CC BY
6Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 25 (64). 2012. № 2. С. 37-43.
УДК 612.35 + 612.357.15
ВПЛИВ L-АРПЫНУ НА СПЕКТР ХОЛАТ1В У ЖОВЧ1 ЩУР1В
Бондзик О.В., Решеттк С.М., Весельський С.П., Янчук П.1.
ННЦ «1нститут бюлогИ» КиИвського нащонального утверситету жет Тараса Шевченка,
Кшв, Украта
E-mail: elena_physiology@ukr.net
В умовах гострого експерименту на щурах дослщжувався вплив L-аргшшу на спектр холат1в у жовчi з використанням методу тонкошарово! хроматографа. Показано, що L-аргшш (10 мг/кг, внутршньопортально) викликав збшьшення концентрацй дигiдроксихоланових вiльних та кон'югованих з таурином жовчних кислот (порiвняно з вихiдним рiвнем показникiв), разом з тим спостер1галося зменшення концентрацй гакохолево1 кислоти. L-аргiнiн на фон блокади NO-синтаз за допомогою L-NAME (20 мг/кг) зумовлював збiльшення концентрацй кон'югованих жовчних кислот. Ключовi слова: L-арпнш, жовчш кислоти, L-NAME.
ВСТУП
Числент джерела л1тератури свщчать про значш, переважно гепатопротективш властивосп L-аргiнiну [1-6]. Виходячи з цього, штенсивно вивчаються ефекти L-аргшшу на рiзнi бiохiмiчнi, цитологiчнi, пстолопчш показники стану печiнки та жовчовивщних шлях1в за умов експериментально! патологи рiзноl етiологil [6-8]. Наголошуеться на можливосп змiни антиоксидантно-прооксидантно! рiвноваги за участю L-арпншу [9-12], його здатносп впливати на бiлковий обмiн при ураженш печiнки [13], iндукцil ним цитохрому Р-450 [8] та запобтанш апоптичнiй загибелi гепатоцитiв при шеми-реперфузи печiнки [2]. Загалом, можна вважати, що L-аргiнiн, виявляючись залученим до цiлоl низки життево важливих метаболiчних процесiв, здатен iстотно змшювати функцiонування гепато-бiлiарноl системи людини i тварин. Провiдним механiзмом впливу аргшшу на структурно-функцiональний стан печшки при рiзних патологiях вважають перш за все те, що ця амшокислота виступае як субстрат для синтезу важливо1 полiфункцiональноl регуляторно1 сполуки - NO [1, 2, 6, 13]. В свою чергу, оксид азоту за фiзiологiчних умов виявляе цитопротекторну дда, забезпечуе розширення судин у печшщ, запобiгае розвитку тромбозу, виступае у якосп антиоксиданта, проте при надлишковому його утвореннi виявляе цитотоксичну дiю [14], а також виявляе гальмiвний вплив на транспорт жовчних кислот у гепатоцитах [15].
Не зважаючи на все вищезазначене, питання про мехашзми дп L-арпшну на таку специфiчну функцiю печшки як жовчосекреторна лишаеться маловивченим. Значною мiрою iнтенсивнiсть секрецil жовчi об'ективно свiдчить про функцiональний стан печшки, а змши вмiсту в жовчi специфiчних органiчних компонентiв - жовчних кислот вщображають перебiг багатьох обмшних процесiв у гепатоцитах [16, 17].
Попередньо нами встановлено, що L-аргшш при внутршньопортальному введенш у дозi 5 мг/кг виявляе гiпохолеретичну дiю та змiнюe сшввщношення жовчних кислот та лiпiдiв у жовчi [18]. Тому метою нашо! подальшо! роботи стало дослiдження впливу L-аргшшу на жовчосекреторну функцiю печшки щурiв як окремо, так i на тлi блокади NO-синтази за допомогою L-NAME.
МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ
Дослщи проведено на бiлих щурах-самцях масою 200-300 г у гострих спробах. Пiд час дослiду тварини перебували шд тiопенталовим наркозом (6 мг/100 г, внутрiшньоочеревинно). Для дослщження функцп жовчовидiлення здiйснювали лапаротомiю i канюлювання жовчно! протоки. Через 30 хв. шсля канюлювання визначали вихщний рiвень жовчовидiлення шляхом збору трьох 10-хвилинних порцiй жовчi. Пiсля цього шддослщним щурам у ворiтну вену болюсно вводили розчин L-аргiнiну (10 мг/кг маси тша). Тваринам контрольно! групи аналопчним способом вводили фiзiологiчний розчин (1мл/кг маси тiла). Для дослщження дп L-аргiнiну на фош блокади NO-синтаз неселективний блокатор NO-синтаз L-NAME (20 мг/кг маси тша) вводили внутршньопортально за 5 хвилини до ш'екцп L-аргшшу. Також варто зазначити, що iнфузiя L-аргiнiну безпосередньо у кров е набагато ефектившшою, нiж пероральний прийом, оскiльки ця амiнокислота погано всмоктуеться в кишечнику внаслiдок метаболiзування кишковою мiкрофлорою [19].
У зiбраних впродовж двох пiвгодинних промiжкiв дослiду пробах жовчi визначали жовчнi кислоти за методикою Весельського та ш. [20]. Цей метод дае змогу виявити в жовчi таю жовчт кислоти: кон'югованi таурохолеву (ТХК), таурохенодезоксихолеву i тауродезоксихолеву в сумiшi (ТХДХК+ТДХК), глiкохолеву (ГХК), глiкохенодезоксихолеву i ткодезоксихолеву в сумiшi (ГХДХК+ГДХК), а також вшьш жовчнi кислоти холеву (ХК) та хенодезоксихолеву i дезоксихолеву в сумiшi (ХДХК+ДХК). Чутливiсть методу - 1-3 мкг оргашчного компонента в пробг Показник концентрацп кожно! iз зазначених жовчних кислот у пробах жовч^ отриманих пiсля введення дослщжуваних речовин, порiвнювали iз значеннями вмюту вщповщно! жовчно! кислоти у першш пiвгодиннiй пробi жовчi, яку вважали вихщним рiвнем.
Статистичну обробку отриманих результат проводили за допомогою пакету програм STATISTICA 6.0 (Stat-Soft, USA). Для оцшки нормальностi розподiлу використовували тест Шапiро—Вiлка. Для оцшки значущих вщмшностей мiж вибiрками з нормальним розподiлом даних використовували критерiй Стьюдента для залежних вибiрок. Вiдмiнностi мiж групами вважали вiрогiдними при рiвнi значущостi р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
У щурiв контрольно! групи виявлено, що концентрацл всiх фракцiй кон'югованих жовчних кислот знижувалися впродовж дослiду. Найбiльш вираженим було зменшення вмiсту ГХДХК+ГДХК. Концентращя цих дигiдроксихоланових глiкокон'югатiв у жовчi в останнiй пiвгодиннiй пробi (90 хв. дослщу) була на 19,7% (р<0,05) меншою, нiж у першш швгодиннш пробi жовчi (табл.1). Концентращя вшьних (некон'югованих) три- i дипдроксихоланових
ВПЛИВ ЬАРПНЖУ НА СПЕКТР ХОЛАТ1В У ЖОВЧ1 ЩУР1В
жовчних кислот (ХК, ХДХК+ДХК) статистично значимо не змшювалася впродовж дослiду порiвняно iз вихщним рiвнем.
