиотика». Полученные данные показывают, что тест-система позволяет без выделения чистой культуры выбрать антибиотик в течение 6-20 ч.
Ключевые слова: выбор антибиотика; экспресс-диагностика; метагеномный анализ; пока не культивируемые
бактерии; гнойно-воспалительные заболевания; раневая инфекция. Для цитирования: Тец Г.В., Тец В.В., Ворошилова Т.М., СмирноваЕ.И., Кардава К.М., Карамян Т.А., Заславская Н.В., Викина Д.С., Зайцева М.А., Артеменко К.Л., Вечерковская М.Ф. Кауфман А.С. Выбор антибиотика в микробиологическом исследовании гнойно-воспалительных процессов. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (6): 372-375. DOI: htpp://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-6-372-375
Tetz G.V., Tetz V.V., Voroshilova T.M., SmirnovaE.I., KardavaK.M., Karamyan T.A., ZaslavskayaN.V., VikinaD.S., Zaitseva M.A., ArtemenkoK.L., VecherkovskayaM.F., Kaufman A.S.
THE CHOICE OF ANTIBIOTIC IN MICROBIOLOGICAL STUDY OF PYOINFLAMMATORY PROCESSES
The I.P. Pavlov first Sankt-PereburgskiP state medical university of Minzdrav of Russia, 197022 St. Petersburg, Russia
The efficiency of application of test-system "Antibiotic Choice" was examined concerning evaluation of sensitivity to medications of maximal possible number of bacteria from pathological samples at burn trauma without Isolation ofpure culture. The results ofmetagenome analysis demonstrated that test-system permits .supporting factually all bacteria discovered in wound discharge, including ones related to not cultivated yet. The comparison was carried out concerning results of standard identification of sensitivity of bacteria to antibiotics and efficient medication according the results of application of test-system "Antibiotic Choice". The obtained results demonstrate that test-system permits choosing antibiotic during 6-20 hours without separation of pure culture.
Keywords: antibiotic choice; express-diagnostic; meta-genome analysis; bacteria not cultivated yet; pyoinflammatory diseases; wound infection
For citation: Tetz G.V., Tetz V.V., Voroshilova T.M., SmirnovaE.I., KardavaK.M., Karamyan T.A., ZaslavskayaN.V., Vikina D.S., Zaitseva M.A., Artemenko K.L., Vecherkovskaya M.F., Kaufman A.S. The choice of antibiotic in microbiological study of pyoinflammatory processes. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (6): 372-375. (inRuss.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-6-372-375
For correspondence: Tetz V.V., doctor of medical sciences, professor, head of the chair of microbiology and virology. e-mail: [email protected]
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The study had no sponsor support.
Received 02.12. 2016 Accepted 15.12.2016
Введение. Антибиотики являются самыми востребованными лекарственными препаратами современной медицины. Несмотря на это, проблема быстрого и адекватного выбора подходящего противомикробного средства остается
Для корреспонденции: Тец Виктор Вениаминович, д-р мед. наук, проф., зав.каф. микробиологии и вирусологии; e-mail: vtetzv@ yahoo.com
нерешенной. Это объясняется рядом объективных причин, среди которых значительную роль играют существование бактерий, не дающих роста в условиях традиционного лабораторного культивирования (пока не культивируемые бактерии) [1-3], и длительность процесса определения антибио-тикочувствительности. Дающие рост бактерии могут быть не единственными микроорганизмами и даже не самыми главными в формировании патологического процесса, с которым
необходимо бороться. Метагеномный анализ показал, что мы знаем только малую часть как представителей микробиоты человека, так и возбудителей его болезней [4, 5].
Существующая лабораторная диагностика не позволяет получить информацию о наличии в патологическом материале пока не известных, не культивируемых бактерий и их чувствительности к антибиотикам. По-прежнему отсутствует эффективный экспресс-метод выбора антибиотика для лечения больных.
Цель работы - изучение возможности использования нового подхода в микробиологическом исследовании, позволяющего одновременно получать рост культивируемых и пока не культивируемых бактерий и данные об эффективности действия на них антибиотиков при гнойно-воспалительных заболеваниях (ГВЗ) без выделения чистых культур.
Материал и методы. Материал для исследования: раневое отделяемое (больной 36 лет, диагноз - ожог II степени, площадь ожога 7%). Время между забором материала и включением его в исследование не превышало 24 ч, хранение при 40С.
