Вплив комплексної радіотерапії на молекулярні механізми трансдукції сигналу Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Фізика живого, Т. 16, No 2, 200S. С.122-126.

© Раєцька Б.Я., Остапченко Л.І., Гавриш Л.І., Гаділія О.П.

УДК 577.3

ВПЛИВ КОМПЛЕКСНОЇ РАДІОТЕРАПІЇ НА МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ ТРАНСДУКЦІЇ СИГНАЛУ

Раєцька Б.Я., Остапченко Л.І., Гавриш Л.І., Гаділія О.П.

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет,

e-mail: [email protected]

Надійшла до редакції 25.11.2008

На підставі проведених досліджень встановлено, що опромінення призводить до змін молекулярних механізмів трансдукції сигналу за умов злоякісного росту. Показано, що введення лікувальних препаратів із властивостями антиоксидантів сприяє нормалізації стану сигнальних систем у клітинах за рахунок підсилення ефективності застосованої радіотерапії.

Ключові слова: карцинома Герена, променева терапія, вторинні посередники, антиоксидантні препарати.

ВСТУП

Для підтримки клітини в стаціонарному динамічному стані необхідне нормальне функціонування її ферментних систем, зокрема, систем трансдукції сигналу. Серед них особливе значення має месенджерний каскад, вторинними посередниками, в якому є циклічні нуклеотиди (цАМФ, цГМФ, цЦМФ).

Циклічні нуклеотиди є внутрішньоклітинними провідниками головних регуляторних систем організму (нервової та ендокринної ), вони приймають участь у регуляції фундаментальних процесів життєдіяльності. Сьогодні продемонстровано існування біохімічних відмінностей функціонування систем циклічних нуклеотидів у злоякісно трансформованих клітинах [1]. У випадку вірусної трансформації порушується транслокація в ядро цАМФ-зв’язуючого компонента

протеїнкінази, але зберігається потенційна здатність генетичного матеріалу клітини акцептувати цей білок. При виникненні злоякісних пухлин зазнає змін генетичний матеріал, який перестає зв’язувати протеїнкіназу. При досліджені відомих біохімічних маркерів пухлинного процесу було встановлено, що регресія трансформації відбувається під впливом сайт-селективних аналогів цАМФ [2]. Показані можливі механізми цього процесу. Отримані різними авторами експериментальні дані дозволяють передбачити доцільність використання компонентів системи циклічних нуклеотидів для диференціальної діагностики та терапії пухлинних уражень.

В наш час доведено, що уже в ранній період післяпроменевого впливу змінюється стаціонарний

рівень циклічного АМФ у напрямку поступового зниження. Ряд авторів такий спад

внутрішньоклітинної концентрації цАМФ пов'язують з підвищенням швидкості його виходу (напевно, вільного, не зв'язаного з протеїнкіназою) із клітин через підсилення цАМФ-залежного фосфорилювання білків плазматичної мембрани, яке приводить до змін у процесах мембранного транспорту [3].

Зміни внутрішньоклітинної концентрації цАМФ і цГМФ призводять як до гальмування, так і до активації метаболізму та диференціювання клітини, що залежить від фази клітинного циклу, тривалості і кінетики змін концентрацій циклічних АМФ і ГМФ. Існує припущення про стимулюючу дію цАМФ на шлях гальмування Т-супресорів. Показано, що підвищення рівня циклічного АМФ у В-лімфоцитах пригнічує проліферативні реакції. На відміну від цАМФ, цГМФ сприяє проліферації як В-, так і Т-лімфоцитів. Підвищення концентрації внутрішньоклітинного цГМФ може без додаткових мітогенних впливів індукувати поділ клітин. Під час клітинного циклу відбуваються реципрокні зміни рівнів цАМФ і цГМФ, які мають характер осциляцій [4].

На сьогоднішній день вивченню впливу іонізуючого опромінення на регуляторну систему циклічних АМФ і ГМФ за умов злоякісного росту присвячено ряд досліджень [5], але участь цих молекул у механізмах виникнення та розвитку пухлин остаточно не з’ясовано.

