CC BY
53Фізика живого, Т. 20, No1, 2012. С 45-49.
© Собко В.М., Мартинюк В. С., Артеменко О.Ю
УДК 577.3
ВПЛИВ МАГНІТНОГО ПОЛЯ НАДНИЗЬКОЇ ЧАСТОТИ НА ВНУТРІШНЬОКЛІТИННУ КОНЦЕНТРАЦІЮ ІОНІВ КАЛЬЦІЮ В ТИМОЦИТАХ ЩУРА ЗА УМОВ ПЕРОКСИД-ІНДУКОВАНОГО УШКОДЖЕННЯ
Собко В.М., Мартинюк В.С., Артеменко О.Ю.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, ННЦ «Інститут біології» e-mail: svitya@ua.fm; mavis@science-center.net
Надійшла до редакції 12.05.2012
В даній роботі ми досліджували модулюючий вплив магнітного поля наднизької частоти на дію пероксиду водню. Для цього визначали концентрацію цитоплазматичного кальцію у тимоцитах щура. Для оцінки зміни внутрішньоклітинної концентрації кальцію [Ca2+]i було використано двохвильовий метод реєстрації зміни флуорисценції індо-1. Отримані дані свідчать, що магнітне поле наднизької частоти спричинює збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію як самостійно, так і у комплексі із пероксидом водню, що в свою чергу може призводити до активації важливих медіаторів апоптичних процесів, таких як CaMKII та JNK, і, таким чином, сприяє запуску апоптозу.
Ключові слова: апоптоз, магнітне поле наднизької частоти, іони кальцію, пероксид водню.
ВСТУП
В сучасному світі ми постійно контактуємо з електромагнітними полями наднизької частоти, а тому дослідження даного питання є як ніколи актуальним. Вплив електромагнітних полів так званих «промислових» частот (50-60 Гц), як правило стосується людей, котрі по роду своєї діяльності постійно знаходилися під вищевказаним впливом, і, як наслідок, у них розвиваються різні захворювання, в основі патогенезу яких лежить порушення гомеостазу іонів кальцію. Під дією електромагнітних полів змінюється концентрація кальцію в крові, серцевому м'язі, міжклітинній рідині, відбуваються зрушення в процесах згортання й фібринолізу. У цих умовах істотно зростає частота гіпертонічних кризів й інших серцево-судинних ускладнень [1]. Відомо, що кальцій [Ca2+]i є вторинним посередником, а також універсальним іоном сигналізації, що регулює різноманітні клітинні функції та є одним із ключових елементів апоптичних сигнальних шляхів. Під час ранніх та пізніх стадій апоптозу спостерігається підвищення рівня внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію, які, в свою чергу, вважаються активаторами ЖК та СаМКІІ, важливих медіаторів апоптичних процесів. ЖК сигнальний шлях є ключовим модулятором загибелі клітин, опосередкованої активними формами кисню та азоту
[2,3].
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Моделлю для дослідження впливу магнітного поля наднизької частоти (МП ННЧ) на процеси, спричинені дією пероксиду водню (0,1 мМ), обрано суспензію свіжоізольованих тимоцитів. Тимоцити отримували з тимусу щурів лінії Вістар масою 120150 г, котрі утримувались на стандартному раціоні віварію. Виділений тимус перетирали через ситечко із синтетичного волокна (0 = 0,1 мм) в буферному розчині наступного складу (г/л): NaCl - 6,796; KCl -0,274; CaCl2 - 0,288; NaHCO3 - 2,091; KH2PO4 -
0,299; MgSO4 - 0,144; глюкоза - 1,8; (pH 7.4). Кількість клітин підраховували за допомогою світлового мікроскопа у камері Горяєва з використанням барвника (0,4 % р-н трипанового синього).
Інкубацію тимоцитів (50*106 кл/мл) здійснювали у водному термостаті при 37°С в стаціонарному середовищі RPMI-1640 з додаванням 2,05 мМ глутаміну. Інкубація проводилася протягом 3 годин.
Отриману суспензію тимоцитів навантажували індо-1\АМ (вихідний розчин індо-1 1мМ в ДМСО). Кінцева концентрація індо-1\АМ в середовищі навантаження становила 5 мкМ. Також додавався Pluronic F-127 (0,05% в середовищі навантаження) для покращення розчинення індо-1\АМ. Клітини навантажувались індо-1 протягом 30 хв. при температурі 37°С. Після навантаження клітин
Собко В.М., Мартинюк В.С., Артеменко О.Ю.
центрифугуванням (3 рази), тимоцити відмивались від зовнішнього індо-1.