Таблиця 1
Концентрацiя жовчних кислот у жовчi щурiв шсля внутрiшньопортального введення фiзiологiчного розчину (1 мл/кг), М±8Б, п=8
Жовчш кислоти
Час дослiду,хв ТХК ТХДХК +ТДХК ГХК ГХДХК +ГДХК ХК ХДХК +ДХК
30 хв; № 1 185,3 ±14,26 115,42 ±8,91 140,62 ±25,85 34,53 ±16,16 22,41 ±10,05 8,9 ±3,22
Внутршньопортальне введення фiзiологiчного розчину (1 мл/кг)
60 хв; №2 179,81 ±13,99 * 112,04 ±9,88 138,41 ±27,59 32,47 ±16,65 21,88 ±9,02 8,36 ±2,38
90 хв; №3 177,32 ±16,85 105,7 ±9,32 * 131,61 ±26,63 * 27,74 ±12,23 * 18,44 ±5,62 7,72 ±1,79
Примтка: * - р<0,05 порiвняно з вихвдним рiвнем (концентрацiя жовчно! кислоти у твгодиннш пробi жовчi, отриманiй до введення дослщжувано! сполуки)
Натомiсть, шсля внутршньопортального введення L-аргiнiну (10 мг/кг) спостер^алися рiзнонаправленi змiни концентраци жовчних кислот у жовчi щурiв. Так, концентращя ТХДХК+ТДХК на 90 хв. дослщу була вищою вiд вихщного рiвня на 10,1% (р<0,05) (табл. 2). Концентращя ХДХК+ДХК у жовчi щурiв через 30 хв. шсля внутршньопортального введення L-аргiнiну (60 хв. дослщу) вiрогiдно збiльшувалася порiвняно з вихщним рiвнем на 36,8% (р<0,05). Лише концентрацiя ГХК виявилася нижчою вiд вихiдного рiвня на 12,1% (р<0,05). При цьому не спостер^алося статистично значимого зниження концентрацiй ТХК, ГХДХК+ГДХК порiвняно iз значеннями, зафшсованими у першiй пiвгодиннiй пробi, отриманш до введення амiнокислоти.
Таблиця 2
Концентращя жовчних кислот у жовчi щурiв пiсля внутрiшньопортального введення Ь-арпшну (10 мг/кг), М±8Б, п=6
Жовчш кислоти
Час ТХК ТХДХК ГХК ГХДХК ХК ХДХК
досл^ду,хв +ТДХК +гДхк +ДХК
30 хв; 171,28 96,33 152,78 22,68 19,1 8,83
№ 1 ±10,14 ±15,44 ±51,92 ±6,32 ±8,94 ±1,51
Внутршньопортальне введення розчинуL-аргiнiну (10 мг/кг)
60 хв; 171,5 105,2 152,93 23,6 21,65 12,08
№2 ±3,4 ±20,52 ±65,69 ±9,23 ±15,37 ±2,93 *
90 хв; 167,43 106,05 134,3 21,8 21,17 10,38
№3 ±6,86 ±20,46 * ±64,73 * ±6,92 ±11,23 ±1,93
Примтка: * - р<0,05 порiвняно iз вихiдним рiвнем (концентрацiя жовчно1 кислоти у твгодиннш пробi жовчi, отриманш до введення дослщжувано! сполуки)
Блокада КО-синтази за допомогою Ь-КЛМБ (20 мг/кг) не викликала змш концентрацп всiх дослщжуваних фракцiй глiкокон'югатiв, вiльних жовчних кислот та ТХК порiвняно з вихщним рiвнем (табл. 3). Лише наприкшщ дослiду (90 хв.) зареестровано збшьшення концентрацп сумiшi ТХДХК+ТДХК на 10,6 % (р<0,01).
Таблиця 3
Концентращя жовчних кислот у жовчi щурiв пiсля внутрiшньопортального введення L-NAME (20 мг/кг), М±8Б, п=6
Жовчш кислоти
Час ТХК ТХДХК ГХК ГХДХК ХК ХДХК
досл^ду,хв +ТДХК +ГДХК +ДХК
30 хв; 182,35 97,18 135,77 29,6 21,90 10,85
№ 1 ±14,34 ±16,15 ±85,49 ±10,16 ±17,69 ±3,21
Внутршньопортальне введення розчину L-NЛME (20 мг/кг)
60 хв; 183,6 101,62 137,92 28,66 21,58 11,23
№2 ±31,01 ±23,17 ±103,61 ±12,95 ±12,39 ±2,86
90 хв; 188,92 107,45 138,48 27,13 22,68 12,03
№3 ±27,25 ±15,46 ** ±95,27 ±10,27 ±12,88 ±3,35
Примтка: ** - р<0,01 порiвняно iз вихвдним рiвнем (концентрацiя жовчно1 кислоти у твгодиннш пробi жовчi, отриманiй до введення дослщжувано! сполуки)
При введенш L-аргiнiну на тлi попередньо! блокади КО-синтаз спостерiгалося виключно збiльшення концентрацп кон'югованих жовчних кислот порiвняно з вихщним рiвнем, а концентрацiя вшьних жовчних кислот пiдтримувалася на рiвнi близькому до такого у першш пiвгодиннiй пробi жовчi (табл.4).