Питательные среды: агары Шедлера, Колумбийский, Эндо (Oxoid, Великобритания) и селективный солевой агар (Биомедиа, СПб).
Определение биохимической активности микроорганизмов проводили с помощью системы Vitek 2 (bioMerieux, Франция).
Тест-система «Выбор антибиотика» (ТСВА) для диагностики ГВЗ: культивирования бактерий и оценки действия на них антибиотиков (амоксициллин/клавуланат, азитромицин, цефтриаксон, левофлоксацин, меропенем, линезолид, триме-топрим/сульфаметоксазол, ванкомицин, клиндамицин, гента-мицин) (Новые Антибиотики, Россия).
Выделение ДНК. Выделение ДНК из патологического материала и выросших на среде бактерий проводили с помощью стандартного набора «ДНК сорб-В» (Россия) согласно имеющемуся протоколу.
Амплификацию проводили, используя эубактериальные праймеры 27F - 534R, фланкирующие гипервариабельный участок гена 16S рРНК:
27F: '5-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3';
534R: '5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'.
Используемая в работе пара олигонуклеотидных прайме-ров специфична консервативным участкам гена 16s рРНК и применяется в метагеномных исследованиях для выявления бактериального разнообразия различных сообществ [2]. Ме-тагеномное секвенирование фрагмента гена 16S рРНК произведено на пиросеквенаторе Roche/454 GenomeSequencer FLX Titanium. Максимальная длина полученных последовательностей составила 507 нуклеотидов, химерные последовательности и последовательности короче 300 нуклеотидов не включены в анализ.
Анализ разнообразия и таксономического состава. Каждая полученная в ходе пиросеквенирования последовательность идентифицирована путем сравнения с последовательностями баз данных GenBank и EzTaxon, при этом использовали алгоритмы BLASTN поиска и попарное сравнение [7]. Для идентификации применяли следующие пороги сходства (х = сходство): виды (x > 97%), роды (97 > x > 94%), семейства (94 > x > 90%), порядки (90 > x > 85%), классы (85 > x > 80%), отряд (80 > x > 75%). Для определения видового разнообразия таксономического состава и сравнения сообществ применяли программу Pyrosequencing pipeline (http://pyro.cme.msu.edu). Полученные последовательности выравнивали и проводили кластерный анализ с помощью программы complete Linkage clustering, входящей в состав pyrosequencing pipeline. Кластеризацию осуществляли на разных уровнях, характеризующихся разными расстояниями
microbiology
между кластерами (от 0 до 0,25 с шагом 0,01). Выделение филотипов (OTU) проводили при кластерном расстоянии 0,03; оценку таксономической сложности сообществ - при уровнях различий, соответствующих следующим таксонам: вид - 0,03, род - 0,05, семейство - 0,1, используя программу Rarefaction (Pyrosequencing pipeline). Для характеристики таксономического состава сообществ проведен кластерный анализ с параметром расстояния 0,25. Далее для каждого кластера с помощью программы Dereplicate Request определяли нуклеотидную последовательность, соответствующую центру кластера, имеющую минимальную сумму квадратов расстояний до других входящих в кластер последовательностей. Репрезентативные последовательности кластеров таксоно-мически классифицировали. Классификация видов на всех этапах работы произведена на основе генотипического подхода в соответствии с международным кодом номенклатуры бактерий (ICNB). В случае если репрезентативная последовательность имела гомологию более 97% с последовательностью валидированного микроорганизма, кластер относили к соответствующему виду.
Результаты и обсуждение. В ходе стандартного лабораторного бактериологического исследования из патологического материала выделена грамотрицательная палочка, идентифицированная как Klebsiella oxytoca.
ТСВА включает 10 лунок с питательной средой, содержащей антибиотики в той концентрации, в какой они встречаются в очаге инфекции, и два контроля без антибиотика для получения роста максимально возможного количества разных бактерий, которые могут находиться в испытуемом материале.
Поскольку среда, использованная в системе, обеспечивает рост разных бактерий в минимальные сроки, учет результатов проводился первый раз уже через 6 ч после засева и инкубации при 37ОС. Бактерии, выросшие на ТСВА в контроле, собраны и одновременно с исходным патологическим материалом подвергнуты метагеномному изучению. В результате в образце раневого отделяемого и среди бактерий, выросших после ее посева на ТСВА, обнаружено значительное видовое разнообразие. Выявлены бактерии, принадлежащие к одному порядку Enterobacterial, одному семейству, трем родам и восьми видам (см. таблицу).
