CC BY
46КЛІТИННА БІОФІЗИКА
Фізика живого, Т. 16, No2, 200S. С.21-24. © Гребіник Д. М., Матишевська О.П.
CELL BIOPHYSICS
УДК 577.342.45:61
АКУМУЛЯЦІЯ КАЛЬЦІЮ МІТОХОНДРІЯМИ НА РАННІХ ЕТАПАХ АПОПТОЗУ ТИМОЦИТІВ ЩУРА
Гребіник Д. М., Матишевська О.П.
Київський національний університет імені Тараса Шевченко E-mail: grebinik@yahoo.com
Надійшла до редакції 12.11..2008
Досліджено параметри функціонування Са2+-транспортних систем мітохондрій тимоцитів у контролі і на ранніх етапах апоптозу, індукованого перекисом водню у кінцевій концентрації 0,1 мМ. Показано зниження Са2+-акумулюючої здатності мітохондрій, а також зміна кінетичних параметрів накопичення кальцію цими органелами на ранніх етапах після дії Н2О2. Припускається, що можливою причиною виявлених ефектів є порушення бар’єрної функції і селективної проникності мітохондріальних мембран.
Ключові слова: мітохондрії, апоптоз, , кальцій, перекис водню.
ВСТУП
Останнім часом все більшу увагу дослідників привертає дослідження механізмів так званого безрецепторного апоптозу - каспазо-залежної форми загибелі, яка індукується без участі рецепторів клітинної смерті на плазматичній мембрані [1-3]. Дана форма апоптозу включає в себе стадії, які характеризуються втратою мітохондріями їх фізіологічної функціональної активності, підвищенням проникності
мітохондріальних мембран, порушенням регуляції Са2-транспортних процесів, роз’єднанням окислення і фосфорилювання, і, як наслідок, підвищеною продукцією активних форм кисню (АФК) та окисним стресом цих органел [1,2]. Вважається, що мітохондріальна стадія є важливою для подальшого розвитку апоптозу, оскільки результатом порушення структури мітохондрій (так званого набухання) є вихід з них у цитозоль цілої низки апоптогенних факторів [3,4].
У якості об’єкту досліджень нами було обрано ізольовані тимоцити щура, оскільки раніше нами було показано, що під впливом 0,1 мМ пероксиду водню у цих клітинах виявляються типові ознаки апоптозу, а саме - ДНК, виділена з ядер тимоцитів через 3 год інкубації клітин з пероксидом, зазнає міжнуклеосомної фрагментації за типом „1adder-райет” [5]. Також нами було виявлено, що за дії пероксиду водню концентрація вільного цитозольного кальцію у тимоцитах зростає вже через 2 год інкубації клітин і досягає
максимального значення через 3 год, перевищуючи контрольне значення майже у 6 разів. [5].
Враховуючи вищенаведене, основними задачами даної роботи було оцінити акумуляцію Са2+ мітохондріями та визначити кінетичні параметри функціонування мітохондріальної Са2 -транспортної системи у контролі та за дії Н2О2 на моделі пермеабілізованих дигітоніном тимоцитів щура.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Тимоцити отримували з тимусу щурів лінії Вістар вагою 120-150 г. Тимус перетирали через нейлонове сито в буфер А, що містив (мМ): Ка2НР04 х 12Н20 -
3, КС1 - 5, №С1 - 120, глюкоза - 10, НБРБ8 - 5, №НС03 - 4, MgC12 - 1 и СаС12 - 1. Кількість життєздатних клітин визначали у камері Горяєва з використанням 0,2%-го трипанового синього.
Інкубацію тимоцитів (2-4 х 106 клітин/мл) проводили у термостаті у середовищі ЯРМІ-1640. Після осадження ( 600g, 10 хв) клітини переводили у буфер А.
Накопичення Са2+ мітохондріями оцінювали ізотопним методом, інкубуючи тимоцити ( 1 х 107 клітин) за 370 С середовищі об’ємом 0,5 мл, що містило 15 мкМ дігітонін для подолання бар’єрної функції плазматичної мембрани, а також 20 мМ НБРБ8, 125 мМ КС1, 3 мМ MgCl2, 3 мМ АТФ, 10 мкМ 40СаС12 + 1 мкКи 45СаС12 (АшегеЬаш), 2 мМ К+-фосфатний буфер (рН = 7,4), 3 мМ сукцинат
Гребіник Д. М., Мат шевська О.П.
