CC BY
57Фізика живого, Т. 17, No2, 2009. С.143-147.
© РаєцькаЯ.Б., Остапченко Л.І., Дробінська О. В., Гавриш Л.І., Строцька Є.А., Торгало Є. О.
УДК 577.152.25
ДОСЛІДЖЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ АНТИОКСИДАНТНОЇ СИСТЕМИ ТА СИГНАЛЬНОЇ СИСТЕМИ ЦИКЛІЧНИХ НУКЛЕОТИДІВ ЗА УМОВ ЗЛОЯКІСНОГО РОСТУ І ПРОМЕНЕВОЇ ТЕРАПІЇ
Раєцька Я.Б., Остапченко Л.І., Дробінська О. В., Гавриш Л.І., Строцька Є.А., Торгало Є.О.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, e-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 07.05.2009
Стаття присвячена дослідженням ключових компонентів трансдукції сигналу та особливостям процесів вільнорадикального окислення ліпідів в умовах злоякісного росту карциноми Герена при локальній терапії. На основі проведених досліджень було встановлено, що опромінення приводить до змін показників пероксидного окислення ліпідів і молекулярних механізмів трансдукції сигналу при злоякісному рості. Порушення процесів пероксидації в результаті опромінення супроводжувались змінами активності аденілатциклаз и гуанілатциклаз. Змінювався вміст циклічного аденозинмонофосфату і циклічного гуанозинмонофосфату, що було обумовлено пострадіаційними змінами активності ферментів синтезу досліджуваних циклічних нуклеотидів.
Ключевые слова: карцинома Герена, променева терапія, мембраннозв’язанні ферменти, процеси вільнорадикального окислення ліпідів.
ВСТУП
Онкологічні захворювання серед населення різних країн досягли загрозливого рівня. В Україні така тенденція прискорюється активними чинниками забрудненого довкілля, зокрема, внаслідок аварії на ЧАЕС. Вибір вірної стратегії лікування та розробка його нових способів потребує розуміння молекулярних механізмів виникнення злоякісних новоутворень, з’ясування яких є актуальною проблемою фундаментальної біології.
Променева терапія є одним із засобів радикального лікування злоякісних новоутворень, поряд із хірургічним і хіміотерапевтичним лікуванням. Локальний вплив іонізуючої радіації на пухлину в період експотенційного росту обумовлює загибель її клітин за механізмами некрозу й апоптозу [1]. Одночасно променева терапія призводить до появи в організмі додаткових ініціаторів ліпопероксидації. Від цього в тій чи іншій мірі страждають здорові органи й системи організму, знижується їх загальна й протипухлинна резистентність, що полегшує розвиток рецидивів і метастазів пухлини [2]. Під час неопластичної трансформації клітин спостерігається накопичення великої кількості онкогенних продуктів, які є нормальними або спотвореними елементами сигнальних систем
ростових факторів. Різноманітні ростові фактори, у свою чергу, виконують функцію регуляції росту, диференціювання й імунної відповіді лімфоїдних клітин. У складний і багатоступеневий процес неопластичної трансформації залучено численні механізми, що включають порушення експресії певних генів, аномальну продукцію цитокінів, гіперекспресію їх рецепторів, спотворення передачі регуляторних сигналів від специфічних рецепторів плазматичної мембрани до ядра клітини. До таких механізмів слід віднести ряд внутрішньоклітинних сигнальних систем, ключовими ланками яких є протеїнкінази. Їх активність може змінюватись під впливом різних онкогенних факторів [3]. Клітини в стаціонарному динамічному стані потребує нормального функціонування її ферментних систем, зокрема, тих, що приймають участь у трансдукції сигналів. Серед них особливе значення має месенджерний каскад, вторинними посередниками в якому є циклічні нуклеотиди (цАМФ, цГМФ). Зміни внутрішньоклітинної концентрації цАМФ і цГМФ призводять як до гальмування, так і до активації метаболізму та диференціювання клітини, що залежить від фази клітинного циклу, тривалості й кінетики змін концентрацій циклічних АМФ і ГМФ [4]. Особливого значення набувають дослідження активності мембранозв’язаних
ферментів та особливостей процесів їх
Раєцька Я.Б., Остапченко Л.І., Дробінська О. В., Гавриш Л.І., Строцька Є.А., Торгало Є.О.
