CC BY
5УДК 633.52.511.21:632.165
А.М. Шишлова1, Л.А. Сахно2, Б.В. Моргун2, Н.В. Кучук2, Н.А. Картель1
ВВЕДЕНИЕ кДНК CYP11A1 ЦИТОХРОМА P450SCC ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В РАСТЕНИЯ РАПСА
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
2Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины Украина, Д03680, г. Киев, ул. Акад. Заболотного, 148
Введение
Экспрессия в растениях гетерологичных генов, которые кодируют белки, выполняющие важные регуляторные функции в клетках животных, представляет интерес как с теоретической, так и с практической точки зрения.
К числу таких белков относятся цитох-ромы P450, которые в клетках животных и растений катализируют монооксигеназные превращения самых разнообразных субстратов [1, 2]. Среди представителей этого суперсемейства гемопротеинов особое внимание привлекает цитохром P450scc, локализованный в митохондриях и являющийся ключевым ферментом стероидоге-неза в стероидогенных тканях животных, так как он осуществляет превращение холестерина в прегненолон - предшественник всех стероидных гормонов животных. Эту ключевую стадию стероидогенеза цитохром P450scc катализирует с участием двух других компонентов электрон-транспортной цепи митохондрий - адренодоксина и адре-нодоксинредуктазы. Среди растений пока найдено лишь одно растение - наперстянка (Digitalis sp.), в митохондриях которого осуществляется аналогичный процесс. В этих растениях прегненолон является предшественником кардинолидов - стероидных гликозидов, обладающих кардиотонической активностью [3].
Вместе с тем показано, что существует сходство строения электрон-транспортной цепи митохондрий животных и растений. Например, биосинтез биотина в растениях происходит с участием белков-аналогов
адренодоксина и адренодоксинредуктазы животных [4].
Недавно в растениях обнаружены прогестерон и прогестерон-связывающие белки, которые являются гомологами прогестерон-связывающих белков животных [5]. При этом установлено, что прогестерон, связываясь с этими белками, вовлекается в процесс регуляции роста и развития растений.
В экспериментах, ранее проведенных в лаборатории молекулярной генетики по трансформации растений табака геном СУР11Л1, кодирующим цитохром Р450бсс, получены интересные результаты по влиянию данного гена на рост, развитие и физиолого-биохимические характеристики растений табака [6]. Так, трансгенные растения табака начинают цвести и образовывать семенные коробочки в среднем на две недели раньше, чем контрольные растения. Трансгенные растения превосходят контрольные по продуктивности, по содержанию растворимых и нерастворимых углеводов и белков.
Имеются также литературные данные по созданию трансгенных растений картофеля с геном СУР1Л1 цитохрома Р450, устойчивых к гербициду [7].
В этой связи представляет большой интерес создание трансгенных растений с геном СУР11Л1 цитохрома Р450бсс на культурах, имеющих хозяйственную ценность.
В данном сообщении представлены результаты по введению кДНК СУР11Л1 цитохрома Р450бсс из коры надпочечников быка в растения ярового рапса.
Материалы и методы
Растительный материал. В качестве исходного материала использовали семена ярового рапса (Brassica napus var. L. oliefera DC) сорта Магнат белорусской селекции, а также поддерживаемые в условиях in vitro растения ярового рапса (Brassica napus L. var. oleifera DC.) промышленных сортов Мария селекции Национального аграрного университета УААН и сорта Магнат белорусской селекции.
Создание генетических конструкций. Полноразмерная кДНК CYP11A1, кодирующая незрелый цитохром P450scc быка, выделенная
Г.В. Шпаковским [8], была нами клонирована в вектор pDH 51 под контролем конститутивного промотора 35SCaMV с образованием плазми-ды pDH P450scc. Из нее по сайтам рестрикции EcoRI была вырезана кассета, содержащая промотор 35S, ген цитохрома P450scc и терминатор. Затем данная кассета была встроена в вектор pGreen 0229, содержащий ген bar, кодирующий фермент фосфинотрицинацетил-трансферазу. В результате был создан вектор pGBP450f, который использовался в экспериментах по трансформации растений (рис.1).