Реєстрація спектрів кальцієвих зондів індо-1 в суспензії тимоцитів проводилась на
спектрофлуориметрі СДЛ-2. Флуоресценцію індо-1 збуджували при довжині хвилі Х3б=350 нм та реєстрували під кутом 90° до променя збуджуючого світла в 1 см кюветі в спектральному інтервалі від 360 нм до 600 нм з кроком 0,5 нм на монохроматорі флуоресценції. Концентрація індо-1 в розчинах мала величину 5 мкМ. Спектри записувались та зберігались в ASCII кодах з можливістю подальшої обробки за допомогою спеціалізованого програмного
забезпечення.
З огляду на певні недоліки у спектрофлуориметрі СДЛ-2 використовували, раніше розроблені
Семеновим Ю. І. та іншими, удосконалену апаратно-програмну частину спектрофлуориметра та цифровий метод зменшення впливу флуктуацій збуджуючого випромінювання, який є модифікацією методів усереднення фотоструму [4].
Метод полягає в автономному регулюванні тривалості часових інтервалів інтегрування фотоструму відповідно до змін інтенсивності збуджуючого випромінювання. Реєстрація спектрів флуоресценції зондів здійснюється шляхом перетворення величини інтенсивності кожної поточної спектральної складової у відповідний цифровий код, який реєструється за допомогою цифрового реєструючого пристрою. При цьому кванти флуоресценції за допомогою фотоелектронного помножувача (ФЕП)
перетворюються в стохастичну послідовність одноелектронних імпульсів, які підсилюються та нормалізуються по амплітуді.
Зв’язування іонів Са2+ флуоресцентними зондами (індо-1) значно змінює їхні спектри флуоресценції, що дозволяє за допомогою спеціальних флуоресцентних установок визначити концентрацію [Са2+]1. Для цього використовується двохвильовий метод реєстрації. Реєструється двохвильовий параметр R=I1/I2, де І1 та І2
- інтенсивність флуоресценції на двох довжинах хвиль Х1 та Х2 відповідно. У традиційних установках
••• гл 2+ • ?
реєстрації Са -сигналів нервових чи м язових клітин проводиться через вимірювання параметру R, коли по черзі світло флуоресценції проходить через два світлофільтри з Х1 та Х2, які розміщені на диску, що швидко обертається.
Клітинні суспензії піддавали впливу МП ННЧ, яке створювали за допомогою кілець Гельмгольца. Імпульси були прямокутної форми та різної полярності. Частота магнітного поля складала 8 Гц, індукція - 25 мкТл. Частота магнітного поля вибрана на основі її екологічної та геофізичної значущості [5,6]. Вектор індукції створюваного магнітного поля був паралельним вектору геомагнітного поля.
Досліджувані зразки розміщували в кільця Гельмгольца. Контрольні проби знаходились в умовах фонових значень електромагнітного поля наднизьких частот, характерних для даної лабораторії (20-65 нТл). Для оцінки можливого впливу різниць у рівні фонових магнітних полів в місцях розташування дослідних та контрольних зразків проводили експерименти з псевдовпливом магнітного поля. В цьому випадку досліджувані зразки поміщали в кільця Гельмгольца, не піддаючи дії магнітного поля.
Статистичну обробку результатів здійнювли згідно загальноприйнятих алгоритмів авріаційної статистики, для оцінки рівню значущості різниць між вибірками використовували ^крітерій Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Щоб охарактеризувати вплив МП ННЧ та дію пероксиду водню, ми визначали концентрацію цитоплазматичного кальцію у тимоцитах щура. Для оцінки зміни внутрішньоклітинної концентрації кальцію [Са2+]1 було використано двохвильовий метод реєстрації зміни флуорисценції індо-1.
На кінетичних кривих зміни двохвильового параметра R, що прямо пропорційно залежить від концентрації вільних іонів кальцію, можна побачити, що вплив МП ННЧ на суспензію тимоцитів щура спричинює достовірне зростання параметру R (рис.1), що свідчить про збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію на 62% (р<0,05).
Потрібно відмітити, що рН є одним з
найважливіших параметрів, які суттєво впливають на біологічні процеси. рН нижче 7,4 як правило, є стресорним фактором, а як відомо, МП посилюють клітинну відповідь в умовах ненормального
середовища (простого розчину хлориду натрія) [7].
Провівши ці ж дослідження при значенні рН 7,0, що є неприроднім середовищем для тимоцитів, ми спостерігали подібні ефекти МП ННЧ, як і при рН=7,4, але процеси відбувалися з різною
динамікою. Добре видно, що потрапляння тимоцитів в більш кисле середовище спричиняє повільну спонтанну кальцієву відповідь, чого не
спостерігається при рН 7.4. Водночас з цим, на кінетичних кривих двохвильового параметра R можна побачити, що вплив МП ННЧ на суспензію тимоцитів щура спричинює значне зростання параметру R на 13 % (р<0,05), приблизно після шести хвилин впливу, та виходить на плато приблизно на дванадцятій хвилині (рис.2).
