CC BY
76
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 10 No. 4 2014, pp. 85-97 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2014 by Shematorova, Slovokhotov, Khaliluev, Berdichevets, Baranova, Babak, Shpakovski, Spivak and Shpakovski
ORIGINAL ARTICLE
Mitochondria as a Possible Place for Initial Stages of Steroid Biosynthesis in Plants
1 1 2 3
Elena K. Shematorova , Ivan Yu. Slovokhotov , Marat R. Khaliluev ’ , Irina N. Berdichevets4,5, Ekaterina N. Baranova3, Olga G. Babak4, Dmitry G. Shpakovski1, Svetlana G. Spivak4,6, George V. Shpakovski1*
1 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow 117997, Russia
2 Russian Timiryazev State Agrarian University, Moscow 127550, Russia
3 All-Russia Research Institute of Agricultural Biotechnology, Russian Academy of Agricultural Sciences, Moscow 127550, Russia
4 Institute of Genetics and Cytology, National Academy of Sciences of Belarus, Minsk 220072, Belarus
5 K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences, Moscow 127276, Russia
6 Belarussian State Medical University, Minsk 220116, Belarus *E-Mail: [email protected]
Received November 7, 2014
With the aim of thorough comparison of steroidogenic systems of plants and animals, transgenic plants of Solanaceae family expressing CYP11A1 cDNA encoding cytochrome P450SCC of mammalian mitochondria were further analysed. Positive effect of CYP11A1 on resistance of the transgenic tobacco plants to the infection by fungal phytopathogene Botrytis cinerea was for the first time detected. Subtle changes in mitochondria of the transgenic Nicotiana tabacum plants expressing mammalian CYP11A1 cDNA were demonstrated by transmissive electron microscopy. Genetic determinants (cDNAs and genes) encoding main components of the electron transfer chain of plant mitochondria were for the first time cloned and characterized. It was established that plants from the Solanaceae family (tomato, tobacco and potato) contain two different genes with similar exon-intron structures (all contain 8 exons) encoding mitochondrial type ferredoxins (MFDX), and one gene for mitochondrial ferredoxin reductase (MFDXR). The results obtained point out on profound relatedness of electron transfer chains of P450-dependent monooxygenases in mammalian and plant mitochondria and support our previous findings about functional compatability of steroidogenic systems of Plantae and Animalia.
Key words: transgenic plants, Nicotiana tabacum L., Solanum lycopersicum L., Digitalis
purpurea L., CYP11A1, cytochrome P450scc, Botrytis cinerea, mitochondrial type plant ferredoxins (MFDX), progesterone, electron microscopy.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
86
Mitochondria as a Possible Place ...
ORIGINAL ARTICLE
Митохондрии как возможное место инициации синтеза стероидных гормонов в растениях
1 1 2 3
Е.К. Шематорова , И.Ю. Словохотов , М.Р. Халилуев ’ ,
И.Н. Бердичевец4,5, Е.Н. Баранова 3, О.Г. Бабак4,
Д.Г. Шпаковский1, С.Г. Спивак4,6, Г.В. Шпаковский1*
1 ФГБУН Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва 117997, Россия
2 ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, Москва
127550, Россия
3 ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, Москва 127550, Россия
4 ГНУ Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск 220072, Беларусь
5 ФГБУН Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН, Москва 127276, Россия
6 Белорусский государственный медицинский университет, Минск 220116, Беларусь
*E-Mail: [email protected]
Поступила в редакцию 7 Ноября 2014 г.
С целью сравнения стероидогенных систем растений и животных продолжен анализ трансгенных растений семейства Solanaceae, экспрессирующих кДНК гена CYP11A1, кодирующего у животных митохондриальный цитохром P450SCC. Показано положительное влияние CYP11A1 на устойчивость трансгенных растений табака к грибному фитопатогену Botrytis cinerea. Установлено резкое изменение структуры митохондрий трансгенных растений табака, что является первым свидетельством в пользу гипотезы о том, что начальные стадии синтеза стероидных гормонов могут происходить в растительных митохондриях. Впервые структурно охарактеризованы основные компоненты митохондриальной электронтранспортной цепи растений: клонированы и установлена структура кДНК и генов адренонодоксиноподобных ферредоксинов табака, томата и картофеля семейства Solanaceae. Установлено, что у растений этого семейства имеются два разных гена ферредоксинов митохондриального типа (MFDX1 и MFDX2), имеющие сходную экзон-интронную структуру и кодирующие предшественники адренодоксиноподобных белков, различающиеся прежде всего по структуре N-концевого участка белка (кодируется первым и вторым экзонами), соответствующего лидерному пептиду. Полученные результаты указывают на несомненное сходство электронтранспортных цепей P450-зависимых монооксигеназ в митохондриях животных и растений и ещё раз свидетельствуют о возможности совмещения стероидогенных систем Plantae и Animalia.