Рис. 1. Схема конструкции pGBP450f: RB, LB - правая и левая границы Т-ДНК, Р450зсс - ген CYP11A1 цитохрома Р450 под 35S промотором, bar - ген фосфинотрицинацетилтрансферазы под nos промотором.
Также нами был сконструирован вектор pBIP450nptIIF, в котором селективный ген bar был заменен на ген nptII, кодирующий фермент неомицинфосфотрансферазу. Данный фермент обуславливает рост трансформантов на канамицине. К сожалению, в экспериментах по трансформации растений, с данными векторами нам не удалось получить трансгенные растения.
Были поставлены новые эксперименты с
использованием конструкции рСВ093 (рис. 2) и согласно модифицированной нами методике трансформации. Бинарный вектор pICH5290 служил реципиентом гена CYP11A1 и основой для генетической конструкции рСВ093. Для дизайна конструкции использовались компетентные клетки Esсhеrichia coli штамма L-I Blue (Stratagene). Для переноса данной кон -струкции в растения использовался штамм агробактерии GV3101.
RB
35S pro P450scc
LB
35S term
Nos pro
bar
Nos term
Рис. 2. Схема конструкции рСВ093, использованной для трансформации: RB, LB - правая и левая границы Т-ДНК, Р450зсс - ген CYP11A1 цитохрома Р450зсс под 35S промотором, bar - ген фосфинотрицинацетилтрансферазы под nos промотором.
Щелочное выделение плазмидной ДНК, рестрикция, лигирование, элетрофорез, выделение ДНК из геля, очистка ее, бактериальная трансформация, коньюгация с помощью трех-родительского скрещивания осуществлялись общеизвестными методами [9].
Ночную культуру Лgrobacterium tumefaciens рСВ093 (штамм 0У3101) наращивали в 20 мл жидкой среды ЬВ [10], дополненной 50 мг/л карбеницилина и 100 мг/л рифампицина, на качалке (180 об/мин) в течение 24 часов при 24°С в темноте. Затем агробактериальную суспензию разбавляли в 3 раза жидкой безгормональной средой МБ и инкубировали в тех же условиях в течение 3-4 часов. Полученную суспензию использовали для инфицирования.
Лgrobacterium tumefaciens-опосредованная трансформация рапса. В экспериментах по трансформации использовали листья 3-4-недельных растений, выращенных в асептических условиях (температура 24°С, освещенность 4000 - 5000 люкс при 16/8 (свет/ темнота) фотопериоде. За 3-4 суток до инфицирования экспланты насекали скальпелем и помещали для инициации каллуса на поверхность агаризованной среды МБ , дополненной 2 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л НУК, 0,1 мг/л БАП и 0,1 мг/л кинетина (среда I, табл.1). Кроме того, среда I содержала 1 г/л тиосульфата натрия в качестве агента, увеличивающего восприимчивость растительных тканей к агробактерии и таким образом повышающего эффективность трансформации [11]. В подготовленной агробактериальной
суспензии экспланты нарезали на сегменты размером приблизительно 0,3-0,5*0,3-0,5 см и выдерживали, периодически перемешивая, в течение получаса. Затем, подсушив фильтровальной бумагой, переносили их в те же чашки Петри, где проходило прекультивирование. Со-культивирование продолжалось в течение двух суток на свету в условиях термальной комнаты [12]. После этого экспланты отмывали от избытка агробактерий жидкой средой II, подсушивали и переносили на агаризованную среду II (табл.1) с тиосульфатом серебра (5 мг/л) и цефотаксимом (500 мг/л) для элиминации бактерий и роста каллуса. Через 5-7 суток культивирования в условиях термостата (24°С) их пассировали на среду того же состава, но с добавлением 5 мг/л фосфинотрицина (РРТ) в качестве селективного агента. Формирование каллуса при этом продолжалось на рассеянном свету в течение последующих 7 - 10 дней. Для регенерации использовали среду МБ с добавлением 2 мг/л БАП, 1 мг/л зеатина, 1 мг/л АБК, 1 мг/л НУК и 1 мг/л ГК (среда III, табл.1), 250 мг/л цефотаксима и 5 мг/л РРТ. Спустя ещё 3 недели сформировавшиеся зеленые побеги пересаживали на безгормональную среду МБ, дополненную 5 мг/л РРТ, а остальные каллусы пассировали снова на регенерационную среду того же состава. Полученные растения выращивали на безгормональной агаризован-ной среде МБ с 10 мг/л РРТ. Формирование корней проходило в этих условиях без дополнительной инициации (рис. 3).