вільнорадикального окиснення ліпідів (ВРОЛ), що обумовлюють цілісність структури та нормальне функціонування мембран у клітинах. Відомо що, утворення різноманітних продуктів реакцій перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), може гальмувати проліферативну активність клітин, тоді як зниження концентрації вільних радикалів призводить до прискорення поділу клітин. Інгібітори вільнорадикальних реакцій -антиоксиданти відіграють значну роль у регуляції каскаду реакцій ПОЛ.
Проте сучасний рівень знань щодо молекулярних механізмів трансдукції сигналів у клітинах різного походження за умов злоякісного росту та променевої терапії для з’ясування їх ролі в цих процесах недостатні, виникає необхідність подальших досліджень у даному напрямку.
Метою даної роботи було з’ясування молекулярних механізмів трансдукції сигналів у клітинах різного походження при розвитку карциноми Герена, локальному рентгенівському опроміненні тварин у терапевтичних дозах.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
В дослідах використовували білих лабораторних щурів-самців масою 13 0± 10 г, (розведення віварію УНДІОР), яких утримували на стандартному раціоні віварію.
Тваринам трансплантували карциному Герена шляхом підшкірної ін’ єкції у ділянку стегна задньої кінцівки 20%-ної суспензії пухлинних клітин на
0,9%-му розчині NaCI, отриманих від щура-донора за методикою [5,6].
При дослідженні ПОЛ та молекулярних механізмів трансдукції сигналу пухлину на 8-му добу після прищеплення піддавали локальному рентгенівському опроміненню в терапевтичних дозах на апараті РУМ-17 за таких умов: напруга -180 кВ, сила струму - 10 мА, фільтри - 0,5 мм Cu +1,0 мм Al, потужність дози - 123 Р/хв, шкірно-фокусна відстань - 25 см. Тварин декапітували через 1, 3 та 7 діб після локального опромінення.
Вміст ТБК-активних продуктів ПОЛ у плазмі крові та тканинах визначали за методом [6]. Активність СОД визначали використовуючи метод [7], що базується на здатності ферменту конкурувати з НСТ за супероксидні аніони, які утворюються в результаті аеробної взаємодії НАДН і ФМС. Активність каталази у плазмі крові та тканинах щурів визначали як рекомендовано в роботі [8], що базується на здатності перекису водню утворювати із солями молібдену стійкий забарвлений комплекс. Активність ФДЕ визначали в цитозольній фракції клітин, яку отримували, використовуючи рекомендації [9].
Активність ФДЕ визначали використовуючи методом тонкошарової хроматографії на пластинках 8ііийзі [10]. Активність ГЦ визначали за методом послідовної хроматографії на колонках А12О3 і Dawex, використовуючи рекомендації [11]. Визначення активності АЦ проводили як рекомендовано в роботі [12].
Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами статистики [13].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Останнім часом лікування злоякісних новоутворень ґрунтується на індивідуальному підході щодо вибору заходів. Радіотерапія залишається одним із головних методів лікування злоякісних новоутворень, поряд із хірургічним і хіміотерапевтичним лікуванням.
Існує ціла низка робіт, щодо перебігу біохімічних процесів при злоякісному рості та за умов радіотерапії, але ті механізми, що функціонують у процесах передачі сигналів у клітині, залишаються мало дослідженими.
Було досліджено ключові компоненти ПОЛ та активність антиоксидантних ферментів у клітинах головного мозку, печінки, селезінки, тимусу, пухлини та у плазмі крові щурів у різні терміни після опромінення пухлини в дозі 25 Гр. Значне зростання інтенсивності ПОЛ у тканинах головного мозку, печінки, селезінки й крові щурів спостерігалося безпосередньо після локального опромінення пухлини (таблиця 1).
Отже, на початковому етапі злоякісний процес викликає закономірне підвищення вмісту ТБК-активних продуктів ПОЛ при злоякісному рості. В останні терміни досліджень відбувалося значне зниження ТБК-активних продуктів у пухлині, органах і плазмі крові. Досить високий рівень ТБК-активних продуктів у пухлині, який був виявлений нами на 15 хв після локального рентгенівського опромінення, на 7-му добу знижувався у 3,7 рази. Зниження рівня ТБК-активних продуктів ПОЛ в органах і крові щурів може бути викликане зменшенням вмісту ліпідів та інших його субстратів, внаслідок їх утилізації пухлиною, що росте.
