CC BY
13Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского Серия «Биология, химия». 2007. Том 20 (59). № 1. С. 157-162.
УДК 577. 2:616-006
ВПЛИВ САЛ1ЦИЛАТУ I ДИОКСИХОЛАТУ НАТР1Ю НА Р1ВЕНЬ ЕКСПРЕСП Б1ЛК1В ТЕПЛОВОГО ШОКУ HSP70 i HSP90 У КУЛЬТУР1 КЛ1ТИН
РАКУ ШЛУНКА ЛЮДИНИ Мандрик С.Я., Сидорик Л.Л., Погрiбний П.В., Остапченко Л.1.
На сьогодшшнш день недостатньо вивчена участь бшюв теплового шоку у захиси слизово! оболонки щлунка, зокрема, при дп нестеро!дних протизапальних препараив (ацетилсалщилово! кислоти, шдометацину), жовч^ а, також, за умов розвитку рiзноманiтних патологiй органiв шлунково-кишкового тракту. На кттинах раку шлунка дослщжено експресiю бiлкiв теплового шоку Hsp70 i Hsp90 за умов дп салiцилату i диоксихолату. Встановлено, що на 2-, 7- i 18-ту години рiвень експресп Hsp70 в клтнах AGS пiдвищувався, тодi як рiвень експресп Hsp90 залишався в межах контрольних значень. Показано шдукуючий вплив салщилату i диоксихолату натрто на експресiю бiлка Hsp70. Ключов1 слова: салщилати, диоксихолат натрiю, бшки теплового шоку, рак шлунку.
ВСТУП
Молекулярш шаперони Hsp70 i Hsp90 вдаграють в кл1тинах важливу роль, беручи безпосередню участь у процесах фолдингу новосинтезованих бшюв. Окрш процесс фолдингу, даш бшки задшш у багатьох шших процесах у кл!тин!. Так, бшок Hsp70 забезпечуе транспорт молекул новосинтезованих бшюв в окрем1 компартменти кттини, зокрема, в м^охондрп, бере участь у регуляцп процесс апоптозу, вщграе важливу роль у деградацп кттинних бшюв денатурованих тд впливом р^номаштних стресових фактора [1 - 3]. Щодо бшка Hsp90, то, зпдно з лгтературними даними, в!н е шапероном рецептора стеро'дних гормошв. Окрш цього, роль бшка Hsp90 у процесах сигнально! трансдукцп кл!тини шдтверджуеться його участю у фолдингу ряду юназ. Бшки Hsp70 i Hsp90, як i вс! бшки теплового шоку, належать до бшюв, р1вень експресп, яких зростае в умовах стресу спричиненого р^номаштними факторами як зовшшнього, так i внутршнього середовища оргашзму [1]. Вщомо, що Hsp70 i Hsp90, беруть участь у захисп слизово! оболонки шлунка в!д дп оксидант1в, нестеро'дних протизапальних засоб1в, етанолу. Проте, до юнця роль цих бшюв у шдтриманш ц!л!сност! слизово! оболонки шлунка i кишковика не з'ясована [4 - 6].
Метою нашо! роботи було дослщити вплив салщилату натрда i диоксихолату натрда на експресда бшюв Hsp70 i Hsp90 в кл1тинах раку шлунка людини.
МАТЕР1АЛ I МЕТОДИ
В дослщах використали л!н!ю ракових кл!тин шлунка людини AGS (отриману з банку кл!тин 1нституту експериментально! патолог!!, радюбюлогп i онколог!! НАН Укра'ни). Кл!тини вирощували при 37°С у середовищ! DMEM (Sigma-Aldrich), що м!стило 10 % сироватки велико! рогато! худоби (Gibco BRL, Великобританш), в атмосфер! 5 % СО2. Для культивування використовували пластиков! флакони
(Nunc, Дашя). При дослщженш впливу салщилату натрда i диоксихолату натрда на píbhí експреси Hsp70 i Hsp90, клiтини AGS вирощували до 100 % моношару, за добу до дп стресу змiнювали середовище на свiже, в якому здшснювали вплив стресу на клиини.