Рис. 3. Регенераты рапса на морфогенной среде.
Таблица 1
Состав сред, использованных в экспериментах по трансформации рапса
Среда*
Компоненты,
мг/л I II III
сахароза 30 000 30 000 10 000
инозитол 300 300 100
гидролизат казеина 300 300 -
2,4-Д 2 2 -
НУК 1 1 1
кинетин 0,1 0,1 -
БАП 0,1 0,1 2
АБК - - 1
зеатин - - 1
ГК - - 1
тиосульфат Na 1000 - -
*Основой являлась среда MS.
Молекулярно-генетический анализ. Тотальную ДНК предположительно трансгенных растений выделяли из листовой ткани с помощью набора реагентов К0512 (Fermentas) по методике изготовителя. Интеграцию чужеродных генов в растительный геном определяли с помощью ПЦР. Объем смеси для амплификации одного образца составлял 25 мкл, в него входили следующие реагенты: 100-200 нг ДНК, 2,5 мкл 10Х буфера с NH4SO4 фирмы "Fermentas ", 2,5мкл 10мМ смеси нуклеотидов (dNTP) " Fermentas", 2 мкл 25 мМ MgCL2" Fermentas", 2,5 мкл каждого из праймеров, 0,2 мкл 0,5 ед. Taq ДНК-полимеразы " Fermentas", 10,7 мкл H2O. Для идентификации присутствия целево-
го гена CYP11A1 цитохрома Р450бсс использовали праймеры 5'-§ссаса1:с§а§аасйсса§аа§-3' и 5'-с1§§1§1§§ааса1сА£1а§ас§-3', амплифицирую-щие фрагмент величиной 502 пн. Амплификацию проводили в амплификаторе «БюКаё» с использованием следующих профилей: денатурация - 94оС 4 мин; отжиг праймеров - 94оС 30 сек; 58оС 30 сек; 72оС 45 сек, 30 циклов; ренатурация - 72оС 5 мин; 4оС ю мин. Продукт реакции разделяли в 1% агарозном геле с бромистым этидием в электрическом поле с помощью камеры для горизонтального электрофореза фирмы «БюКаё». Фрагмент после электрофореза визуализировали с помощью системы ВюЯаё СеЮос2000 (рис. 7).
Результаты и обсуждение
Из литературы известно, что цитохром Р450бсс синтезируется в цитоплазме клеток животных в виде белка-предшественника, который имеет молекулярную массу 54,5 кДа и содержит на К-конце своей полипептидной цепи экстрапептид из 39 аминокислотных остатков. Экстрапептид обуславливает транспорт цитохрома в митохондрии, где он подвергается протеолитическому процессингу, приобретая размер зрелой формы (49 кДа) и функциональную активность [6].
Было показано также, что синтезированный
in vitro P450scc с собственным экстрапептидом может импортироваться в изолированные растительные клетки [13].
Использованные нами векторы содержат кДНК гена CYP11A1 длиной 2754 п.н., коди -рующую белок-предшественник цитохром P450scc из коры надпочечников быка с лидер-ным N-концевым экстрапептидом. Наряду с геном CYP11A1 в векторы pGBP450f и рСВ093 введен также ген bar под nos промотором. Ген кодирует фермент фосфинотрицинацетил-трансферазу (РАТ), который ацетилирует сво-
бодную КН2-группу фосфинотрицина (РРТ), и таким образом, предотвращает токсичность гербицидов «Баста» и «Биалофос» для растений. Успешный рост растений на среде с фос-финотрицином означает, что ген bar находится в геноме растений и синтезирует фермент, разрушающий токсин фосфинотрицин [14].
В опыте по агробактериальной трансформации рапса сорта Магнат конструкцией рВ1-Р450пр1ИР, содержащей кассету 358-Р450+ген прШ, не удалось получить трансформанты (табл. 2). В качестве эксплантов в данном опыте использовались 5-7-дневные семядольные листочки - котиледоны (рис. 5).
Рис. 5. Экспланты рапса - семядоли.