Було встановлено, що в пухлинній тканині опромінення викликає істотне підсилення ліпопероксидації, що є проявом деструктивної дії антиоксидантних ферментів та променевої терапії.
Активність СОД та каталази знижувалась особливо у віддалені терміни після дії радіації (таблиця 2).
Отримані дані свідчать про те, що механізми антиоксидантного захисту спрямовані на знешкодження продуктів перекисного окиснення в умовах пухлинного процесу. Можна припустити,
Таблиця 1.
Вміст ТБК-активних продуктів (нмоль/мг білка) у селезінці та пухлині щурів із карциномою Герена
після локального рентгенівського опромінення ___________________________________________(М ± т; п=6)______________________________________
№ п/п Групи тварин, умови досліду Термін досліджень після локального рентгенівського опромінення
І5 хв І доба З доби Т діб
Селезінка
І Інтактні щури 77,9+1,3
2 КГ (контроль) 576,0+7,4* 286,5+4,2* 267,3+2,8* 213,3+2*
З КГ + ЛРО 318,9+5,6* 273,7+3,9 23 і,8+4,3 142,6+2*
Пухлина
І КГ (контроль) 169,2+3,4 148,4+2,3 69,0+1,1 46,1+3,3
2 КГ + ЛРО 200,5+3,5 329,5+4,і 101,84+1,9 216,2+3,4
Примітки (тут і далі): 1. * - вірогідні зміни порівняно з інтактними тваринами (р<0,05); 2. КГ - карцинома Герена; 3. ЛРО - локальне рентгенівське опромінення
Таблиця 2
Активність супероксиддисмутази (ум. од./мг білка) та каталази (нмоль/хв-мг білка) в селезінці та пухлині
№ п/п Групи тварин, умови досліду Термін досліджень після локального рентгенівського опромінення
І5 хв І доба З доби Т діб
Активність супероксиддисмутази
Селезінка
І Інтактні щури 1,20+0,01
2 КГ (контроль) 0,55+0,2* 0,62+0,02* 0,9+0,02* 0,54+0,1*
З КГ + ЛРО 0,47+0,1* 0,5 і+0,0і* 0,89+0,1* 0,38+0,1*
Пухлина
І КГ (контроль) 0,48+0, і 0,51+0,02 і,4+0,04 0,83+0,1
2 КГ + ЛРО 1,01+0,2 0,94+0,05 1,1+0,02 0,80+0,1
Активність каталази
Селезінка
І Інтактні щури 174,27+2,81
2 КГ (контроль) 77,1+1* 154,5+2,5* 83,1+2,4* 35,01+1*
З КГ + ЛРО 94,2+0,9* 124,6+3,7* 64,1+1,1* 43,34+1*
Пухлина
І КГ (контроль) 141,3+2,7 188,64+3,8 76,6+2,4 53,2+2,1
2 КГ + ЛРО 121,77+1,9 і5 і,3 і+3,8 70,9+1,7 35,1+2,1
Таблиця 3.
Активність аденілатциклази, гуанілатциклази та фосфодіестераз цГМФ і цАМФ [пмоль/хв-мг білка] у тканинах селезінки, тимусу, пухлини щурів до і після опромінення пухлини (М±т; п=3-5)______________
Орган Експериментальний стан АЦ ГЦ ФДЕ
цАМФ цГМФ
Селезінка контроль (інтактні щури) 24,1 і 3,8 1,6 і 0,2 334,0 і 31,6 0,68 і 0,2
8 доб. після прищеплення 28,1і 2,5 1,8 і 0,3 240 і 16,5* 0,4 і 0,2
1 доб. після опромінення 12,6і 2,1 2,3 і 0,3* 280 і 16,4* 0,38 і 0,2
3 доб. після опромінення 14,1і 3,2 2,2 і 0,2 260 і 15,0* 0,42 і 0,3
7 доб. після опромінення 21,0і 2,3* 1,9 і 0,4 290 і 20,5 0,73 і 0,3
Пухлина контроль (інтактні щури) 12,1 і 2,6 0,8 і 0,1 218 і 12,1 1,44 і 0,5
8 доб. після прищеплення 8,4 і 2,3* 0,98 і0,15 220 і 12,8 0,9 і 0,2*
1 доб. після опромінення 6,8 і 2,1 2,25 і 0,2* 205 і 10,1 1,15 і 0,3
3 доб. після опромінення 5,8 і 1,8 2,8 і 0,2* 295 і 15,8* 1,1 і 0,2
7 доб. після опромінення 5,6 і 2,1 2,95 і 0,2 201 і 10,1* 0,85 і 0,2
Раєцька Я.Б., Остапченко Л.І., Дробінська О. В., Гавриш Л.І., Строцька Є.А., Торгало Є.О.