Key words: трансгенные растения, Nicotiana tabacum L., Solanum lycopersicum L.,
Digitalis purpurea L., CYP11A1, цитохром P450scc, Botrytis cinerea, растительные ферредоксины митохондриального типа (MFDX), прогестерон, электронная микроскопия.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
Shematorova et al.
87
В последнее десятилетие получен ряд основанный на применении генов белков
экспериментальных данных об определённой стероидогенеза животных, может привести к
структурной и функциональной консервативности созданию трансгенных растений, обладающих
путей биосинтеза биологически активных важными для сельского хозяйства свойствами, а в
стероидных соединений в растениях и у животных. случае лекарственных растений - свойствами,
Установлено, что основные стадии в процессах важными для производства медицинских
биосинтеза и метаболизма стероидных гормонов препаратов из растительного сырья. Не исключено
животных и брассиностероидов растений также и то, что культура тканей этих трансгенных
катализируют цитохромы Р450, в обеих системах растений может найти биотехнологическое
функционируют такие ферменты, как стероид-5а- применение для осуществления трансформации
редуктаза (5aR) и 3р-гидроксистероид- различных стероидных соединений или их
дегидрогеназа /Д5-Д4-изомераза (Зв-HSD). Также наработки.
убедительно доказано, что в растениях наряду с Ключевую роль в биосинтезе стероидных
брассиностероидами присутствуют такие гормонов животных играет цитохром P450scc (side-
стероидные гормоны животных, как прогестерон, chain-cleaving), который локализован во
17-гидроксипрогестерон, 16-дегидроксипрогесте- внутренней мембране митохондрий клеток
рон и андростендион (Simersky et al., 2009; Pauli et стероидогенных тканей и, с участием двух других
al., 2010). Пути биосинтеза этих соединений и их компонентов митохондриальной электрон-
роль в жизнедеятельности растений пока не транспортной цепи, адренодоксина и
изучены. На сегодняшний день установленным адренодоксинредуктазы, катализирует реакцию
является лишь то, что прогестерон выполняет отщепления боковой цепи холестерина с
важные функции в регуляции процессов роста и превращением его в прегненолон - общий
развития растений: например, экзогенный предшественник всех стероидных гормонов
прогестерон стимулирует рост и созревание животных. Несмотря на то, что похожий белок в
пыльцы растений табака (Ylstra et al., 1995). растениях пока не найден, известно, что в
Совокупность этих данных делает актуальным растениях рода наперстянка (Digitalis sp.), по-
создание и исследование трансгенных растений, видимому, также именно в митохондриях,
экспрессирующих гены стероидогенных белков происходит превращение холестерина в
животных. С одной стороны эти растения являются прегненолон (Lindemann & Luckner, 1997).
удобной моделью для изучения процессов MATERIALS AND METHODS
биосинтеза и функций стероидных гормонов Методы получения трансгенных растений с
животных в растениях. С другой стороны подход, помощью агробактериальной трансформации,
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
88
Mitochondria as a Possible Place ...
использованные нами в данной работе, были использовали методику, описанную нами ранее
подробно описаны в предыдущих публикациях для табака (Kartel et al., 2004), и представляющую
(Kartel et a/., 2004; Spivak et al., 2009; Khaliluev et собой модифицированную методику Эдвардса с
al2011). соавторами (Edwards et al., 1991), включающую
Тестирование трансгенных растений табака, дополнительную экстракцию фенолом.