У зв’язку з викладеним вище важливо дослідити ключові компоненти системи циклічних нуклеотидів за умов пухлинного процесу та при дії радіації (тобто за умов радіотерапії). В якості

ВПЛИВ КОМПЛЕКСНОЇ РАДІОТЕРАПІЇ НА МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ ТРАНСДУКЦІЇ СИГНАЛУ

об’єкту нами були обрані, крім клітин карциноми Герена, також лімфоцити селезінки й тимусу щурів, оскільки вони характеризуються високою радіочутливістю.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

В дослідах використовували білих лабораторних щурів-самців масою 13G±1G г, (розведення віварію УНДІОР), яких утримували на стандартному раціоні віварію. Тваринам трансплантували карциному Герена шляхом підшкірної ін’єкції у ділянку стегна задньої кінцівки 20%-ної суспензії пухлинних клітин на

0,9%-му розчині NaCI, отриманих від щура-донора

[7].

Частині тварин щоденно, протягом 7-ми діб після прищеплення пухлини і до локального опромінення перорально вводили антиоксидантний препарат АММІВІТ (“Львівський фарм. завод”, Україна) у дозі 3G мг/кг маси тварин, як рекомендовано у роботі [S]. Досліджуваний препарат - антиоксидант рослинного походження, який є вітамінним концентратом витяжки з кісточок винограду.

На S-му добу після прищеплення піддавали локальному рентгенівському опроміненню в терапевтичних дозах на апараті РУМ-17 за таких умов: напруга - 180 кВ, сила струму - 10 мА,

А 22 .20

£18

!§ о 8 ^ 6 с 4

2

0

1

Ё

п селезінка н™мус ■пухлина

фільтри - 0,5 мм Си +1,0 мм А1, потужність дози -123 Р/хв, шкірно-фокусна відстань - 25 см. Тварин декапітували через 1, 3 та 7 діб після локального опромінення.

Вміст циклічних нуклеотидів визначали в цитозольній фракції клітин, яку отримували, використовуючи рекомендації [11]. Вміст циклічних нуклеотидів у лімфоїдних клітинах визначали за методом [9]. Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами статистики [10].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Для вивчення впливу опромінення на вміст циклічних нуклеотидів нами було обрано дозу 10 Гр, доцільність використання якої було доведено в попередніх дослідженнях [6]. Опромінення в цій дозі, по-перше, ефективно впливає на досліджувані месенджерні каскади і, по-друге, ця доза є менш пошкоджуючою для організму, що є важливим в аспекті радіотерапії пухлин.

Результати досліджень, що характеризують вміст циклічних нуклеотидів у тканинах селезінки, тимусу і пухлини (карцинома Герена) щурів, при локальному рентгенівському опромінені в дозі 10 Гр. подано на рис. 1. (А) та (Б).

Б 4

0

1

□ селезінка °™мус ■пухлина

Рис. 1. Вміст циклічних нуклеотидів цАМФ (А) та цГМФ (Б) у тканинах селезінки, тимусу, пухлини щурів до і після опромінення пухлини:

Примітки: 1) контроль - інтактні щури; 2) 8 діб після прищеплення пухлини; 3) 1 доба після опромінення; 4) 3 доби після опромінення; 5) 7 діб після опромінення.

Нами було встановлено, що вміст циклічних нуклеотидів у тканинах органів і пухлині щурів змінюється в залежності від часу опромінення. Результати, наведені на рис. 1. (А), свідчать, що вміст цАМФ знижується в тканинах селезінки, тимусу і пухлини, порівняно з контролем, в усіх групах досліджуваних тварин в усі терміни після опромінення, що свідчить про деструктивний вплив локального опромінення на організм.

Падіння рівню циклічного аденозинмонофосфату було найбільш виражене на 7 добу після опромінення:

в лімфоцитах селезінки він зменшувався у 2 рази, в лімфоцитах тимусу — у 2,6 рази, в клітинах пухлини

— у 4,3 рази порівняно з контролем (рис. 1. (А)). Ефект опромінення був найбільш вираженим у пухлинних клітинах, де рівень цАМФ зазнавав суттєвого зниження. Це може бути наслідком того, що система циклічних нуклеотидів залучена до біохімічних процесів злоякісного росту, результати узгоджуються з літературними даними [1].