що зростання активності ферментів антиоксидантної системи, яке співпадає з періодом підвищеної інтенсивності ПОЛ, відбувається завдяки вмиканню адаптивно-компенсаторних механізмів захисту та підтримання фізіологічного гомеостазу щурів. Радіоіндуковане пошкодження білків-рецепторів може стосуватися трансдукції сигналів від мембрани через різні клітинні месенджерні каскади. Тому ми дослідили ключові компоненти клітинних сигнальних систем в імунних органах щурів за умов пухлинного процесу при опроміненні.
З літератури відомо, що інтенсивність вільнорадикальних процесів ПОЛ взаємозв’язана із станом фосфоліпідів біомембран, і має надзвичайно важливе значення для регуляторної й інформаційної ролі мембран [14].
Фізико-хімічний стан ліпідів мембран -залежить від складу, рівня ПОЛ, в’язкості та ін., істотно впливає на функціонування мембранно-зв’язаних ферментів, зокрема, аденілатциклази [15].
Аденілат - та гуанілатциклази, а також ФДЕ цГМФ та цАМФ є ключовими ферментами сигнальної системи циклічних нуклеотидів. Порушення їх функціонування впливає на розвиток патологічних процесів. Показано, що зміни рівня ПОЛ при опроміненні супроводжувались зміною активності ферментів синтезу (зниження активності АЦ та підвищення активності ГЦ), та гідролізу (ФДЕ) циклічних нуклеотидів. Показано дворазове зменшення активності АЦ у селезінці, тимусі та пухлині порівняно з контролем як за умов розвитку патології, так і на фоні опромінення. Активність ГЦ збільшувалась у всі терміни після опромінення (таблиця 3).
Зміни активності ФДЕ цАМФ у досліджуваних органах мали різноспрямований характер: так, у початкові терміни досліджень в усіх органах активність ферменту понижувалась порівняно з контрольними значеннями, в кінцеві терміни після опромінення активність ФДЕ цАМФ незначно підвищувалась у лімфоїдних та пухлинних клітинах. Активність ФДЕ цГМФ у селезінці і тимусі зменшувалась незначно, здебільшого на 3-тю і 7-му добу після опромінення.
ВИСНОВКИ
Отже, радіотерапія на певному етапі динаміки розвитку пухлин приводить до нормалізації біохімічних показників клітинного метаболізму. Кількісні зміни активності ферментів синтезу й гідролізу і тих, що каталізують завершені етапи проходження сигналів, засвідчують участь
регуляторних систем у формуванні адаптаційних реакцій на пошкоджуючий вплив злоякісного росту та радіації. Отриманні результати можуть бути використані для діагностики злоякісних та доброякісних новоутворень.
Література
1. Timmerman RD et al.// Stereotactic body radiation therapy in multiple organ sites./ J Clin Oncol.- 2007.-Vol.25.- Р.947-952
2. Nyman J et al. //Stereotactic hypofractionated radiotherapy for stage I non-small cell lung cancer-mature results for medically inoperable patients./ Lung Cancer. -2006.- Vol.51.- Р. 97-103
3. Burke F., Balkwill F.R., Kossodo S. Cytokines and cancer // Cytokines in Health and Disease. - 2-nd ed. New York: Marcel Dekker, Inc. -1997. - P.169-185.
4. Boutin J. C. Tyrosine protein kinase assays // J.of Chromatogr. - 1996. - Vol.684 - P.179-199.
5. Западнюк И.П., Западнюк Б.В., Захария Е.А. и др. Лабораторные животные: разведение, содержание, использование в эксперименте - К.: Вища шк. -1983. - 383с
6. Барабой В.А., Орел В.Э., Карнаух И.М. Перекисное окисление и радиация. К.: Наук. Думка. -1991. 256 с.