В ходе данного опыта были получены зеленые, альбиносы, а также мозаичные растения. Отбор и укоренение данных регенерантов велся на средах, содержащих селективный агент
канамицин в концентрации 35 мг/л. Для инициации процессов ризогенеза у регенерантов в среду для укоренения добавлялась индолил-масляная кислота в концентрации 3 мг/л.
Таблица 2
Опыт по трансформации рапса конструкцией pBIP450nptIIF
Опыт, контроль Кол-во чашек, шт. Кол-во эксплантов, шт. Кол-во каллусов, шт. Кол-во регенерантов (кол-во событий/кол-во реген./укор. реген.), шт./шт./шт. Частота регенерации, %
№1 14 14 7/7/7 50%
контроль №2 11 11 5/5/5 45,45%
№3 12 12 8/8/8 66,66%
№1 8 8 3/2(аль.)/0 -
№2 10 10 6/3(аль.)+6/0 -
№3 10 10 8/5(ал.)+4/0 -
№4 8 8 7/4(ал.)/0 -
№5 11 11 5/4(ал.)+2/0 -
опыт №6 10 10 7/6(ал.)+2/0 -
№7 11 11 7/7(аль.)/0 -
№8 10 10 8/8(аль.)/0 -
№9 6 6 3/3(аль.)/0 -
№10 8 8 2/2(моз.) -
№11 9 9 6/2(аль.)+2(моз.)/0 -
№12 8 8 4/4(аль.)/0 -
№13 8 8 3/4(аль.)/0 -
При дальнейшем культивировании на средах сами, что свидетельствует об отсутствии или с канамицином в концентрации 35мг/л зеленые недостаточной экспрессии гена неомицинфос-и мозаичные растения становились альбино- фотрансферазы (пр^Т) (рис. 6).
Рис. 6. Регенерант-альбинос (опыт) и зеленое растений (контроль).
В результате экспериментов по агробактериаль- ний рапса, которые росли в условиях селективного ной трансформации сортов Магнат и Мария кон- давления фосфинотрицина, из них 23 линии на струкцией рСВ093 были получены 31 линия расте- сорте Мария, 8 линий - на сорте Магнат (табл. 3).
Таблица 3
Молекулярно-биологический анализ регенерированных линий рапса, полученных в результате Agrobacterium Ште/аЫет-опосредованной трансформации
с использованием вектора рСВ093
Сорт Линия Характеристика линий
Устойчивость к РРТ ПЦР
\irD1 Ьаг сур11А1
Мария Вп12/93/1 + - + +
Вп12/93/2 + - + +
Вп12/93/7 - - - -
Вп12/93/8 - - - -
Вп12/93/10 + - + +
Вп12/93/11 + - + +
Вп12/93/12 + - + +
Вп12/93/14 + - + +
Вп12/93/15 + - + +
Магнат Вп9/93/2 + - + +
Вп9/93/3 + - + +
Вп9/93/6 + - + +
Вп9/93/9 + - + +
Вп9/93/13 + - + +
Вп9/93/14 + - + +
Вп9/93/19 + - + +
Вп9/93/21 + - + +
Доказательства встройки генов bar и CY-P11A1 детектировали ПЦР анализом. Отсутствие агробактериальных генов Vir- района в геноме трансформантов определяли методом ПЦР со специфическими праймерами к бак-
териальному гену virD1 (табл. 3).
На рисунке 7 представлена электрофо-реграмма ПЦР анализа тотальной ДНК трансгенных растений рапса сортов Мария и Магнат.
Щыштшштшшшшшшттт
1 2 3 4 Б 6 7 В Э 10 11 12 13 14 15 16 17 13 19 20
Рис. 7. ПЦР анализ трансгенных линий рапса с праймерами, комплементарными гену CYP11A1 цитохрома P450SCC: 1 - маркер молекулярной массы 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas), 2 - положительный контроль ДНК плаз-миды рСВ093, 3-10 -трансгенные линии сорта Магнат, 11-16 - трансгенные линии сорта Мария, 17-18 -ДНК контрольных растений, 19 - смесь реагентов ПЦР без ДНК, 20 - Н2О.