Метагеномный анализ материала от больного и бактерий, выделенных на ТСВА
Положение Материал
в систематике раневое отделяемое микробы, выросшие на тест-системе
Порядок Enterobacteriales Enterobacteriales
Семейство Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae
Род Enterobacter Enterobacter
Klebsiella Klebsiella
Pantoea Pantoea
Вид Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes
Enterobacter asburiae Enterobacter asburiae
Enterobacter cancerogenus Enterobacter cancerogenus
Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae
Enterobacter hormaechei Enterobacter hormaechei
Klebsiella oxytoca Klebsiella oxytoca
Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae
Pantoea agglomerans Pantoea agglomerans
микробиология
В результате проведенных исследований установлено практически 100% совпадение видов микроорганизмов, находящихся в материале от больного и давших рост в контроле на ТСВА. Обнаружение при метагеномном анализе большого числа бактерий разных видов одного рода, не полученных в ходе стандартного процесса выделения чистой культуры, свидетельствует о наличии в пробе бактерий, относящихся к группе пока не культивируемых.
Большинство бактерий, обнаруженных при метагеном-ном анализе, в патологическом материале и после его культивирования на ТСВА, описаны как возбудители болезней растений и людей. Возбудителями оппортунистических инфекций считаются E. aerogenes, P. agglomerans, E. cloacae, E. hormaechei, E. cloacae, E. cancerogenus, E. asburiae [6-12].
Большинство бактерий, выявленных при метагеномном анализе, не получено в виде чистых культур в ходе выделения и идентификации возбудителя, проведенных стандартными лабораторными методами. Отсутствие роста бактерий на питательной среде и наличие их в материале указывают на невозможность получить на питательных средах в виде чистой культуры большую часть бактерий, в том числе возбудителей болезни. Пока не культивируемые бактерии тем не менее принимают участие в развитии патологического процесса и их присутствие необходимо учитывать при выборе антимикробной терапии.
Выделенная в ходе стандартного лабораторного бактериологического исследования грамотрицательная палочка, идентифицированная как K. oxytoca, по данным лабораторного исследования чувствительна к основным антибиотикам (цефалоспоринам, меропинему, аминогликазидам, фторхино-лонам), устойчива к ампициллину, но чувствительна к ампи-циллин/клавулановой кислоте, что указывает на продукцию бета-лактамаз(ы). Отсутствие чистых культур большинства пока не культивируемых бактерий не позволяет провести оценку их чувствительности к антибиотикам существующими методами.
E. aerogenes обладает мультирезистентностью к бета-лактамам и фторхинолонам [12], E. hormaechei почти всегда устойчива к ампициллину, цефалоспоринам [8, 11]. Много данных об устойчивости K. pneumoniae к различным антибиотикам. Очень распространена устойчивость у бактерий данного вида, когда они являются возбудителями внутри-больничных инфекций [13].
Частично решить эту проблему можно при использовании ТСВА. Хотя она не позволяет оценить уровень чувствительности к антибиотикам отдельных бактерий, но дает возможность выбрать препарат, который в концентрации, создаваемой в очаге поражения, способен блокировать рост всех бактерий, имеющихся в патологическом материале данного больного. Для этого на ТСВА на среду с антибиотиками засеяно раневое отделяемое. В присутствии каждого антибиотика в разных лунках мы регистрировали возможность совместного роста культивируемых и пока не культивируемых бактерий, находящихся в раневом отделяемом. Отсутствие роста бактерий через 6 ч (предварительный результат) и 20-24 ч (окончательный) позволило выбрать антимикробные препараты, предотвращающие рост всех возможных бактерий, находящихся в патологическом материале.
В число эффективных препаратов вошли: азитромицин, линезолид, триметаприм/сульфаметоксазол, ванкомицин, клиндамицин, гентамицин. Именно в зонах с этими антибиотиками отсутствовал рост микробов в системе ТСВА.
При этом стандартный бактериологический анализ показал для изолированного штамма K. oxytoca устойчивость только к ампициллину. Количество эффективных препаратов, действующих на все микробы, содержащиеся в патологическом материале и способные расти на ТСВА, меньше коли-
чества препаратов, выбранных для изолированного штамма К. оxytoca.