Час, хв
Час, хв
R
R
Рис. 1. Динаміка двохвильового параметра R (зонд індо-1) в тимоцитах. Примітки: Розчин Кребса (2,5 ммоль/л CaCl2); t=220С; рН=7,4.
Як видно з рис. 1., додавання H2O2 до суспензії тимоцитів щура спричинює зростання параметру R на 36 % (р<0,05), а в комбінації із впливом МП ННЧ цей ефект значно посилюється ще на 8 % (р<0,05).
При чому параметр R, що виражає
зміни при впливі МП ННЧ досягає свого максимального значення Rmax після приблизно 25 хв, а параметр R, що виражає зміни при комбінованій дії Н202 з МП ННЧ досягає свого максимального значення Rmax після приблизно 16 хв.
Час, хв
Час, хв
Рис. 2. Динаміка двохвильового параметра R (зонд індо-1) в тимоцитах. Примітки: Розчин Кребса (2,5 ммоль/л CaCl2); t=220С; рН=7,0.
Як видно з рис. 2, додавання H2O2 до суспензії тимоцитів щура призводить до зростання параметру R на 5 % (р<0,05), а в комбінації із впливом МП ННЧ цей ефект значно посилюється ще на 7 % (р<0,05). Кінетичні криві, які виражають зміни двохвильового параметру R при досліджуваних впливах, мають виглад сигмоїдних кривих з плато. При чому параметр R, що виражає зміни при впливі МП ННЧ досягає свого максимального значення Rmax після приблизно 13 хв, а параметр R, що виражає зміни при впливі H2O2 та комбінованій дії H2O2 з МП ННЧ досягає свого максимального значення Rmax після приблизно 25 хв.
Важливим залишалося виявити та дослідити можливий механізм активації апоптозу при дії досліджуваних факторів. Ми припустили, що таким механізмом активації апоптозу може бути кальцій-залежний механізм. Тому для того, щоб охарактеризувати модулюючий вплив магнітного поля наднизької частоти на дію пероксиду водню, ми визначали концентрацію цитоплазматичного кальцію у тимоцитах щура. Для оцінки зміни внутрішньоклітинної концентрації кальцію [Ca2+]1 було використано двохвильовий метод реєстрації зміни флуорисценції індо-1.
Собко В.М., Мартинюк В.С., Артеменко О.Ю.
Таблиця 1
Величина А [Са2+]і при дії H2O2 та модифікуючому впливі МП ННЧ, зміна за весь період часу експозиції.
Фактори впливу A [Ca2+]I (нмоль/л)
рН=7,4 рН=7,0
Контроль 193,26 ± 9,47 239,56 ± 8,84
МП ННЧ 312,4 ± 13,29 278 ± 14,62
<N О <N К 465,96 ± 11,93 312,4 ± 12,73
H2O2 та МП ННЧ 496,7 ± 23,75 374,18 ± 9,86
На кінетичних кривих зміни двохвильового параметра R можна побачити, що вплив МП ННЧ на суспензію тимоцитів щура спричинює значне зростання параметру R (Рис.1.), який прямо пропорційно відображає збільшення
внутрішньоклітинної концентрації кальцію.
Як видно з рис. 1., додавання Н202 до суспензії тимоцитів щура спричинює зростання параметру R, а в комбінації із впливом електромагнітного поля наднизької частоти цей ефект значно посилюється. Провівши ці ж дослідження при значенні рН 7,0, ми спостерігали такі ж загальні ефекти МП ННЧ, як і при рН=7,4, але процеси відбувалися з різною динамікою.
Використавши вище описані закономірності за отриманими значеннями параметру R було
розраховано цитозольний [Са2+]1 в контрольній
суспензії тимоцитів та в тимоцитах при дії досліджуваних факторів, коли параметр досягав максимального значення Rmax ([Са2+] тах). З отриманих даних обчислювали збільшення концентрації кальцію А [Са +]1 при дії Н202 та МП ННЧ, а також при комбінації впливу цих факторів (Таб. 3.2). Як видно з даних таблиці, вплив МП ННЧ спричинює значне
зростання концентрації внутрішньоклітинного
кальцію, особливо за нормального фізіологічного значення рН. Також варто відмітити, що при комбінованому впливі МП ННЧ та пероксиду водню спостерігається збільшення концентрації кальцію, в порівнянні з впливом лише пероксиду водню, це може свідчити про те, що дія МП ННЧ модифікує ефект, спричинений пероксидом водню.
Важливо відмітити, що використана концентрація пероксиду водню хоча і, можливо, здатна до окиснення ліпідів мембрани, не призводить до зміни проникності цитоплазматичної мембрани для кальцію, а отже зростання концентрації іонів кальцію [Са2+]1 в цитозолі відбувається не тільки за рахунок дифузії іонів кальцію з позаклітинного простору, а ще також і внаслідок виходу цього іону з внутрішньоклітинних депо, як відповідь на певний фактор впливу. Дослідження зміни флуоресценції індо-1 проводилися
протягом 25 хвилин, оскільки за цей час двохвильовий параметр R досягає свого максимального значення [4].