содержащих кДНК гена CYP11A1, на устойчивость Суммарную РНК экстрагировали из
к грибному фитопатогену Botrvtis cinerea замороженных и гомогенизированных в жидком
проводили по методике, вкратце описанной нами азоте листьев растений с помощью TRIzol-метода
ранее (Kartel et al., 2004). В качестве тест-культуры (Invitrogen) и очищали с использованием набора
использовали фитопатогенный гриб вида Botrytis Qiagen RNeasy MinElute Cleanup kit (Qiagen).
cinerea, вызывающий серую гниль. В Синтез полноразмерных кДНК проводили по
провоцирующих условиях изолированные листья методу SMART (Zhu et al., 2001), используя
среднего возраста и одного размера помещали в систему гнездовых SMART-праймеров с
чашки Петри на фильтровальную бумагу, различающимися SfiI-сайтами (на 5'- и 3'-концах
увлажненную водой. По 10 мкл суспензии спор кДНК) и Long-Distance ПЦР-амплификацию для
возбудителя, содержащей 2000 спор/мл, наносили синтеза второй цепи и получения двухцепочечной
в 6 точек на лист, после чего чашки с листьями кДНК (Barnes, 1994).
герметично закрывали для создания повышенной Для биоинформационного поиска
влажности и выдерживали в климатокамере при последовательностей, предположительно
температуре 24°С и 16-ти часовом световом дне. В кодирующих близкие по структуре к
качестве контроля использовали листья адренодоксину (АDХ) и адренодоксинредуктазе
нетрансформированных растений и растений, (ADXR) белки из растений семейств Solanaceae
содержащих только векторную плазмиду (без (паслёновые) и Scrophulariaceae (норичниковые),
кДНК CYP11A1). Степень поражения листовых использовали подходы, описанные в монографии
пластинок (обратная величина по отношению к по биоинформатике растений из серии Methods in
устойчивости растения к Botrvtis cinerea) Molecular Biology (Edwards D., Editor, 2007). На
оценивалась в баллах по количеству и размеру основании этих данных были сконструированы
некротических пятен на 10-ые сутки после наборы маловырожденных праймеров и
заражения. олигонуклеотидных зондов для поиска
Клонирование кДНК и генов митохондриальных интересующих нас последовательностей в
ферредоксинов растений семейства Solanaceae. описанных выше препаратах геномной и
Для выделения тотальной геномной ДНК из комплементарной ДНК. В частности, для
листьев томата, картофеля и наперстянки клонирования кДНК томата, картофеля и табака,
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
Shematorova et al.
89
кодирующих ферредоксины митохондриального стандартной методике. Ультратонкие срезы
типа (MFDX) использовали праймеры oYSH16 (5'- толщиной 30-40 нм получали на ультрамикротоме
GACGAATTCCAAATGGTSGGNTTYCA) и oYSH17 LKB-V, монтировали на покрытые формваровой
(5'-CAGGATCCTCGAGCTARTGHGGYTTNGG). подложкой бленды, после чего контрастировали
Молекулярное клонирование полученных ПЦР- уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу
фрагментов, отбор и анализ клонов проводили с (Reynolds, 1963). Полученные препараты
помощью методов последовательных разведений просматривали на электронном микроскопе H-500
и/или гибридизации нуклеиновых кислот, (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 75
описанных нами ранее (Shpakovski & Lebedenko, кВ.
1997; Shpakovski & Shematorova, 1999). ДНК RESULTS AND DISCUSSION
секвенировали по методу Сэнгера на приборе ABI Ранее нами в рамках совместного проекта
3730 фирмы Applied Biosystems (Евроген, ИБХ учёных России и Беларуси были получены и
РАН). детально охарактеризованы трансгенные растения
Трансмиссионная электронная микроскопия. табака Nicotiana tabacum L. (в качестве удобного
Растительным материалом для исследований модельного объекта), экспрессирующие кДНК
служили асептические проростки Nicotiana CYP11A1 цитохрома P450scc из коры
tabacum cv. Petit Havana линии SR1 и полученные надпочечников быка (рис. 1) и обладающие
на основе этого сорта табака две трансгенные повышенной продуктивностью и устойчивостью к
линии (TR-2, TR-7) поколения Т4, грибным фитопатогенам (Shpakovski et al., 1992;
экспрессирующие кДНК гена CYP11A1 цитохрома Kartel et al., 2004; Kartel et al., 2007). Изучение
P450SCc, выделенную из коры надпочечников быка. четырёх поколений этих трансгенных растений
Фрагменты срединной части семядолей, показало, что они по сравнению с растениями
полученных от двухнедельных асептических дикого типа имеют сокращенный период
проростков, фиксировали при температуре +4 °С в вегетативного развития, выражающийся прежде
2,5% растворе глутарового альдегида на 0.1 М всего в раннем цветении и созревании семян (рис.