Существующие микробиологические технологии пока не позволяют изолировать и изучать все бактерии, находящиеся в очаге инфекции и полученном из него патологическом материале. Основной причиной ограниченных возможностей стандартных лабораторных методов следует считать существование ранее не изучавшихся пока не культивируемых бактерий. Чаще всего такие бактерии дают рост при совместном выращивании в составе смешанных сообществ, где бактерии предоставляют друг другу определенные факторы, без которых каждый по отдельности расти не способен [5, 14].
Можно предполагать, что патологический процесс вызван не только тем микробом или микробами, которые удалось выделить и идентифицировать общепринятыми, стандартными методами. Пока не культивируемые бактерии в настоящее время фактически не выявляются стандартными методами, что значительно снижает реальную ценность существующего лабораторного исследования. Полученные результаты указывают также на значительную условность подбора антибиотиков на основании стандартных подходов к выделению чистой культуры и определению ее чувствительности к антибиотикам.
Использование ТСВА позволило в составе смешанных сообществ вырастить бактерии, которые по составу по данным метагеномного анализа соответствовали материалу, полученному от больного, и выбрать препараты, активные против всех бактерий, находящихся в материале из очага инфекции.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-3, 7-13 см. REFERENCES)
4. Вечерковская М.Ф., Тец Г.В., Тец В.В. Неизвестные бактерии в микрофлоре ротовой полости детей с онкогематологически-ми заболеваниями. Клиническая онкогематология. 2014; 7 (2): 229-32.
5. Тец В.В., Тец Г.В., Викина Д.С., Вечерковская М.Ф., Харламова В.В. Неизвестные возбудители заболеваний в микрофлоре ротовой полости человека, актуальные для оториноларингологии. Вестник оториноларингологии. 2014; (1): 33-6.
6. Фельдблюм И.В., Захарова Ю.А., Деменко С.Г. Сравнительная оценка различных подходов к изучению заболеваемости гнойно-септическими инфекциями среди родильниц в акушерских стационарах. Медицинский альманах. 2011; (5): 209-12.
14. Тец Г.В., Викина Д.С., Вечерковская М.Ф., Доморад А.А., Харламова В.В., Тец В.В. Новые подходы к изучению условно патогенных бактерий микрофлоры ротовой полости человека. Стоматология. 2013; 92 (1):14-6.
REFERENCES
1. Lipkin W.I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat. Rev. Microbiol. 2013; 11 (2): 133-41.
2. Petrosino J.F., Highlander S., Luna R.A., Gibbs R.A., Versalovic J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 2009; 55 (5): 856-66.
3. Schloss P., Westcott S.L., Ryabin T., Hall J.R., Hartmann M., Hollister E.B. et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75 (23): 7537-41.
4. Vecherkovskaya M.F., Tets G.V., Tets V.V. Unknown bacteria in oral flora of children with hematological malignancies. Klinicheskaya onkogematologiya. 2014; 7 (2): 229-32. (in Russian)
5. Tets V.V., Tets G.V., Vikina D.S., Vecherkovskaya M.F., Kharlamova V.V. Unknown pathogens in the microflora of the human oral cavity, pressing for otorhinolaryngology. Vestnik otorinolaringologii. 2014; (1): 33-6. (in Russian)
6. Fel'dblyum I.V., Zakharova Yu.A., Demenko S.G. Comparative
evaluation of different approaches to the study of the septic infections incidence in puerperas in maternity hospitals. Meditsinskiy al'manakh. 2011; (5): 209-12. (in Russian)
7. Cruz A.T., Cazacu A.C., Allen C.H. Pantoea agglomerans, a plant pathogen causing human Disease. J. Clin. Microbiol. 2007; 45 (6): 1989-92.
8. Garazzino S., Aprato A., Maiello A., Masse A., Biasibetti A., De Rossa F.J. et al. Osteomyelitis caused by Enterobacter cancerogenus infection following a traumatic Injury: case report and review of the literature. J. Clin. Microbiol. 2005; 43 (3): 1459-61.
9. Koth K., Boniface J., Chance E.A., Hanes M.C. Enterobacter asburiae and Aeromonas hydrophila: soft tissue infection requiring debridement. orthopedics. 2012; 35 (6): e996-9.
10. Mezzatesta M.L., Gona F., Stefani S. Enterobacter cloacae complex: clinical impact and emerging antibiotic resistance. Future Microbiol. 2012; 7 (7): 887-902.
11. O'Hara S.M., Steigerwalt A.G., Hill B.C., Farmer J.J., Fanning G.R.,
microbiology
Brenner D.J. Enterobacter hormaechei, a new species of the family Enterobacteriaceae formerly known as enteric group 75. J. Clin. Microbiol. 1989; 27 (9): 2046-9.