Отже, дослідження впливу рентгенівського опромінення на вміст циклічних нуклеотидів у

Раєцька Б.Я., Остапченко Л.І., Гавріїш Л.І., Гаділія О.П.

селезінці, тимусі та пухлині щурів показало, що протягом усіх термінів опромінення вміст цАМФ знижується порівняно з контролем.

Визначення вмісту цГМФ у досліджених органах (рис. 1 (Б)) показало, що зміни його рівня носять протилежно спрямований характер. Порівняно з контролем, вміст цГМФ зростав протягом усіх термінів дослідження, як у селезінці, так і в тимусі і був найбільш вираженим у пухлині опромінених щурів на 7 добу він перевищував контрольний у 4 рази.

Отримані результати підтверджують літературні дані, які свідчать, що підвищення вмісту цГМФ є характерним для злоякісних клітин [1].

Відомо, що підвищення концентрації цГМФ і активація гуанілатциклази сприяє регуляції процесів індукції синтезу ДНК і проліферації різних клітин, зокрема, В-лімфоцитів [1], зростання вмісту цАМФ, навпаки, пригнічує проліферативні процеси. Стимуляція мітогенами практично завжди збільшує рівень цГМФ в клітині, а підвищений його вміст, як правило, характерний для клітин із високою швидкістю проліферації [2]. Радіотерапія, за отриманими нами даними, знижує концентрацію цГМФ не тільки в пухлині, а й у лімфоїдних органах опромінених щурів із карциномою Герена. Можна припустити, що таким шляхом радіотерапія сприяє пригніченню злоякісного росту.

Отже, нашими дослідженнями встановлено, що пухлинний процес (трансплантована карцинома Герена щурів) супроводжується незначним зниженням вмісту цАМФ і підвищенням вмісту цГМФ у клітинах селезінки й тимусу, і особливо в пухлині щурів. Локальне опромінення пухлини в дозі 10 Гр призводить до ще більшого зниження цАМФ і підвищення рівню цГМФ у досліджуваних органах.

Слід зазначити, однак, що, хоча радіотерапія і сприяє пригніченню пухлинного процесу, при цьому зазнають ушкоджень здорові органи і організм у

А ЗО

£25

с

±і

І

с

Еі 6 д; -г ь

і—і—і—і— II І І II Г

цілому. Тому метою наших подальших досліджень було встановлення можливості корекції пошкоджуючої дії радіації на організм із використанням біологічно-активних препаратів.

Сьогодні ряд препаратів природного походження застосовуються в онкологічних клініках для підвищення ефективності променевої та хіміотерапії [8,6].

Отже, було цікаво провести дослідження дії біологічно-активних препаратів на молекулярному рівні, за умов злоякісного росту та променевої терапії. У попередніх дослідженнях було доведено, що застосування препаратів з антиоксидантною активністю може підвищити здатність організму протистояти пухлинному процесу [8].

Нашою лабораторією були проведені експерименти по вивченню антистресового і протипроменевого ефекту препарату АММІВІТ, який є екологічно чистий натуральний продукт, що містить всі 12 вітамінів групи В, вітамін С, основні амінокислоти і мікроелементи в оптимальних для організму співвідношеннях, що забезпечує його надзвичайно високу фізіологічну активність та антиоксидантні властивості [8]. У попередніх дослідженнях, проведених у нашій лабораторії, було встановлено, що введення АММІВІТу

піддослідним тваринам нормалізувало показники пероксидного окиснення ліпідів (рівень ТБК-

активних продуктів та активність ферментів

антиоксидантної системи СОД та каталази) за умов пухлинного процесу при опроміненні [8]. Оскільки АММІВІТ корегує променеві зміни у ліпідних компонентах мембран при злоякісному рості, нам було цікавим дослідити клітинні месенджерні каскади за цих умов.