фосфатном буфере (рН 7.2) с добавлением 1.5% 2), увеличенную биомассу и повышенную
сахарозы. После отмывки от фиксирующей смеси продуктивность (количество и качество семян), а
растительный материал дофиксировали 1.0% также повышенный иммунитет к
раствором четырёхокиси осмия (ОsО4) (Sigma, неспецифическому патогену Паслёновых Botrytis
США), обезвоживали в этаноле повышающейся cinerea (рис. 3). В отличии от контрольных
концентрации (30, 50, 70, 96 и 100%), затем - в растений дикого типа в трансгенных растениях
окиси пропилена. Образцы заключали в смесь обнаружен прегненолон - продукт реакции,
эпоксидных смол Эпона-812 и Аралдита по катализируемой цитохромом P450SCC (CYP11A1).
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
90
Mitochondria as a Possible Place ...
Установлено, что содержание прогестерона в (например, на них приходится ~1% кодирующего
листьях трансгенных растений существенно (в потенциала арабидопсиса (Nelson et al., 2004)),
несколько раз) выше, чем в листьях растений существование митохондриальных цитохромов у
дикого типа (Spivak et a/., 2009; Spivak et a/., растений до сих пор не доказано. Тем не менее,
2010). основываясь на данных Лузикова с соавторами
Очень важным было определить точное место (Luzikov et al., 1994) о том, что незрелый цитохром
синтеза прегненолона и прогестерона в P450SCC из коры надпочечников быка
полученных нами трансгенных растениях табака. У импортируется в митохондрии растений, где
животных первые этапы синтеза стероидных приобретает размеры зрелой формы, аналогично
гормонов (отщепление боковой цепи холестерина с тому, как это происходит в митохондриях клеток
превращением его в прегормон прегненолон, и животных, при конструировании экспрессионного
далее - в прогестерон) происходят в растительного вектора мы использовали
митохондриях, на их внутренней мембране (Miller, полноразмерную последовательность кДНК
2013). Как отмечалось выше, именно там CYP11A1 длиной в 1754 п.о. (рис. 1), кодирующую
локализован цитохром P450SCC (CYP11A1) и белок-предшественник P450SCC из коры
именно туда доставляется субстрат холестерин. надпочечников быка с лидерным Л/-концевым
При этом именно перемещение холестерина с экстрапептидом (Shpakovski et al., 1992; Spivak et
наружной на внутреннюю мембрану митохондрий, al, 2009).
осуществляемое с помощью особой, Поскольку уникальный только для животных
многокомпонентной макромолекулярной машины ключевой фермент стероидогенеза CYP11A1
при активном участии белка StAR (steroidogenic функционирует в митохондриях вместе с FAD-
acute regulatory protein), является скорость- содержащим флавопротеидом ADXR
лимитирующей стадией в синтезе стероидных (адренодоксинредуктазой) и [2Fe-2S]-
гормонов у животных. ферредоксином ADX (адренодоксином), мы
В то же время, по всем имеющимся на изучили, какие белки выполняют функцию этих
сегодняшний день данным синтез партнёров цитохрома P450SCC в растениях. В
брассиностероидов (стероидных гормонов результате, впервые охарактеризованы основные
растений) происходит на мембранах компоненты митохондриальной электронтранс-
эндоплазматического ретикулума или, гораздо портной цепи растений: клонированы и
реже, на плазматической мембране растительных установлена структура кДНК и генов
клеток. Несмотря на то, что цитохромы P450 адренонодоксиноподобных ферредоксинов
представляют собой едва ли не самое обширное из табака, томата, картофеля из семейства
всех белковых семейств в протеомах растений Solanaceae и наперстянки Digitalis purpurea L.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
Shematorova et al.
91
(семейство Scrophulariaceae). Установлено, что у именно в митохондриях (накапливаясь в
растений из семейства паслёновых имеются два митохондриях растений и даже изменяя их
разных гена ферредоксинов митохондриального структуру). Эти данные - первое свидетельство
типа (MFDX1 и MFDX2), имеющие сходную экзон- того, что начальные этапы синтеза стероидных
интронную структуру (содержат по 8 экзонов) и гормонов могут происходить и в растительных
кодирующие предшественники адренодоксино- митохондриях. Будет интересно определить все
подобных белков (204-216 aa), различающиеся белки-участники этого процесса, в частности
прежде всего по структуре Л/-концевого участка истинные партнёры цитохрома P450SCC в клетках
белка (кодируется первым и вторым экзонами), растений.