Таблиця 4
Концентращя жовчних кислот у жовчi щурiв пiсля введення L-аргiнiну (10 мг/кг) на фонi дп L-NAME (20 мг/кг), М±8Б, п=6
Жовчш кислоти
Час достду,хв ТХК ТХДХК +ТДХК ГХК ГХДХК +ГДХК ХК ХДХК +ДХК
30 хв; 188,62 96,07 164,55 25,97 20,15 10,27
№ 1 ±14,09 ±17,61 ±62,0 ±10,58 ±8,54 ±2,93
Внутршньопортальне введення розчишв L-NAME (20 мг/кг) та L-аргiнiну (10 мг/кг)
60 хв; 207,55 107,73 176,93 29,00 20,7 10,7
№2 ±21,71 ** ±18,99 ** ±76,15 * ±10,6 * ±8,19 ±2,04
90 хв; 213,25 108,4 171,48 28,5 21,32 10,9
№3 ±30,25 * ±25,78 * ±113,46 ±11,45 ±11,59 ±1,96
Примтка: * - р<0,05, ** - р<0,01 порiвняно iз вихщним рiвнем (концентрацiя жовчно1 кислоти у твгодиннш пробi жовчi, отриманiй до введення дослщжувано! сполуки)
Отже, як блокатор КО-синтаз, так i L-аргiнiн за !х окремо! дп сприяли пiдтриманню концентрацп ТХК на рiвнi. близькому до вихiдного. А у серп
ВПЛИВ L-АРПНЖУ НА СПЕКТР ХОЛАТ1В У ЖОВЧ1 ЩУР1В
експериментiв i3 спшьним використанням L-NAME i L-apriHiHy спостер^алося вiрогiдне збiльшення (на 10-13%; р<0,05) концентрацiï таурохолево1 кислоти у жовчi щyрiв. Ефекти L-NAME i L-apriHiHy (у pa3i ïx окремого застосування) на вмiст у жовчi дипдроксихоланових тaypокон'югaтiв виявилися односпрямованими, а саме: як блокатор NO-синтази, так i донор NO викликали збшьшення концентраци тaypокон'югaтiв дигiдpоксиxолaновиx жовчних кислот у пробах жовчь Цiкaво, що при спшьному зaстосyвaннi цих сполук концентращя сyмiшi тaypоxолaтiв ТХДХК+ТДХК зростала поpiвняно з виxiдним piвнем на 12,1% (р<0,01) i 12,8% (р<0,05), тобто не спостер^алося сyмaцiï ефектiв L-NAME i L-аргшшу. Зменшення вмiстy в жовчi ГХК пiд впливом L-аргшшу повнiстю усувалося попеpеднiм введенням L-NAME. Застосування блокатора NO-синтази перед введенням L-apгiнiнy також зaпобiгaло стимулюючому впливу aмiнокислоти на надходження сyмiшi вiльниx жовчних кислот ХДХК+ДХК у жовч щypiв.
Слiд вiдзнaчити також встановлеш нами дозозaлежнi ефекти L-аргшшу на вмiст xолaтiв у жовчь Якщо у дозi 5 мг/кг L-аргшш викликав збiльшення концентpaцiï тpигiдpоксиxолaновоï кон'юговaноï тaypоxолевоï кислоти з одночасним зменшенням тако1' вiльноï тpигiдpоксиxолaновоï xолевоï кислоти [18], то при застосуванш L-apгiнiнy в дозi 10 мг/кг збшьшувалась концентpaцiя дигiдpоксиxолaновиx кислот (тaypоxенодезоксиxолевоï, тaypодезоксиxолевоï, xенодезоксиxолевоï i дезоксиxолевоï). Це може свщчити про дозозалежний вплив L-apгiнiнy на тaкi метaболiчнi перетворення жовчниx кислот, як пдроксилювання та кон'югaцiя.