ВИСНОВКИ
Вплив МП ННЧ призводить до збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію як при наявності H2O2, посилюючи його ефект на суспензію тимоцитів, так і в розчині без H2O2. Варто відмітити, що така дія, спричинена МП ННЧ, спостерігається при невеликих відхиленнях рН, та процес збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію відбувається із різною динамікою. Таким чином, отримані дані свідчать, що МП ННЧ спричинює збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію як самостійно, так і у комплексі із H2O2 (де ефект значно посилюється), що в свою чергу може призводити до активації важливих медіаторів апоптичних процесів, таких як CaMKII та JNK, і, таким чином, сприяє запуску апоптозу.
Література
1. Келеджиєва Е.В. Кальцієвий гомеостаз і порушення фібринолізу у метеолабільних хворих на гіпертонічну хворобу літнього та старечого віку: Дисертаційна робота на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук: 14.01.11; Захищена 29.09.2008. - Сімферополь, 2008. - 131 с.
2. Olofsson M.H. Charting calcium-regulated apoptosis pathways using chemical biology: role of calmodulin kinase II / M.H. Olofsson, A.M Havelka, S. Brnjic [et al.] // BMC Chemical Biology. - 2008. - Vol.8, №2. - P. 134-137.
3. Harr M.W. Apoptosis and Autophagy: Decoding Calcium Signals that Mediate Life or Death / M.W. Harr, C.W. Distelhorst // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 2010. - Vol.3, № 1. -P.25-31.
4. Артеменко А.Ю. Вплив пероксиду водню на концентрацію кальцію в тимоцитах щура: Дисертаційна робота на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук: 03.00.02; Захищена 04.09.2006. - Київ, 2006. - 127 с.
5. Мартынюк В.С., Темурьянц Н.А., Владимирский БМ. У природы нет плохой погоды: космическая погода в нашей жизни. - Киев: Издатель В.С. Мартынюк, 2008. - 179 с.
6. Пресман А. С. Электромагнитные поля и живая природа. -М.: Наука, 1968. - 288 с.
7. Schlegel K. Weltweite Ortung von Blitzen: 50 Jahre SchumannResonanzen / K. Schlegel, M. Füllekrug // Physik in unserer Zeit.
- 2002. Vol.33, № 6. - P.256-261.
ВЛИЯНИЕ МАГНИТНОГО ПОЛЯ СВЕРХНИЗКОЙ ЧАСТОТЫ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ КОНЦЕНТРАЦИЮ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ТИМОЦИТАХ КРЫСЫ ПРИ ИХ ПЕРОКСИД-ИНДУЦИРОВАННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ
Собко В.Н., Мартынюк В.С., Артеменко А.Ю.
В данной работе мы исследовали модулирующее влияние магнитного поля сверхнизкой частоты на действие перекиси водовода. Для этого определяли концентрацию цитоплазматического кальция в тимоцитах крысы. Для оценки изменения внутриклеточной концентрации кальция [Ca2] был использован двухволновой метод регистрации изменения флуорисценции индо-1. Полученные данные свидетельствуют, что магнитное поле сверхнизкой частоты вызывает увеличение внутриклеточной концентрации кальция как самостоятельно, так и в комплексе с пероксидом водорода, что в свою очередь может приводить к активации важных медиаторов апоптических процессов, таких как CaMKII и JNK, и, таким образом, способствует запуску апоптоза.
Ключевые слова: апоптоз, магнитное поле сверхнизкой частоты, ионы кальция, пероксид водорода.
INFLUENCE OF OF EXTREMELY LOW FREQUENCY MAGNETIC FIELD ON INTRACELLULAR CALCIUM ION CONCENTRATION IN THYMOCYTES OF RATS UPON PEROXIDE-INDUCED DAMAGE
Sobko V.M., Martyniuk V.S., Artemenko O.Yu.
In this study we investigated the modulating effect of the magnetic field of low frequency on hydrogen peroxide action. To achieve this goal we determined cytoplasmic calcium concentration in rat thymocytes. To estimate changes of intracellular calcium [Ca2+]i concentration we used two-wave method for detecting fluorescent changes of indo-1. These data suggest that low frequency magnetic field causes an increase in intracellular calcium concentration, both independently and in combination with hydrogen peroxide, which in turn can lead to activation of the important mediators of apoptotic processes such as CaMKII and JNK, and thus contributes to launch apoptosis.
Key words: apoptosis, extremely low frequency magnetic field, calcium ions, hydrogen peroxide.