У зв’язку з викладеним вище було важливо дослідити ключові компоненти системи циклічних нуклеотидів за умов введення препарату АММІВІТ при дії радіації (тобто за умов радіотерапії).

Б 2,5

Р селезігса и-гшуЕ іщлина

Рис. 2. Вміст цАМФ (А) та цГМФ (Б) у тканинах селезінки, тимусу, пухлини щурів до і після опромінення на фоні перорального введення препарату:

Примітки: 1) контроль, інтактні щури; 2) 8 діб після прищеплення пухлини; 3) 1 доба після опромінення;

4) 3 доби після опромінення; 5) 7 діб після опромінення.

Рселезінка Итуїмус Ипухлина

ВПЛИВ КОМПЛЕКСНОЇ РАДІОТЕРАПІЇ НА МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ ТРАНСДУКЦІЇ СИГНАЛУ

і25

Результати досліджень, що характеризують вміст циклічних нуклеотидів цАМФ та цГМФ у клітинах селезінки, тимусу і пухлини (карцинома Герена) щурів при локальному рентгенівському опромінені в дозі 10 Гр та пероральному введенні антиоксиданту АММІВІТ у дозі 30 мг/кг, наведено на рис. 2. (А), (Б).

Показано, що при введенні АММІВІТу у всіх досліджуваних органах спостерігалась однакова тенденція змін рівню цАМФ при опромінені за умов злоякісного росту. У початкові терміни після опромінення рівень цАМФ знижувався, що корелює з даними, отриманими при вивченні його вмісту за тих же умов без введення препарату (рис.1 (А)). Можна припустити, що зниження рівню цАМФ є результатом відновлення функціональної активності лімфоїдних клітин селезінки та тимусу опромінених щурів, що стимулюється введенням АММІВІТу, також це може бути проявом радіозахисних властивостей даного препарату, який є, як відомо [6], потужним антиоксидантом. Але у подальші терміни вміст цАМФ незначно підвищувався в клітинах селезінки та пухлини. Зростання рівню цАМФ у кінцеві терміни після опромінення можна розцінити як наслідок припинення стабілізуючої дії АММІВІТу в результаті зменшення його вмісту в організмі з часом, оскільки цей препарат був введений лише до опромінення. Можна також припустити, що у більш віддалені строки після дії радіації у клітинах мембран накопичувалися більш глибокі постпроменеві порушення, які призводять до пошкодження систем сигнальної трансдукції, і на цьому етапі АММІВІТ є нездатним проявити свою захисну дію. Можливо, цей препарат при радіотерапії пухлин слід вводити не лише до опромінення, а й під час і після нього, що може сприяти підвищенню ефективності його застосування.

Дослідження вмісту цГМФ у тканинах тимуса, селезінки та пухлини на фоні перорального введення препарату АММІВІТ (рис. 2. (А), (Б)) показало, що в початкові терміни дослідження він поступово зростає. Це корелює з даними щодо збільшення концентрації цГМФ у лімфоїдних клітинах селезінки і тимусу опромінених щурів з карциномою Герена (рис 1 (Б)), а також з даними літератури, згідно яким цГМФ індукує проліферацію імуннокомпетентних клітин у цих органах за умов радіотерапії, відновлюючи їх проліферативну активність, що була порушена при опроміненні, а також під час розвитку пухлини. Ці дані узгоджуються з тими, що рівень цАМФ у тканинах лімфоїдних органів за тих же умов знижувався, що також свідчить про відновлення їх функціональної активності в результаті протипроменевої дії даного препарату.

В подальшому, в досліджених тканинах вплив опромінення призводить до незначного зниження

вмісту цГМФ, що ми розцінювали як наслідок припинення стабілізуючої дії АММІВІТу.

Отже, нашими дослідженнями встановлено, що пухлинний процес (трансплантована карцинома Герена щурів) супроводжується зниженням вмісту цАМФ у початкові терміни досліджень і підвищенням вмісту на 3 і 7 добу на 10-15% порівнюючи з першою добою опромінення в усіх досліджуваних органах. Порівнюючи отримані дані з попередніми дослідними роботами, які ми провели без введення препарату „АММІВІТ” (рис. 1.(А), (Б)), можна стверджувати, що зниження вмісту цАМФ відбувається завдяки надходженню в організм цього рослинного антиоксиданту, який підвищує здатність організму протистояти пухлинному процесу. Також відбувається підвищення вмісту цГМФ, особливо на 8 добу прищеплення та на 1 добу опромінення.