соответствующего лидерному пептиду (рис. 4). Показанная нами на примере CYP11A1
Определена первичная структура кДНК и генов, функциональная совместимость стероидогенных
кодирующих белки NADPH-оксидоредуктазы систем Plantae и Animalia, открыла перспективу
(MFDXR) ЛюоНапа tabacum L., Solanum получать трансгенные растения с
lycopersicum L. и Solanum tuberosum L. (485 aa), комбинированными стероидогенными системами
структурно родственные ADXR животных. таких интересных с точки зрения сельского
Полученные результаты указывают на хозяйства, практической биотехнологии и/или
несомненное сходство электронтранспортных фармакологии видов, как томат, картофель и
цепей P450-зависимых монооксигеназ в наперстянка. Первичные трансгенные растения
митохондриях животных и растений. томата Solanum lycopersicum L. и наперстянки
Далее, с помощью электронной микроскопии на Digitalis purpurea L., экспрессирующие кДНК
ультратонких срезах листьев табака мы показали, CYP11A1 цитохрома P450SCC из коры
что в изучаемых нами трансгенных растениях надпочечников животных, уже получены нами
табака, экспрессирующих кДНК гена CYP11A1, методом агробактериальной трансформации (рис.
изменяется структурная организация митохондрий: 6). В настоящее время полученные независимые
они уменьшаются в размерах, теряют характерную трансгенные линии растений томата и наперстянки
округлую форму (становятся более овальными) и успешно адаптированы к почвенным условиям и
приобретают более плотную, гранулированную выращены в защищенном грунте; для некоторых
консистенцию (рис. 5). Это указывает на то, что первичных трансгенных линий томата получены
перенесённый нами в растения цитохром P450SCC плоды с жизнеспособными семенами (рис. 7).
животных, по-видимому, также функционирует
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
92
Mitochondria as a Possible Place ...
1 cagct gtgggggcag cATGCTAGCA AGGGGGCTTC CCCTCCGCTC AGCCCTGGTC
56 AAAGCCTGCC CACCCATCCT GAGCTCAGTG GGGGAGGGCT GGGGCCACCA CAGGGTGGGC
116 ACTGGAGAGG GAGCTGGCAT CTCCACAAAG ACCCCTCGCC CCTACAGTGA GATCCCCTCC
176 CCTGGTGACA ATGGCTGGCT TAACCTCTAC CATTTCTGGA GGGAGAAGGG CTCACAGAGA
236 ATCCACTTTC GCCACATCGA GAACTTCCAG AAGTATGGCC CCATTTACAG GGAGAAGCTT
296 GGCAATTTGG AGTCAGTTTA TATCATTCAC CCTGAAGACG TGGCCCATCT CTTCAAGTTC
356 GAGGGATCCT ACCCAGAGAG ATATGACATC CCGCCCTGGC TGGCCTATCA CCGATATTAT
416 CAGAAACCCA TTGGAGTCCT GTTTAAGAAG TCAGGAACCT GGAAGAAAGA CCGGGTGGTC
476 CTGAACACGG AGGTGATGGC TCCAGAGGCA ATAAAGAACT TCATCCCACT GCTGAATCCA
536 GTGTCTCAGG ACTTCGTCAG CCTCCTGCAC AAGCGCATCA AGCAGCAGGG CTCCGGAAAG
596 TTTGTAGGGG ACATCAAGGA AGACCTGTTT CACTTTGCCT TTGAGTCCAT CACCAATGTC
656 ATGTTTGGGG AGCGCCTGGG GATGCTGGAG GAGACAGTGA ACCCCGAGGC CCAGAAGTTC
716 ATTGATGCCG TCTACAAGAT GTTCCACACC AGTGTCCCTC TGCTCAACGT CCCTCCAGAA
776 CTGTACCGTC TATTCAGAAC CAAGACTTGG AGGGACCATG TAGCCGCATG GGACACAATT
836 TTCAATAAAG CTGAAAAATA CACTGAGАТС TTCTACCAGG ACCTGAGACG GAAAACAGAA
896 TTTAGGAATT ACCCAGGCAT CCTCTACTGC CTCCTGAAAA GTGAGAAGAT GCTCTTGGAG
956 GATGTCAAGG CCAATATTAC GGAGATGCTG GCAGGGGGTG TGAACACGAC ATCCATGACA