7. Поберезкин Н.Б., Осинская Л.Ф. Биологическая роль супероксиддисмутазы // Укр. биох. журн. -1989. - T.61, № 2. - С.14.
8. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Т.,
Токарев В.Е. // Лаб. дело. - 1988. № 1.- С.16-19.
9. Древаль В.И., Финаин А.В., Баранник Е.А.
//Укр.биохим.журн. - 1989. - Т.61, №2. - С.16-19.
10. Лазаревич В.Г., Меньшиков М.Ю., Ткачук В.А.. Характеристика двух форм фосфодиэстераз циклических нуклеотидов и Са2+-зависемого белкового регулятора в скелетны мышцах кролика // Биохимия. - 1979. - №10 - С.1842-1852.
11. Nakasava A., Sano M., Saito T. Subcellucal distribution
and properties of guanilate cyclase in rat cerebellum // Biochim. et biofis. Acta. - 1976.-Vol.444, №2.
- Р. 563-570.
12. White A., Zenser T. Saparation of cyclic
3’,5’-nucleoside monophosphates from other nucleotides on aluminum oxide colums. Application to the assay of adenyl cyclase and guanyl cyclase // Anal. Biochem.- 1974.- Vol.41, № 2. - Р.372-396.
13. Кучеренко М.Е., Бабенюк Ю.Д. Васильєв О.М. та ін. Біохімія: Підручник. - К.: ВПЦ “ Київський університет”, 2002. - 480 с.
14. Бурлакова Е.Б., Алесенко А.В., Молочкина Е.М. и др. Биоантиоксиданты в лучевом пopaжении и злокачественном poare. - М.: Наука. - 1975. - 211 с.
15. Timmerman R et al. //Excessive toxicity when treating central tumors in a phase II study of stereotactic body radiation therapy for medically inoperable early-stage lung cancer./ J Clin Oncol. - 2006. - Vol. 24
- Р.4833-4839.
ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ И СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ЦИКЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ ПРИ УСЛОВИЯХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО РОСТА И ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ
Раецкая Я.Б., Остапченко Л.И., Дробинская А.В., Гавриш Л.И., Строцкая Е.А., Торгало Е.А.
Статья посвящена исследованиям ключевых компонентов трансдукции сигнала и особенностям процессов свободнорадикального окисления липидов в условиях злокачественного роста карциномы Герена и лучевой терапии. На основании проведенных исследований было установлено, что облучение приводит к изменениям показателей пероксидного окисления липидов и молекулярных механизмов трансдукции сигнала при злокачественном росте. Нарушение процессов пероксидации в результате облучения сопровождалось изменением активности аденилатциклаз и гуанилатциклаз. Изменялось содержания циклического аденозинмонофосфата и циклического гуанозинмонофосфата, что было обусловлено пострадиационными изменениями активности ферментов синтеза исследуемых циклических нуклеотидов.
Ключові слова: карцинома Герена, лучевая терапия, мембранносвязанные ферменты, процессы
свободнорадикального окисления липидов.
ACTIVITY OF ANTIOXIDANT ENZYMES AND KEY ENZYMES OF CYCLIC NUCLEOTIDE SIGNAL SYSTEM UNDER MALIGNANT GROWTH AND RADIOTHERAPY CONDITIONS
Raetska Ya. B., Ostapchenko L.I., Drobinska O.V., Gavrish L.I., Strotska E. A., Torgalo E.A.
The peroxidation processes and activities of some membrane-bound enzymes in rat tissues under cancerous growth conditions were established. It was shown that irradiation of rats with Geren carcinoma by therapeutic doses of x-rays improved cell metabolic processes in tumor and organs. The irradiation impaired peroxidation processes and antioxidant enzymes activities. Signal systems functioning were normalized by irradiation during initial stage of investigations. It was established that lipid peroxidation processes were normalized by antioxidants administration. Other confirmation is that irradiation in therapeutic doses leads to partial normalization of abovementioned cascades functioning.
Key words: Geren carcinoma, radiotherapy, membrane-bound enzymes, free-radical lipid oxidation processes.