натрію, а також 100 нМ тапсигаргін для попередження накопичення катіону в ЕПР.
Реакцію зупиняли швидкою фільтрацією проб через фільтри “Millipore” (0,45 мкм), котрі тричі промивали 3 мл охолодженого розчину, що містив 150 мМ КС1, 5 мМ СоСІ2 х 6Н2О, 10 мМ HEPES, рН 7,4. Для визначення адсорбції кальцію суспензію клітин наносили на фільтри відразу після додавання мітки у середовищі, що не містило MgC12. Радіоактивність проб вимірювали на
рідинносцинтиляційному лічильнику Delta (США). Кількість акумульованого у мітохондріях Са2+ розраховували за різницею між загальним накопиченням катіону із середовища інкубації та його адсорбцією.
Кінетичні параметри Са2-транспортуючих систем мітохондрій тимоцитів, а саме початкову швидкість накопичення V0 и кальцієву ємність Рмакс визначали за методом, описаним у [6].
Статистичну обробку отриманих результатів проводили загальноприйнятими методами з використанням t-критерію Стьюдента.
Концентрація дигітоніну, мкМ Рис. 1. Залежність накопичення Са2+ тимоцитами від концентрації дигітоніну у середовищі інкубації.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Особливості та механізми функціонування систем акумуляції Са2+ в мітохондріях та ЕПР тимоцитів, а також внесок цих систем у підтримання кальцієвого гомеостазу вивчені недостатньо, оскільки
дослідження АТФ-залежного транспорту Са2+ у внутрішньоклітинні структури інтактних тимоцитів ускладнені. Цих ускладнень можна уникнути, використовуючи пермеабілізовані дигітоніном клітини, що дозволяє забезпечити доступ АТФ та Са2+ всередину клітин та зберегти природне співвідношення об’ємів внутрішньоклітинних Са2-депо.
Виявилось, що оброблені дигітоніном (2-30 мкМ) тимоцити здатні накопичувати Са2+ із стандартного середовища інкубації. Як видно з даних, представлених на рис. 1, максимальний рівень накопиченого за 5 хв катіону був виявлений за присутності 15 мкМ дигітоніну і становив 405 ± 21 пмоль/106 клітин.
Час, хв
Рис. 2. Акумуляція Са2+ мітохондріями тимоцитів у контролі (1) та через 5 (2) і 15 хв (3) після дії Н2О2.
Таблиця 1
Кінетичні параметри накопичення Са2+ мітохондріями тимоцитів в контролі та після дії 0,1 мМ Н2О2 ________________________________________(М ± т; п = 6)___________________________________________
Проба Час інкубації, хв р А max^ пмоль 45Са2/106 кл Vo, пмоль 45Са2/106 кл х хв
контроль - ЗЗ6 і 16 106 і 8
0,1 мМ H2O2 5 2З2і 11* 80 і 7*
15 8З і 4* 42 і 5*
Примітки: *- р < 0,05 порівняно з контролем.
Динаміку накопичення Са2+ в мітохондріях контрольних клітин представлено на рис. 2 (крива 1). Крива акумуляції катіону мітохондріями тимоцитів мала тенденцію до встановлення рівноважного стаціонарного рівня акумульованого
Са2+ на 5-ій хвилині інкубації, який виявився значним. Результати кінетичного аналізу кривої акумуляції катіону у мітохондрії контрольних клітин, а саме - значення максимального рівня
АКУМУЛЯЦІЯ КАЛЬЦІЮ МІТОХОНДРІЯМИ НА РАННІХ ЕТАПАХ АПОПТОЗУ ТИМОЦИТІВ ЩУРА
2З
накопичення Са2+ (Ртах) та початкової швидкості акумуляції Са2+ (У0), представлені у табл. 1.
Активність системи акумуляції Са2+ у мітохон-дріях після дії пероксиду водню досліджували, інкубуючи тимоцити у присутності 0,1 мМ Н2О2 упродовж 5 та 15 хв, після чого клітини переносили
45^ 2+
у середовище, що містило дігітонін та Са .