1016 TTGCAATGGC ACTTGTACGA GATGGCACGC AGCCTGAATG TGCAGGAGAT GCTGCGGGAG
1076 GAGGTTCTGA ATGCCCGACG CCAGGGAGAG GGAGACATAA GCAAGATGCT GCAAATGGTC
1136 CCACTTCTCA AAGCTAGCAT CAAGGAGACG CTGAGACTCC ACCCCATCTC CGTGACCCTG
1196 CAGAGATACC CTGAAAGTGA CTTGGTTCTT CAAGATTACC TGATTCCTGC CAAGACACTG
1256 GTGCAAGTGG CCATCTATGC CATGGGCCGA GACCCTGCCT TCTTCTCCAG TCCGGACAAG
1316 TTTGACCCAA CCAGGTGGCT GAGTAAAGAC AAAGACCTCA TCCACTTCCG GAACCTGGGC
1376 TTTGGCTGGG GAGTGCGGCA GTGCGTGGGC CGGCGGATCG CCGAGCTGGA GATGACCCTC
1436 TTCCTCATCC ACATTCTGGA GAACTTCAAG GTTGAAATGC AGCATATCGG TGACGTGGAC
1496 ACCATATTCA ACCTCATCCT GACGCCGGAC AAGCCCATCT TCCTTGTCTT CCGCCCCTTC
1556 AACCAGGACC CGCCCCAGGC GTGAccggag agggcgggca ctgccctttc caccaatcca
1616 gctagctggg gtgtgggaag acggcccgag ggggtggggc catggaggta cccgcacctc
1676 cattgctcgc tcagtccaca cctcttgcac ctttctggct aggtctgacc agatgaagct
1736 ggcactcagg ggtcagctg
Рисунок 1. Нуклеотидная последовательность полноразмерной кДНК гена CYP11A1 из коры надпочечников быка, использованная нами при создании рекомбинантных плазмид для её экспрессии в растениях. Подчёркнуты стартовый (ATG) и терминирующий (TGA) кодоны и выделенный помимо этого ещё и жирным шрифтом кодон ATC, кодирующий первую аминокислоту (Ile) зрелого белка - цитохрома P450scc.
Рисунок 2. Динамика образования семенных коробочек у трансгенных растений табака поколения Т3. CYPL1-CYPL4 - независимые линии трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК CYP11A1; К1 - контрольные растения дикого типа, pGl -растения, трансформированные вектором, не содержащим кДНК CYP11A1.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
Shematorova et al.
93
Рисунок 3. Результаты биотеста на устойчивость трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК гена CYP11A1, к грибному фитопатогену Botrytis cinerea (а - поражение листа). 1 - контрольное нетрансгенное растение (поражение листа в 7 баллов); 2 - растение одной из трансгенных линий (поражение листа в 1 балл).
S1-MFDX1 :
MVGFHVRRLAHRLTRSSISALLLHDSASAAHVSLLKVGSRSYNTAAKNRIRDLFFSNCSNATSP CNPGTSYGPLSRYQILLGLGHKEYCTTTGNEEKQTISVTFVDKDGEEKHIKVPVGMSLLEAAHE NDIELEGACEGSLACSTCHVIVMDVDQYWKLEDPTDEENDMLDLAFGLTETSRLGCQVIAKPEL DGIRVALPAATRNFAVDGFKPKPH (216 аа)
S1-MFDX2:
MVGFQNLRLAHRLTGYVSRSTCELLLKIGCRGYCTEISNRVRNLFPLNYISAPLACIPRTSYTD LLRYSSTQGLRHEQFCTTAGNEEMQKISVTFVDKDGEENHIKVPVGMSMLEAAHENDIELEGAC EASLACSTCHVIVMDMEYYNKLEDPTDEENDMLDLAFALTDTSRLGCQVIAKPELDGIRLALPV ATRNFAVDGYKPKPH (207 аа>
Nt-MFDXl :
MVGFHVLRAARRLARCSLSSLLLRGSPSAFGSFLKVGCRRYNTSTRNRAGVLFPSNSLNALSAC TSETSHYPLSRYHFLQRHEQYCTAAGNEEKQTISVTFVDKDGEEKHIKVPVGMSMLEAAHENDI ELEGACEGSLACSTCHVIVMDVDYYWKLEDPTDEEWDMLDLAFGLTETSRLGCQVIAKPELDGL RLALPAATRNFAVDGYEPKPH (213 aa)
Nt-MFDX2 :
MVGFHVIRIARRFARCSAFGSFLKVGCRSYNTATRNRAGVLFPSNSLWALLACTSGTSHDPLSR CHFSRVLRHEQYCTTAGNEEKQTISVTFVDKDGEEKHIKVPVGMSMLEAAHENDIELEGACEGS LACSTCHVIVMDVDYYNKLEDPTDEENDMLDLAFGLTETSRLGCQVIAKPELDGLRLALPAATR NFAVDGYKPKPH (204 aa)
St-MFDXl :