Препарат Hsp90, очищеного з мозку бика, люб'язно надано проф. Я. Кузницьким (1нтернацюнальний iнститут молекулярно! i кл^инно1 бюлогн, Варшава, Польща). Полiклональнi антитiла проти DnaK (прокарютичний аналог еукарiотичного Hsp70) люб'язно надано проф. Н. Пфаннером (Ушверситет м. Фрайбурга, Гермашя). Полiклональнi анти-Hsp90 антитша одержано, як описано в робот [7].
Для приготування лiзатiв клiтин використовували буфер, який мютив 20 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 % Triton X-100 i iнгiбiтори протеаз. Зразки гомогенiзували в буферi та центрифугували протягом 25 хв при 1300g при температурi +4°С. Визначення концентрацп бiлка за методом Бредфорд проводили зпдно з методикою описаною ранiше
з деякими модифiкацiями [8].
Електрофорез отриманих лiзатiв клiтин проводили у градieнтi концентрацп ПААГ (7-22%) в денатуруючих умовах по Laemmli [9]. Форез проводили в трю-глщиновому буферi (рН 9,2-9,5) при напрузi 10-20 В/см [9].
1муноблотинг отриманих проб проводили за описаним методом [10]. Для електропереносу бшюв використовували мембрани штроцелюлози (HybondTM-c super, Велика Бриташя). Електроперенос здiйснювали в камерi для електропереносу (B 2157, Sigma, США), у спещальному середовищi, яке мютило 25 мМ Tris, 192 мМ глщину i 20 % метанолу, за умов 30 V 12-14 годин з використанням джерела постшного струму ПЕФ-3 (СРСР).
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
У проблемi з'ясування причин i механiзмiв розвитку певних типiв хронiчного гастриту людини важливу роль вiдiграють експериментальнi моделi, а також результати дослщжень, якi проводяться на культурах клiтин шлункового, чи кишкового походження. Слiд зазначити, що, вiдповiдно до ново! класифшацп хрошчних гастритiв ("Сщнейська система"), поряд з вщносно поширеними НР-залежним i ауггамунним гастритами, видiляють також рефлюкс-гастрит [11]. До рефлюкс-гастриту був вщнесений i хрошчний гастрит (ХГ), який виникае на грунтi прийому нестеро!дних протизапальних засобiв, зокрема, ацетилсалщилово1 кислоти i li похiдних [11, 12, 13]. Роль бшюв теплового шоку в умовах розвитку рефлюкс-гастриту, як i шших форм ХГ, залишаеться до кшця нез'ясованою. Ранiше нами було показано, що шд час розвитку експериментального хрошчного атрофiчного гастриту (ХАГ) у щурiв, експресiя бiлкiв Hsp70 i Hsp90 в парiетальних кл^инах пiдвищуеться вже на 1-ший тиждень розвитку патологи.
Дослiдження експресil бшка Hsp70 у клiтинах AGS за дп СЦ (в концентрацiях
3 5 7 5 7 9
10- , 10- i 10- М) i ДОХ (в концентращях 10- , 10- i 10- М), показало, що рiвень експресil Hsp70 пiдвищувався приблизно у 1,5-2 рази порiвняно з контролем при дп СЦ (рис. 1). Збiльшення рiвнiв експресil Hsp70 в клiтинах шд впливом СЦ в вищепоказаних концентращях не залежало вщ часу шсля д^' стресу на клiтини. Таким чином, як видно з Рис. 1, а, рiвень експреси Hsp70 за дп СЦ зростае протягом перших двох годин шсля дп стресу i залишаеться стабшьно високим до 18-то1 години iнкубацil кл^ин з СЦ.
К 10'3 10'5 10'7 К 10'3 10'5 10'7 К 10'3 10'5 10'7 2 години 7 годин 18 годин
а
2 години 7 годин 18 годин
б
Рис. 1. Експреая Hsp70 в кттинах AGS за умов ди стресових чинникiв: (а) - салiцилату натрда i (б) диоксихолату натрiю.