Як видно з даних, представлених на рис. 2, вже через 5 хв після інкубації клітин у присутності 0,1 мМ Н2О2 спостерігається зниження активності Са2+-акумулюючої системи мітохондрій (крива 2). Стаціонарний рівень накопичення катіону, який встановлюється на 5-ій хвилині інкубації, знижується в 1,5 рази порівняно з контролем. Через 15 хв після дії Н2О2 спостерігається ще більш значне пригнічення накопичення Са2+
мітохондріями тимоцитів (крива 3) - стаціонарний рівень акумуляції на 5-ій хвилині інкубації падає в 3,5 рази у порівнянні з контролем.
Результати кінетичного аналізу отриманих кривих (табл. 1) показали, що вже через 5 хв після інкубації клітин у присутності 0,1 мМ Н2О2 спостерігається зниження активності Са2+-акумулюючої системи мітохондрій - кальцієва ємність Ртах знижується у 1,4 рази порівняно з контрольним значенням, а початкова швидкість накопичення катіону У0 - у 1,3 рази. Через 15 хв після обробки тимоцитів пероксидом водню спостерігається більш значне зниження кінетичних параметрів входу Са2+ у мітохондрії: Ртах знижується у 4 рази, а У0 - у 2,5 рази у порівнянні з контролем.
Отримані дані можна пояснити наступним чином. Дія Н2О2 як індуктора утворення АФК супроводжується, перш за все, зниженням здатності мітохондрій до накопичення Са2+ з цитозолю. Першопричиною такого зниження може бути порушення функціонування залежного від величини мембранного потенціалу Са2+-уніпортера. У подальшому активність Са2+-акумулюючої системи мітохондрій може пригнічуватись внаслідок окиснення мембранних фосфоліпідів та підвищення неспецифічної проникності внутрішньої мембрани мітохондрій [1-3].
Виявлений вплив Н2О2 на структурний стан мітохондріальної мембрани слід пов’язувати насамперед з його перетворенням на високо-реакційний гідроксил-радикал -ОН у присутності Бе2+ та з посиленням процесів неферментативного вільнорадикального окиснення. Відомо, що за фізіологічних умов вміст заліза у мітохондріях, окрім гемового та того, що входить до складу Бе8 білків, становить приблизно 1,7 нмоль/мг білка - це залізо зв’язане у складі низькомолекулярних комплексів з АДФ, ГТФ, АТФ та цитратом [7]. Припускають, що під впливом продуктів вільнорадикального окиснення порушуються бар’єрні властивості ліпідного бішару мітохондріальних мембран, зокрема посилюється
проникність мембран для іонів H+/OH", внаслідок чого зростає продукція супероксид-аніону у ході одноелектронного відновлення О2 у дихальному ланцюгу та формується замкнене коло процесів вільнорадикального окиснення [1].
У літературі є дані, що AФК та внутрішньомітохондріальний кальцій можуть діяти сумісно, індукуючи проникність внутрішньої мітохондріальної мембрани [8]. Так, відомо, що перевантаження мітохондрій іонами кальцію призводить до інгібування І комплексу дихального ланцюга мітохондрій, за рахунок чого відбувається додаткове посилене утворення AФК з наступним окисненням тіолових груп білків мітохондріальних мембран [1,2]. Такі події сприяють утворенню пор у внутрішній мембрані мітохондрій - так званих неселективних мітохондріальних пор, що здатні пропускати речовини масою до 1500 Да. ^йбільш вірогідним білком, залученим до формування подібних пор за умов окисного стресу вважається вбудований у внутрішню мітохондріальну мембрану AДФ/AТФ антипортер, який містить 4 тіолові групи цистеїну, що легко окиснюються. Зміна конформації AДФ/AТФ антипортера за таких умов сприяє утворенню неселективної міто-хондріальної пори [1,2].