MVGFHVRRLAHSLTRSSLSSLLLHDSASAAHVSLLKVGSRSYNTAAKNRIRGLFPSNCSNAISP CTPGTSYGPLSRYQILLGLRHKEYCTTTGSEEKQTISVTFVDKDGEEKHIKVPVGMSLLEAAHE NDIELEGACEGSLACSTCHVIVMDVDQYNKLEDPTDEENDMLDLAFGLTETSRLGCQVIAKPEL DGIRVALPAATRNFAVDGFKPKPH (216 aa)
St-MFDX2 :
MVGFHNLRLAHRLTGCSLSSLLLHGSASTCELSLKVGCRSYCTGTSNRVRNLFPLNYISAPLAC IPRTSYTHLLRYSSTQGLRHEQFCTTAGNEGEQKISVTFVDKDGEENHIKVPVGMSMLEAAHEN DIELEGACEASLACSTCHLIVMDMEYYNKLEDPTDEENDMLDLAFALTDTSRLGCQVIAKPELD GIRLALPVATRNFAVDGYKPKPH (215 aa)
Рисунок 4. Аминокислотные последовательности митохондриальных ферредоксинов (MFDX) томата (Sl), картофеля (St) и табака (Nt), выведенные нами из установленных первичных структур впервые клонированных и секвенированных полноразмерных кДНК соответствующих генов. Sl - Soianum iycopersicum, Nt - Nicotiana tabacum, St - Soianum tuberosum.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
94 Mitochondria as a Possible Place ...
Рисунок 5. Ультраструктурная организация фрагментов клеток губчатой (А, В, Д) и столбчатой (Б, Г, Е) паренхимы семядольного листа растений дикого типа (А, Б) и трансгенных линий табака TR-2 (В, Г) и TR-7 (Д, Е), экспрессирующих кДНК CYP11A1 цитохрома P450scc из коры надпочечников быка. Обозначения: М - митохондрия, Хл -хлоропласт, В - вакуоль, Я - ядро. Масштабная линейка - 0,5 мкм.
Рисунок 6. Регенерация растений наперстянки Digitalis purpurea L. на среде, содержащей селективный агент - канамицин. А - экспланты листьев растений исходного (дикого) типа. Б - экспланты листьев растений, подвергнутых агробактериальной генетической трансформации.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
Shematorova et al.
95
Рисунок 7. Плоды со зрелыми семенами первичных трансгенных растений томата Solanum lycopersicum L. (сорт Рекордсмен), экспрессирующих кДНК гена CYP11A1 из коры надпочечников быка (линия 7, растение 2 [трансгенная линия 7-2]).
ACKNOWLEDGMENT
Данная работа осуществлялась в рамках совместного российско-белорусского
исследовательского проекта при финансовой поддержке Российского (РФФИ) и Белорусского республиканского (БРФФИ) фондов
фундаментальных исследований.
REFERENCES
Barnes W.M. (1994) PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2216-2220.
Edwards D., Editor (2007) Plant Bioinformatics (Methods and Protocols) [From: Methods in Molecular Biology (J.M. Walker, Series Editor)] -Totowa, New Jersey.: Humana Press, 552 pp.
Edwards K., Johnstone C., Thompson C. (1991) A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research, 19, 1349.
Kartel N.A., Shpakovski G.V., Spivak S.G., Brichkova G.G., Yarmolinsky D.G., Berdichevets I.N., Maneshina N.V. (2004) Recombinant plasmid pGBP450f for construction of transgenic plants and the approach for generation of transgenic
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
96
Mitochondria as a Possible Place ...
tobacco plants with higher productivity and resistance to fungal phytopathogens: Patent of the Russian Federation No. 2237717. Bulletin of Innovations 2004. No. 10. (Application No. 2002134424. Priority from December 20, 2002. Registered October 10, 2004).