ВИСНОВОК
Таким чином, L-аргшш та L-NAME як при окремому ïx введенш, так i при спшьнш дiï, суттево змшюють жовчнокислотний склад жовчi щypiв, що може свщчити про участь NO в метaболiчниx пеpетвоpенняx i транспорт жовчниx кислот до пеpвинниx жовчнж кaнaльцiв. Але односпpямовaнiсть виявлениx нами ефекпв aмiнокислоти i блокатора, а також лише часткове усунення впливу L-арпшну на концентpaцiï деякиx жовчнж кислот при попередньому введеннi L-NAME може вказувати на те, що дiя L-арпшну на жовчосекреторну функщю печiнки пов'язана не лише з його роллю як донора NO.
Список лггератури
1. L-arginine reduces liver and biliary tract damage after liver transplantation from non-heart-beating donor pigs / R. Valero, J.C. Garcia-Valdecasas, M. Net [et al.] // Transplantation - 2000 - Vol.70, №5. - P. 730-737.
2. Li S.Q. Protective mechanism of L-arginine against liver ischemic-reperfusion injury in rats / S.Q. Li, L.J. Liang // Hepatobiliary Pancreat Dis Int - 2003. - Vol.2, №4. - P.549-52.
3. Максимович Н.Е. Аминокислота L-аргинин и перспективы её использования в клинике / Н.Е. Максимович, Д.А. Маслаков // Здpaвооxpaнение. - 2003. - № 5. - С. 35-37.
4. Pros and cons of L-arginine supplementation in disease / Y.L.J. Vissers, I.B.J.G. Debats, Y.C. Luiking [et al.] // Nutrition Research Reviews. - 2004. - V. 17. - P.193-210.
5. Beneficial effects of rutin and L-arginine coadministration in a rat model of liver ischemia-reperfusion injury / R. Acquaviva, R. Lanteri, G. Li Destri [et al.] // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. - 2009. - Vol.296, № 3. - P. G664-70.
6. The effects of L-Arginine on liver damage in experimental acute cholestasis an immunohistochemical study / Y. Ozsoy, M. Ozsoy, T. Coskun [et al.] // HPB Surgery. - 2011. - Vol.2011. - P.306069, 5 pages.
7. Bruins M.J. L-arginine supplementation in pigs decreases liver protein turnover and increases hindquarter protein turnover both during and after endotoxemia / M.J. Bruins, P.B. Soeters, W.H. Lamers, N.E. Deutz // Am J Clin Nutr. - 2002. - Vol.75, №6. - P.1031-44.
8. Chung H.C. Increase in urea in conjunction with L-arginine metabolism in the liver leads to induction of cytochrome P450 2E1 (CYP2E1): the role of urea in CYP2E1 induction by acute renal failure / H.C. Chung, S.H. Kim, M.G. Lee, S.G. Kim // Drug Metab Dispos - 2002. - Vol.30, №6. - P.739-46.
9. Галкин Б.Н. Антитоксические свойства аргинина / Г.Б. Галкин // Соврем.пробл. токсикол. - 2003. - № 1. - С. 80-86.
10. Oxidative stress and enzymatic antioxidant status in patients with nonalcoholic steatohepatitis / M. Koruk, S. Taysi, M.C. Savas [et al.] // Ann Clin Lab Sci - 2004. - Vol.34, №1. - P.57-62.
11. Nikoli E. Nitric oxide and mitochondrial biogenesis / E. Nikoli, M.O. Carruba // J. Cell Sci. - 2006. -Vol.119. - P. 2855-2862.
12. Chattopadhyay P. Attenuation of mitochondrial injury by L-arginine preconditioning of the liver / P. Chattopadhyay, G. Shukla, A. Verma, A.K. Wahi // Biofactors - 2007. - Vol.31, №2. - P.99-106.
13. The role of L-arginine in toxic liver failure: interrelation of arginase, polyamine catabolic enzymes and nitric oxide synthase / J. Nikolic, I. Stojanovic, R. Pavlovic [et al.] // Amino acids. - 2007. - V. 32, №1. -P. 127-131.