Ще одним механізмом підвищення проникності мітохондріальних мембран може бути активація фосфоліпази A2, яка знаходиться на внутрішній мембрані мітохондрій. Цей фермент активується іонами Са2+, які містяться не у мітохондріальному матриксі, а поза мітохондріями. У нормі мітохондрії поглинають кальцій, видаляючи його із середовища, і тим самим активуюча дія Са2+ запобігається. Внаслідок посилення активності фосфоліпази A2 у мітохондріях підвищується вміст жирних кислот, які, як відомо, посилюють мембранну провідність та проникність для катіонів.
ВИСНОВКИ
Отже, отримані нами дані вказують на те, що у тимоцитах на ранніх етапах після дії H2O2 відбувається зміна проникності мітохондріальних мембран, порушення процесів трансмембранного обміну катіону у мітохондріях та зниження Са2-акумулюючої здатності цих органел, що може бути однією з причин раннього підвищення концентрації Са2+ у цитозолі оброблених H2O2 тимоцитів.
Література
1. Brookes P. S., Yoon Y., Robotham J. L., Anders M. W.,
et. al. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-
hate triangle // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. - 2004. -
Vol. 287. - P. 817 - 833.
Гребіник Д. М., Мат шевська О.П.
2. Brini M. Ca2+ signalling in mitochondria: mechanism and role in physiology and pathology // Cell. Calcium. -2003. - Vol. 34, №4-5. - P. 399-405.
3. Orrenius S., Zhivotovsky B., Nicotera P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. - 2003. - Vol. 4, №7. - P. 552-65.
4. Patterson S.D., Spahr C.S., Daugas E., Susin S.A., et al. Mass spectrometric identification of proteins released from mitochondria undergoing permeability transition // Cell. Death. Differ. - 2000. - Vol. 7, №2. - P. 137-144.
5. Гребинык Д. М., Коваль Т. В., Матышевская О. П. Исследование кальциевого гомеостаза в тимоцитах при апоптозе. I. Повышение концентрации цитозольного Са2+ на ранней стадии апоптоза,
индуцированного пероксидом водорода // Укр. біохім. журн. - 2004. - Т. 76, № 6. - С. 63 - 69.
6. Костерин С. А., Бурчинская Н. Ф. Метод определения кинетических характеристик Са2+-транспортирующих систем субклеточных структур гладких мышщ // Укр. биохим. журн. - 1987. -Т. 59, №2. - С. 66-69.
7. Halliwell B. Gutteridge JM. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview // Methods Enzymol. - 1990. - Vol. 186. - P. 1 - 85.
8. Гордеева А.В., Звягильская Р.А., Лабас Ю.А. Взаимосвязь между активными формами кислорода и кальцием в живых клетках // Биохимия. - 2003. -Т.68, вып. 10. - С.1З18 - 1332.
АККУМУЛЯЦИЯ КАЛЬЦИЯ МИТОХОНДРИЯМИ НА РАННИХ ЭТАПАХ АПОПТОЗА ТИМОЦИТОВ КРЫСЫ
Гребинык Д. Н., Матышевская О.П.
Исследованы параметры функционирования Са2+-транспортных систем митохондрий тимоцитов в контроле и на ранних этапах апоптоза, индуцированного пероксидом водорода в конечной концетрации 0,1 мМ. Показано снижение Са2+-аккумулирующей способности митохондрий, а также изменение кинетических параметров накопления кальция этими органеллами на ранних этапах после действия Н2О2. Предполагается, что возможной причиной обнаруженных эффектов является нарушение барьерной функции и селективной проницаемости митохондриальных мембран.
Ключевые слова: митохондрии, апоптоз, , кальций, пероксид водорода.
CALCIUM ACCUMULATION IN MITOCHONDRIA AT THE EARLY STAGES OF RAT THYMOCYTE APOPTOSIS
Grebinyk D.M.., Matyshevska O.P.
The functional parameters of mitochondrial Ca2+-transporting systems of rat thymocytes, both at the control conditions and at the early stages of rat thymocyte apoptosis induced by 0,1 Mm hydrogen peroxide, were studied. At the early stages after addition of H202 the Ca2+- acumulating ability of mitochondria, as well as the kinetic parameters of this accumulation, were shown to be decreased. It was suggested that alterations of barrier function and selective permeability of mitochondrial membranes might be the possible cause of the effects discovered.
Key words: : mitochondria, apoptosis, calcium, hydrogen peroxide.