ВИСНОВКИ

Дослідження вмісту вторинних посередників цАМФ та цГМФ за умов пухлинного процесу та радіотерапії на фоні введення препарату АММІВІТ показало зниження вмісту цАМФ, а також підвищенням вмісту цГМФ.

Отримані дані дають підстави стверджувати, що введення препарату в організм тварини підвищує його здатність протистояти пухлинному процесу.

Література

1. Little B. Radiation carcinogenesis // Carcinogenesis. -2000. - Vol. 21, №3. - P.397-404.

2. Boutin J. C. Tyrosine protein kinase assays // J.of Chromatogr. - 1996. - Vol.684 - P.179-199.

3. Neusholme P., Walsh D. A. A kinetic reinterpritation of the regulation of rabbit skeletal muscle phosphorylase kinase activity by Ca2+ and phosphorylation // Biochem. J. - 1992.

- Vol.283, №3. -P.845-848.

4. Nakajima T., Yukawa O. Mechanism of radiation-induced protein kinase C activation in primary cultured rat hepatocytes // J. Radiat. Res. - 1995. - Vol.36, №4. - P.34-39.

5. Srinivasan M., Edman C., Schulman H. Nuclear calcium signalling: identification and characterization of a nuclear isoform of CaM kinase // J. Cell. Biochem. - 1994. -supll. 18B. - P.228

6. Барабой В.А., Орел В.Э., Карнаух И.М. Пероксидное окисление и радиация. - К.: Наук. думка, 1991. - 256 с.

7. Западнюк И. П., Западнюк Б. В., Захария Е. A. и др. Лабораторные животные: разведение, содержание, использование в эксперименте - К.: Вища шк.., 1983.

- 383 с.

8. Гаділія О.П., Квеленкова К.І., Михайлик І.В. та ін. Визначення противірусної та інтерфероногенної активності вітамінного концентрату АММІВІТ // Вісник КУ. - 2001. - № 33. - С. 51-52.

9. Steiner, 1972. Steiner A.L., Wehmann R.E., Parker C.W., Kipnis D.N. Advances in cyclic nukleotide research -N.Y.: Raven Press, 1972. - P. 51-61.

Расцька Б.Я., Остапченко Л.1., Гавриш Л.1., Гаділія О.П.

10. Брандт З. Статистические методы анализа 11. Древаль В.И., Финаин А.В., Баранник Е.А. //

наблюдений - М.: Мир, 1975. - 312 с. Укр.биохим.журн. - 1989. - Т61, №2.- С.16-19.

ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСНОЙ РАДИОТЕРАПИИ НА МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ТРАНСДУКЦИИ СИГНАЛА

Раецкая Б.Я., Остапченко Л.И., Гавриш Л.И., Гадилия О.П.

На основании проведенных исследований было установлено, что облучение приводит к изменениям показателей молекулярных механизмов трансдукции сигнала при злокачественном росте. Было показано, что введение лечебных препаратов с антиоксидантными свойствами нормализует сигнальных систем в клетках, усиливая эффективность радиотерапии.

Ключевые слова: карцинома Герена, лучевая терапия, вторичные посредники антиоксидантные препараты.

THE INFLUENCE OF COMPLEX RADIOTHERAPY ON TRANDUCTION SIGNAL OF MOLECULAR MECHANISM

Raetska Ya.B., Ostapchenko L.I., Gavrish L.I., Gadiliya O.P.

It was established that administration of antioxidants normalizes the enhances the radiotherapy effectiveness. Other confirmation is that irradiation in therapeutic doses leads to partial normalization of abovementioned cascades functioning.

Key words: Geren carcinoma, radiotherapy, membrane-bound enzymes, antioxidant preparations.