Схожа часова i концентрацiйна залежнiсть piBmB eKcnpecii' Hsp70 в клiтинах AGS спостер^алась i при дп ДОХ (рис. 1, б). Рiвeнь експресп Hsp70 пiдвищувався на 2~, 7~ i 18~ту години стресу спричиненого впливом ДОХ в концeнтрацiях 10'5 i 10'7 М. ДОХ в концентраци 10'9 М, як i СЦ в концентраци 10'7 М, не змшювали рiвeнь експресп Hsp70 в порiвняннi з контролем (рис. 1).
З лтературних джерел вщомо, що тривале вживання нестеро!дних протизапальних засобiв викликае появу eрозiй i гeморагiй слизово! оболонки шлунка. Прийом протягом року ацетилсалщилово! кислоти, li похiдних, зокрема, iндомeтацину, iбупрофeну та шших лiкувальних засобiв у середшх терапевтичних дозах супроводжуеться закономiрною появою eрозивно-гeморагiчних змiн слизово! оболонки шлунка у 85 % хворих [11]. Вщомо, що салiцилова кислота може безпосередньо пошкоджувати клiтини слизово! оболонки шлунка. Дiя диоксихолату дещо схожа на дда жовчних кислот [12]. Таким чином, результати по тдвищенню експресп Hsp70 за умов дi! СЦ та ДОХ в ракових кл^инах AGS можуть вказувати на участь даного бшка у захисп клгтин слизово! оболонки шлунка в умовах розвитку рефлюкс'гастриту.
У клiтинах eукарiот е два основних бiлка теплового шоку з молекулярною масою близько 70 кДа - це конститутивний бшок Hsp73 (Hsc70) i iндуцибeльний Hsp72 (Hsp70). Численними дослiджeннями як на тваринах, так i на культурах кл^ин шлунка i кишковика, показано, що обидва бiлки вiдiграють важливу роль у захистi слизово! оболонки шлунково~кишкового тракту вiд дi! несприятливих факторiв [1, 4, 5, 6]. Зокрема, рiвнi eкспрeсi! Hsp73 i Hsp72 в клiтинах слизово! оболонки шлунка, яю росли в культур^ пiдвищувались у вiдповiдь на дда оксидантiв (пероксиду водню, диамiду), етанолу, а, також, при шдвищенш температури живильного середовища до 43° С. Вщомо, що в iндукцi! транскрипци гeнiв, якi кодують бiлки Hsp72 i Hsp73, в стресових умовах бере участь транскрипцшний фактор HSF1. Зпдно з даними лiтeратури, активащя HSF1 в
клггинах слизово! оболонки шлунка в умовах шдвищення температури живильного середовища до 43° С вщбуваеться вже через 15 хвилин i досягае максимальних значень на 30-ту хвилину вiд початку дп стресу. Натомiсть, рiвень мРНК iндуцибельного бiлка Hsp72, за даних стресових умов, зростав на 30-ту хвилину i досягав максимальних значень в кшщ першо! години вiд початку стресу. Проте, вже на 2-гу годину рiвень мРНК Hsp72 рiзко знижувався i на 4-ту годину майже не iдентифiкувався, як i в контрольних клiтинах [4]. Нами було показано, що рiвень експресп Hsp70 в клiтинах AGS шсля стресу СЦ i ДОХ зростав на 2-гу годину, що узгоджуеться з лтературними даними (рис. 1). Високий рiвень експресп Hsp70 пiсля дп СЦ i ДОХ в концентращях 10-3, 10-5 i 10-5, 10-7 М, вiдповiдно, збер^ався впродовж 18 годин вiд початку стресу. Беручи до уваги лтературш данi по динамiцi рiвня мРНК Hsp70, можемо припустити, що основна кшьюсть бiлка Hsp70 в умовах дп стресорних факторiв (СЦ i ДОХ) в клiтинах слизово! оболонки шлунка синтезуеться протягом перших двох годин вщ початку стресу. Проте, очевидно, це потребуе подальших дослщжень.