Kartel N.A., Spivak S.G., Shpakovski G.V., Maneshina N.V., Brichkova G.G., Yarmolinsky D.G., Berdichevets I.N. (2007) Gene engineering construct expressing cDNA of the mammalian CYP11A1 gene in plants and the approach for generation of transgenic plants with higher productivity and resistance to phytopathogens: Patent of the Republic of Belarus No. 9201. (Application No. а20021122. Priority from December 30, 2002. Registered January 25, 2007).
Khaliluev M.R., Mamonov A.G., Smirnov A.N., Kharchenko P.N., Dolgov S.V. (2011) Expression of genes encoding chitin-binding proteins (PR-4) and hevein-like antimicrobial peptides in transgenic tomato plants enhanced resistance to Phytophthora infestans. Russ. Agricult. Sci., 4, 297-302.
Lindemann P., Luckner M. (1997) Biosynthesis of pregnane derivatives in somatic embryos of Digitalis lanata. Phytochemistry, 46, 507-513.
Luzikov V.N., Novikova L.A., Spiridonova V.A., Isaeva L.V., Whelan J., Hugosson M., Glazer E. (1994) Design of heterologous mitochondria: import of cattle cytochrome P-450SCC precursors in plant mitochondria. Biochemistry (Moscow)
[Biokhimiia], 59, 1098-1101.
Miller W.L. (2013) Steroid hormone synthesis in mitochondria. Molecular and Cellular Endocrinology, 379, 62-73.
Nelson D.R., Schuler M.A., Paquette S.M., Werck-Reichhart D., Bak S. (2004) Comparative genomics of rice and arabidopsis. Analysis of 727 cytochrome P450 genes and pseudogenes from a monocot and a dicot. Plant Physiology, 135, 756-772.
Pauli G.F., Friesen J.B., Godecke T., Farnsworth N.R., Glodny B. (2010) Occurrence of progesterone and related animal steroids in two higher plants. Journal of Natural Products, 73, 338-345.
Reynolds E.S. (1963) The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol., 17, 208-212.
Shpakovski G.V., Lebedenko E.N. (1997) Molecular cloning and characterization of cDNA of the rpc10+ gene encoding the smallest subunit of nuclear RNA polymerases of
Schizosaccharomyces pombe. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 23, 441-448.
Shpakovski G.V., Shematorova E.K. (1999) Rpc19 and Rpc40, two alpha-like subunits shared by nuclear RNA polymerases I and III, are interchangeable between the fission and budding yeasts. Current Genetics, 36, 208-214.
Shpakovski G.V., Spivak S.G., Mazanik S.N., Akhrem A.A. (1992) Study of cytochrome P450XIA1 genes structure and their expression in geterologous systems. Proceedings of the II
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
Shematorova et al.
97
(Second) All-Union Plan-Report Conference on the direction ’’Genetic and Cellular Engineering” (November-December 1991, Pushchino-on-Oka), 58-59.
Simersky R., Novak O., Morris D.A., Pouzar V., Strnad M. (2009) Identification and quantification of several mammalian steroid hormones in plants by UPLC-MS/MS. Journal of Plant Growth Regulation, 28, 125-136.
Spivak S.G., Berdichevets I.N., Litvinovskaya R.P., Drach S.V., Kartel N.A., Shpakovski G.V. (2010) Some peculiarities of steroid metabolism in transgenic Nicotiana tabacum plants bearing the CYP11A1 cDNA of cytochrome P450SCc from the bovine adrenal cortex. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 36, 224-232.
Spivak S.G., Berdichevets I.N., Yarmolinsky D.G., Maneshina N.V., Shpakovski G.V., Kartel N.A. (2009) Construction and characteristics of transgenic tobacco Nicotiana tabacum L. plants expressing CYP11A1 cDNA encoding cytochrome P450SCC. Russian Journal of Genetics, 45, 1067-1073.
Ylstra B., Touraev A., Brinkmann A.O., Heberle-Bors E., Tunen A. (1995) Steroid hormones stimulate germination and tube growth of in vitro matured tobacco pollen. Plant Physiology, 107, 639-643.
Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. (2001) Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques, 30, 892-897.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