12. Thiolas A., Bollet C., La Scola B., Raoult D., Pages J.M. Successive Emergence of Enterobacter aerogenes strains resistant to imipenem and colistin in a patient. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49 (4): 1354-8.
13. Sanchez G.V., Master R.N., Clark R.B., Fyyaz M., Duvvuri P., Ekta G. et al. Klebsiella pneumoniae antimicrobial drug resistance, United States, 1998-2010. Emerg. Infect. Dis. 2013; 19 (1): 133-6.
14. Tets G.V., Vikina D.S., Vecherkovskaya M.F., Domorad A.A., Khar-lamova V.V., Tets V.V. New approaches to the study of opportunistic bacteria in human oral microbiota. Stomatologiya. 2013; 92 (1): 14-6. (in Russian)
Поступила 02.12.16 Принята к печати 15.12.16
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2017 УДК 616.993.192.6:618.1]-078.33
Морева Ж.Г.1, Гончаров Д.Б.2, Миронов А.Ю.3, Басильев М.М.4, Сащенко в.П.5, Иевлева Е.С.2
КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ТОКСОПЛАЗМОЗА У ЖЕНЩИН С ГИНЕКОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
1ГБОУ вПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава России, Иваново; 2ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва;
3ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Москва; 4ФГБУ «ГНЦ дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России, Москва; 5НУЗ «Отделенческая больница на станции Иваново» ОАО «РЖД», Иваново
Представлены результаты клинико-лабораторного обследования женщин (n = 104) с гинекологическими заболеваниями на выявление Toxoplasma gondii. Антитела к T. gondii обнаружены у 39,42% женщин при использовании ИФА и НРИФ. Токсоплазмоз определяют у женщин с различными гинекологическими заболеваниями на фоне сопутствующей экстра-генитальной патологии. Он протекает чаще всего латентно вместе с урогенитальными инфекциями, сопровождаясь изменениями гемостаза. Выявление антител к T. gondii в большинстве случаев при воспалительном процессе в маточных трубах, матке, яичниках может указывать на роль токсоплазма в развитии воспалительных заболеваний половых органов женщин.
Ключевые слова: токсоплазмоз; гинекологические заболевания; антитела к T. gondii; гематологические показатели; урогенитальные инфекции.
Для цитирования: Морева Ж.Г., Гончаров Д.Б., Миронов А.Ю., Васильев М.М., Сащенко В.П., Иевлева Е.С. Клинико-лабораторные особенности токсоплазмозау женщин с гинекологическими заболеваниями. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (6): 375-381. DOI: http://dx.doi.org/10.1882im69-2084-2017-62-6-375-381 MorevaZh.G.1, GoncharovD.B.2, MironovA.Yu.3, VasilievM.M.4, Sashchenko V.P.5, IevlevaE.S.2
THE CLINICAL LABORATORY FEATURES OF TOXOPLASMOSIS ШТ WOMEN WITH GYNECOLOGICAL DISEASES
1The Ivanoskaia state medical academy of Minzdrav of Russia, Ivanovo, Russia
2The honorary academician N.F. Gamaleia Federal research center of epidemiology and microbiology of Minzdrav of Russia, Moscow, Russia
3The G.N. Gabrichevskii Moscow research institute of epidemiology and microbiology of Rospotrebnadzor, Moscow, Russia 4The state research center of dermatovenerology and cosmetology of Minzdrav of Russia, Moscow, Russia 5The departmental hospital on Ivanovo railway station of the Russian Railways, Ivanovo, Russia
The article presents the results of clinical laboratory examination of women (n=104) with gynecological diseases for detection of Toxoplasma gondii. The antibodies to T. gondii were detected in 39.42%% of women using enzyme-linked immunosorbent assay and indirect immunofluorescence test. In women with various gynecological diseases the toxoplasmosis is detected against the background of concomitant extra-genital pathology. This disease takes its course mostly latent together with urogenital infections being accompanied by hemostasis changes. The detection of antibodies to T. gondii in most cases of inflammation process in oviducts, uterus, ovaries can indicate the role of toxoplasma in development of inflammation diseases of female genitals.
Для корреспонденции: Гончаров Дмитрий Борисович, канд. биол. наук, рук. лаб. протозойных инфекций ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; е-таП: goncharov_toxo@