К 10-3 10-5 10-7 К 2 години 10-3 10-5 10-7 К 10-3 10-5 10-7 7 годин 18 годин а
--------- ■—i
К 10-5 10"7 10"У К 10-5 10-7 10"У К 10-5 10-7 10"У
2 години 7 годин 18 годин
б
Рис. 2. Експреая Hsp90 в клггинах AGS за умов дп стресових чинникiв: (а) - салiцилату натрiю i (б) - диоксихолату натрда.
Сьогоднi практично не з'ясованою е роль бiлка Hsp90 у захист клiтин слизово! оболонки шлунка i кишковика в розвитку хрошчного гастриту й iнших захворювань шлунково-кишкового тракту дослiджена набагато гiрше шж роль бiлка Hsp70. Вiдомо, як i для Hsp70, що рiвень експресi! Hsp90 в клiтинах слизово! оболонки шлунка зростае у вщповщь на шдвищення температури живильного середовища (для культури кттин), а, також, на дда ряду речовин, зокрема, етанолу, пероксиду водню, диамiду та шших [1, 46].
Нами було дослщжено рiвень експресi! Hsp90 в клiтинах AGS за умов стресу спричиненого дiею СЦ i ДОХ (рис. 2). Показано, що даний показник не змшювався. Отримаш результати дозволяють припустити, що шаперон Hsp90 може вiдiгравати менш значиму роль у захисп ракових кл^ин шлунка вiд дi! салiцилату i диоксихолату, нiж Hsp70.
ВИСНОВКИ
Таким чином, нами було показано, що рiвнi експресп Hsp70 у клiтинах раку шлунка шдвищуеться при дi! салiцилату в концентращях 10'3 i 10'5 М i диоксихолату в концентращях 10'5 i 10'7 М. Збiльшeння рiвня eкспрeсii Hsp70 спостeрiгалось на 2', 7' i 18' ту години вiд початку стресу. На вщмшу вiд Hsp70, рiвeнь eкспрeсi! Hsp90 не змшювався в умовах стресу спричиненого дiею салiцилату i диоксихолату. Отриманi експериментальш данi дозволяють припустити, що бшок Hsp70 задiяний у захистi клггин AGS вiд дi! дослiджуваних стресорних факторiв.
Список лiтератури
1. Fink A.L. Chaperone'mediated protein folding // Phys. Rev.- 1999.- Vol. 79, №2.- P. 425'449.
2. Oksala N.K.J., Oksala A., Paavonen T., Alhava E., Paimela H. Heat shock preconditioning modulates proliferation and apoptosis after superficial injury in isolated guinea pig gastric mucosa via an eicosanoid and protein synthesis'dependent mechanism // APMIS.' 2003.' Vol. 111. ' P.497'506.
3. Eggers D.K., Welch W.J., Hansen W.J. Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells // Moll. Biol. Cell. ' 1997.' Vol. 8. ' P. 1559'1573/
4. Rokutan K. Gastric mucosal protection and cell proliferation. Role of heat shock proteins in gastric mucosal protection // J. Gastroenterol. Hepatol.' 2000.' Vol. 15.' P.12'19.
5. Tsukimi Y., Nakai H., Itoh S., Amage K., Okabe S. Involvement of heat shock proteins in the healing of acetic acid'induced gastric ulcers in rats // J. Physiol. Pharmacol. ' 2001.' Vol. 52, №3.' P. 391'406.
6. Tsukimi Y., Okabe S. Recent advances in gastrointestinal pathophysiology: role of heat shock proteins in mucosal defense and ulcer healing // Biol. Pharm. Bull. ' 2001.' Vol. 24, №1. ' P.1'9.