14. Продукщя оксиду азоту в печшщ за умов впливу ацетату свинцю в експеримент // О.Л. Апихтша, А.В. Коцюруба, 1.М. Андрусишина [та ш.] - 2007. - №2. - С. 22-26.
15. Dufour JF.J. Nitric oxide blocks bile canalicular contraction by inhibiting inositol trisphosphate-dependent calcium mobilization / JF.J. Dufour, T.J. Turner, I.M. Arias // Gastroenterology - 1995. - Vol. 108. - P.841-849.
16. Особливост спектру жовчних кислот у людини i тварин / С.П. Весельський, М.Ю. Макарчук, П.1. Янчук [та ш.] // Наук. вюн. Волин. держ. ун-ту iM. Леи Укра'шки. - 2007. - № 5. - С. 65-72.
17. Esteller A. Physiology of bile secretion / A. Esteller // World J Gastroenterol. - 2008. - V14, №37. -P.5641-5649.
18. Бондзик О.В. / Дослщження впливу L-арпншу на жовчосекреторну функщю печшки щурiв // О.В. Бондзик, Е.Н. Решетшк, С.П. Весельський, П.1. Янчук // Науковий вюник Волинського нащонального ушверситету iменi Леи Укра'шки". - 2010. - №12. - С. 9-14.
19. Дмитренко Н.П. Аргинин: биологическое действие, влияние на синтез оксида азота / Н.П. Дмитренко, Т.О. Кишко, С.Г. Шандренко // Укр^мютерапевтичний журнал. - 2008. - №1-2 (22). - С.137-140.
20. Пат. 99031324 Украша, МБН А61В5/14. Споаб тдготовки проб бюрщин для визначення вмюту речовин лшщно! природи / С.П. Весельський, П.С. Лященко, С.1. Костенко, З.А. Горенко, Л.Ф. Куровська. - № 33564А ; заяв. 05.10.1999 ; опубл. 15.02.2001 ; Бюл. № 1.
Бондзик Е.В. Влияние L-аргинина на спектр холатов в желчи крыс / Е.В. Бондзик, Е.Н. Решетник, С.П. Весельский, П.И. Янчук // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2012. - Т. 25 (64), № 2. - С.37-43. В острых экспериментах на крысах исследовали влияние L-аргинина на спектр холатов в желчи, используя метод тонкослойной хроматограффии. Показано, что L-аргинин (10 мг/кг, внутрипортально) вызывал увеличение концентрации дигидроксихолановых свободных и конъюгированных с таурином желчных кислот (сравнительно с исходным уровнем показателей), при этом наблюдалось уменьшение концентрации гликохолевой кислоты. L-аргинин на фоне блокады NO-синтаз с помощью L-NAME (20 мг/кг) вызывал увеличение концентрации конъюгированых желчных кислот. Ключевые слова: L-аргинин, желчные кислоты, L-NAME.
BnflHB L-APriHIHy HA CnEKTP XOAATIB y MOBHI ^yPIB
Bondzyk O.V. The influence of L-arginine on the spectrum of bile acids in rat bile / O.V. Bondzyk, E.M.Resetnik, S.P. Veselsky, P.I. Yanchuk // Scientific Notes of Taurida V.Vernadsky National University. -Series: Biology, chemistry. - 2012. - Vol. 25 (64), No. 2. - P. 37-43.
The influence of L-arginine on the spectrum of bile acids in rat bile was investigated in acute experiments on rats with using thin-layer chromatography. It was shown that L-arginine after bolus intraportal injection in dose 10 mg/kg body weight increased the concentrations of free and conjugated with taurine dihydroxy cholates compared with baseline of concentrations. Also the concentration of glycocholic acid was decreased. In contrast, after bolus intraportal injection of NO-synthases inhibitor L-NAME (dose 20 mg/kg body weight), this amino acid decreased the concentrations of all fractions of conjugated bile acids. Keywords: L-arginine, bile acids, L-NAME.
nocmynuna e peda^uw 11.05.2012 г.