Интеграция гена CYP11A1 показана во всех линиях сорта Магнат и произвольно выбранных линиях сорта Мария. При амплификации с использованием праймеров 5'-§ссаса1;с§а§а-асйсса;аа;-3' и 5'-駧1§;1§§ааса1сй§1а§ас§-3' к гену CYP11A1 и последующим разделением в агарозном геле был получен фрагмент, соот-
ветствующий позитивному контролю (плаз-миде рСВ093) и теоретически ожидаемому размеру 520 пн. В негативном контроле (ДНК нетрансгенных растений) фрагмент отсутствовал. Следовательно, представленные данные свидетельствуют о присутствии гена CYP11A1 в геноме трансформантов Т0 поколения.
Заключение
Методом агробактериальной трансформации было получено 23 линии сорта Мария и 8 линий сорта Магнат. Доказано наличие встройки генов bar и CYP11A1 методом полимеразной цепной реакции, а также отсутствие бактериальных ге-
нов Vr-района, на примере гена virD1 в геноме трансформантов. В ходе дальнейшей работы нами предполагаются молекулярно-генетические, морфометрические исследования семенного материала растений Т0 поколения.
Список используемых источников
1. Adesnik M., Atchinson M. Genes of cytochrome P450 and their regylation // Critical Review Biochemistry. - 1986. - V. 19. - P. 247-305.
2. Yamanaka S., Suzuki E., Tanaka M. et al. Essessement of cytochrome P450 offers a usefull
plant species// Theoretical and Applied Genetics. - 2003. - V. 108, № 1-9. - P. 1-9.
3. Lindemann P., Lucner M. // Biosynthesis of pregnane derivatives in somatic embryons of Digitalis lanata // Phytochemistry. - 1997. -
tool for determining genetic diversity in higer V. 46. - P. 507-513.
4. Piccioni A., Dance R. and Alban C. The plant biotin synhase reaction. Indentification and characterization of essential mitochondrial accessory protein compartments // Journal of Biological Chemistry. - 2003. - V. 278, № 27. -P. 24906-24975.
5. Lino M., Nomura T., Tamaki Y. et al. Progesterone: its occurrence in plants and involvement in plant growth // Phytochemistry. 2007. -V. 68. - P. 1664-1673.
6. Спивак С.Г., Бердичивец И.Н., Ярмолинский Д.Г. Манешина Т.В., Шпаковский Г.В., Картель Н.А. Создание и характеристика трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.),экспрессирующих кДНК CY-P11A1 цитохрома P450SCC // Генетика, 2009, - Т. 45, № 9, с.1217-1224.
7. Inui H., Kodama T., Okhava Y. et al. Herbicide metabolisme and crosstolerance in transgenic potato plants coexpressing human CYP1A1, CY-P2B6 and CYP2C19 // Pesticide Biochemistry and Physiology. 2000. - V. 66. - P. 116-129.
8. Шпаковский Г.В., Спивак С.Г., Маза-ник С.Н., Ахрем А.А. Изучение структуры генов цитохрома P450XIAI их экспрессии в гетерологичных системах // Материалы II Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению «Генная и клеточная инженерия» (ноябрь-декабрь 1991 г.),
Пущино-на-Оке, 1992. - с. 58.
9. Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. - Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1989. - 1500 p.
10. Маниатис Т., Фрич Е.Ф., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир. - 1984. -521 с.
11. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - 15. -P. 473-497.
12. Zambre M., Terryn N., De Clercq J., De Buck S., Dillen W., van Montagu M., Van Der Straeten D., Angenon G. Ligth strongly promotes gene transfer from Agrobacterium tume-faciens to plant cells // Planta. - 2003 - 216. -P. 580-586.
13. Лузиков В.Н., Новикова Л.А., Спиридонова В.А. и др. Конструирование гетеро-логических митохондрий: импорт предшественника цитохрома P450SCC быка в растительные митохондрии // Биохимия 1994, - Т. 59, Вып. 7. - с.1098-1101.
14. Заяц А.И., Стехин И.Н., Путилина Н.В., Левченко Б.А. Клонирование гена устойчивости к гербициду биалафосу // Биополимеры и клетка. 1994. - Т. 10. № 3-4. - С. 84-88.
Дата поступления статьи 21 июля 2010 г.