7. ^пустян Л.Н., Киямова Р.Г., Гришкова В.С., Терентьев А.Г., Филоненко В.В., Сидорик Л.Л. Получение рекомбынантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс'реактивность с Hsp60 // Биополимеры и клетка. ' 2006. ' Т.2, №22. ' С. 117'120.
8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantities of utilizing the principle of protein binding // Anal. Biochem. ' 1976.' Vol. 86. ' P. 193'200.
9. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4 // Nature.- 1970.' 227, №52. ' P.680'685.
10. Avrames S., Termynck T. Monoclonal IgG and autoantibodies obtained after polyclonal activation, show reactivities similar to those of polyclonal natural autoantibodies // Mol. Immunol.' 1993.' Vol. 30.' P. 119'127.
11. Григор'ев П.Я., Стародуб С.М., Яковенко Е.П., Гаврилюк М.С., Шостак С.С. Хвороби оргашв травлення ^агностика i лжування) // Тернопшь, "Укрмедкнига"' 2000. - 220 с.
12. Wang L.'J., Chen S.J., Chen Z., Cai J.'t., Si J.'M. Morphological and pathologic changes of experimental chronic atrophic gastritis (CAG) and regulating mechanism of protein expression in rats// J. Zhejiang Univ. SCIENCE B' 2006.' № 7(8).' P. 634'640.
13. Fox J.G., Wang T.C. Inflammation, atrophy, and gastriccancer // J. Clin. Inv.' 2007.' Vol. 117, №1.' P. 60'69.
14. Ciocca D.R., Calderwood S.K. Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications // Cell Stress Chaperones.' 2005.' № 10(2).' Р. 816'103.
Мандрык С.Я., Сидорик Л.Л., Погребной П.В., Остапченко Л.И. Влияние салицилата и диоксихолата на урони экспрессии белков Н8Р70 и Н8Р90 в культуре клеток рака желудка человека //
Ученые записки Таврического национального университета имени В.И. Вернадского. - 2007. - Серия «Биология, химия». - Т. 20 (59), № 1. - Р. 157-162.
До сих пор очень мало известно о роли белков теплового шока в защите слизистой оболочки желудка, особенно, в условиях действия нестероидных противовоспалительных препаратов (ацетилсалициловой кислоты, индометацина), желчи, а, также, в условиях развития различных заболеваний желудочно-кишечного тракта. В данной работе мы использовали клетки рака желудка человека как модель для изучения уровней експрессии белков №р70 и №р90 в условиях действия салицилата и диоксихолата. Уровень экспрессии
Hsp70 в клетках AGS повышался на 2-, 7- и 18-тый час стресса. В отличие от Hsp70, уровень экспрессии белка Hsp90 в данных стрессовых условиях не менялся. Таким образом, показано индуцирующее влияние салицилата и диоксихолата на экспрессию белка Hsp70.
Ключевые слова: салицилаты, диоксихолат натрия, белки теплового шока, рак желудка.
Mandryk S., Sidorik L., Pogrebnoy P., Ostapchenko L. Influence of salicilate and deoxyholate on HSP70 and HSP90 expression level in human gastric cancer cell cultures // Uchenye zapiski Tavricheskogo Natsionalnogo Universiteta im. V.I. Vernadskogo. Series "Biology, chemistry". - 2007. - Vol. 20 (59), № 1. - P. 157-162.
It is still little known about precise role of Hsp in gastric mucosa, especially upon action of nonsteroidal antiinflammatory drugs (acethylsalicylate, indomethacin), bile, as well as during different stomac disorders. In our work human gastric cancer cells were used in order to elucidate Hsp70 Hsp90 expression levels upon salicylate and deoxyholate influence. It was observed increasing in Hsp70 expression in cells which were stressed by salicylate and deoxyholate on 2-, 7- and 18-th hours of stress. However, there were no changes in Hsp90 expression patterns upon these stress conditions. So, it is obviously that salicylate and deoxyholate induce Hsp70 expression.
Keywords: salicilate, deoxyholate, heat shock proteins, gastric cancer.
